小鼠胚胎心动脉囊的发生发育

目的:探讨小鼠胚胎动脉囊的发生发育及其与第二生心区的关系。方法:对胚龄9~13 d(ED9~13)小鼠头胸部切片做HE和免疫组织化学PAP法染色。结果:ED10,动脉囊出现于心流出道远端,管壁主要由胰岛素增强子结合蛋白-1(ISL1)阳性内皮和间充质细胞构成,可见第二生心区、原始咽腹侧壁内胚层的ISL1阳性细胞增生并迁移至动脉囊壁。ED11~12,心动脉端向尾端移位、心包腔向头端及背侧扩展及ISL1阳性细胞的添加使动脉囊大部降入心包腔。ED12~13,含有ISL1阳性细胞的主肺动脉隔与流出道嵴愈合,将心包内动脉囊分隔为升主动脉和肺动脉干;动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为大动脉相邻及游离壁的平滑肌细胞。结论:小鼠胚胎动脉囊是第二生心区细胞添加在流出道远端形成的。动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为流出道心肌和主肺动脉干的平滑肌。     

小鼠胚胎流出道嵴内α-SMA阳性细胞的命运

目的观察小鼠胚胎心脏流出道分隔、重塑过程中流出道嵴内α-SMA阳性细胞的功能与转归。方法用抗α-SCA、抗α-SMA单克隆抗体及TUNEL凋亡染色法对胚龄11—16d小鼠胚胎心脏连续切片进行染色。结果胚龄11—12d，流出道远端分隔过程中，未见细胞凋亡发生。胚龄13—16d，随流出道间充质隔的形成与心肌化，α-SMA阳性细胞聚集形成高度特征性漩涡状结构，并可见细胞凋亡现象。结论不同部位的流出道嵴α-SMA阳性间充质细胞的命运转归不同，其主要功能可能是参与形成升主动脉和肺动脉干相邻壁，并参与流出道间充质隔的心肌化。     

胚胎中胚层间充质细胞参与小鼠胚胎原始心管的形成

目的 探讨小鼠胚胎早期原始心管发育. 方法 对胎龄7.5-9 d小鼠胚胎心脏进行石蜡连续切片,连续切片进行HE染色,并用抗转录因子GATA4和抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫组织化学染色. 结果 头端中胚层间充质细胞与小鼠胚胎原始心管及心包腔脏壁中胚层相延续;心肌早期分化标志蛋白转录因子GATA4和α-SMA在原始心管部位高表达. 结论 位于神经沟和原肠之间的胚胎中胚层间充质细胞参与原始心管和心包腔脏壁中胚层的形成;原始心管和心包腔脏壁中胚层细胞的迁移和分化机制不同.     

小鼠肾发育中集合管细胞的超微结构变化及AQP-的表达

 目的 观察小鼠肾发育过程中集合管细胞的超微结构变化及水通道蛋白4（AQP-4）的表达,探讨AQP-4与小鼠肾集合管细胞发育的关系及作用。方法 应用透射电镜、免疫组织化学、免疫印迹技术,并结合体视学方法观察并检测胚龄14,16,18 d 胎鼠及生后1,3,7,14,21,42 d仔鼠肾发育过程中集合管细胞的超微结构变化及AQP-4的表达。结果 小鼠胚龄18 d可见发育早期的主细胞。生后7~21d,主细胞形态结构发育基本完善。A型闰细胞在胚胎18 d出现,B型闰细胞生后21 d出现。AQP-4于胚龄14 d表达在集合管细胞的基底膜和侧膜,随着胚龄的增加表达逐渐增强,于生后1 d达到高峰。结论 集合管细胞在胚胎时期出现,但其形态结构在生后才逐渐完善。AQP- 4对胚胎期小鼠肾脏水平衡的调节起了重要的作用,而在生后只起辅助性作用。     

Sonic Hedgehog信号通路在大鼠牙髓炎中的作用

目的:观察Sonic Hedgehog(Shh)信号分子在大鼠牙髓炎中的免疫定位,探讨Shh信号通路在牙髓防御和修复中所起的作用。方法:将15只SD大鼠随机分成1d、3d和7d组,每组5只,用穿髓开放法建立大鼠牙髓炎模型,3组大鼠分别于术后1,3,7d处死,取出下颌磨牙,常规组织学处理,免疫组化方法检测Shh,Smo,Ptc,Gli1的表达,并对Shh信号通路在大鼠牙髓炎中的表达进行半定量分析,对照组为大鼠正常牙髓。结果:大鼠牙髓炎模型1,3,7dShh广泛表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞及远离穿髓孔的根髓细胞中,表达量随炎症的进展无显著性提高(P>0.05)。Ptc、Smo、Gli1在大鼠牙髓损伤后1d未见阳性表达,3d和7d均表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞中,且表达量均有显著性提高(P<0.05)。空白对照组中Shh信号通路阴性表达。结论:Shh信号通路在牙髓炎过程中表达,提示其可能被激活,参与牙髓炎症反应。     

鸡胚咽囊发生的扫描电镜观察

目的：了解咽囊发生和衍变过程中的基本规律，探讨内、外胚层与间充质在咽囊发生过程中的相互关系和作用．方法：通过显微解剖术和扫描电子显微镜直接地系统观察早期鸡胚（Ｓｔａｇｅ１０￣２０）的咽和咽囊。结果：咽壁内胚层的生长、弓动脉发育并隆入咽内，是咽囊发生的主要原因；鳃裂的形成与内、外胚层生长融合有关；间充质继发性增生填充，参与形成相应的鳃弓。结论：咽囊的发生是上皮性胚胎组织不均衡生长的结果。     

Axin2、Wnt5a以及Shh基因在小鼠磨牙胚帽状期中的表达

目的研究Axin2、Wnt5a以及Shh基因在小鼠下颌第一磨牙发育帽状期的表达,初步探讨Wnt与Shh信号通路在牙胚发育中的作用。方法制备小鼠下颌第一磨牙胚帽状期标本,用H-E染色组织学观察磨牙胚帽状期的特点,同时用原位杂交检测Axin2、Wnt5a以及Shh基因的表达部位及强度。结果光镜下可看到磨牙胚帽状期的典型釉结节,周围牙胚间充质细胞聚集,Axin2与Shh基因主要表达于釉结节,而Wnt5a基因主要表达于牙胚间充质。结论经典和非经典的Wnt信号系统以及Shh信号系统在牙胚发育帽状期有各自的表达特点,提示它们可能在牙胚形态发生的调控起着重要的作用。     

sonic hedgehog及patched基因在角化囊肿中的表达

目的:了解Shh(Sonic hedgehog),Bmp-4,Ptc(patched)基因在角化囊肿中的表达情况,明确Shh及其相关基因在角化囊肿发病中的作用.方法:选取角化囊肿石蜡切片.将Shh,Bmp-4,Ptc分别转染与大肠杆菌XL-1-Blue,提质粒,线性化质粒,体外转录法合成地高辛标记的RNA探针,原位杂交检测角化囊肿中Shh,Bmp-4,Ptc的表达情况.结果:Shh,Bmp-4共同表达于角化囊肿上皮细胞,胞浆呈强阳性表达;Ptc表达于角化囊肿间充质细胞,胞浆表达较弱.结论:Shh,Bmp-4,Ptc在角化囊肿中都有异常表达,提示(1)角化囊肿的发生与生长发育中的上皮残余有关;(2)Shh与Ptc之间平衡的破坏是发生角化囊肿的条件之一;(3) 角化囊肿与正常生长发育相似,存在Bmp-4与Shh协同表达.     

小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL／6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用Dispase酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。     

右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞Hedgehog信号通路影响

目的:探究右归丸治疗骨质疏松症的疗效机制是否与激活Hedgehog信号通路,促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化有关,从而为右归丸预防治疗骨质疏松提供依据。方法:体外分离培养大鼠BMSCs,将SPF级大鼠随机分为4组,正常组、诱导液组、福善美组、右归丸组,对大鼠进行灌胃5 d。制备含药血清,并观察上述4组含药血清对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞中的音猬因子(Ssonic hedgehog,Shh)、12次跨膜蛋白(Ptched,Ptc)、Gli家族锌指蛋白-1(Gli family zinc finger-1,Gli-1)。结果:与正常组和阳性药物组及诱导液组相比,右归丸组的蛋白表达水平明显上升。结论:①Hedgehog信号通路的Shh、Ptc、Gli1的变化可能引起骨质疏松症;②右归丸可以诱导BMSCs内Shh、Ptc、Gli1蛋白的表达;③右归丸能够有效治疗骨质疏松,这种作用可能通过Hedgehog信号通路来实现。     

小鼠肾发育中Slit2 及其受体Robo1 的表达

目的 观察并检测Slit2 及其受体Robo1 在小鼠肾发育中的表达变化。方法 通过免疫组织化学技 术系统观察小鼠肾脏Slit2 和Robo1 的表达和定位;应用蛋白印迹技术检测小鼠肾脏Slit2 和Robo1 表达的变 化规律。结果 Slit2 和Robo1 在胚龄12 d 小鼠肾脏生肾区开始表达;Slit2 在小鼠输尿管芽及其周围的间充质 聚集的部位阳性表达,Robo1 在小鼠肾脏生肾区广泛表达,主要分布于生后肾组织和输尿管芽上皮细胞基底 面;在肾单位发育过程中,Slit2 定位表达于逗号小体阶段和S 小体阶段,且表达较强,在Ⅲ期肾小体阶段、Ⅳ 期肾小体阶段及成熟肾小体阶段有微弱表达;Robo1 定位表达于逗号小体阶段、S 小体阶段、Ⅲ和Ⅳ期肾小 体阶段,且表达较强,在成熟肾小体阶段有微弱表达;Slit2 及其受体Robo1 在肾脏泌尿小管如近端小管、远 端小管及集合管发育过程中均有表达。蛋白印迹检测从小鼠胚龄14 d 开始,Slit2 表达先递增,至胚龄16 d 达 峰值,而后逐渐递减。Robo1 表达从小鼠胚龄14 d 开始逐渐递减。结论 Slit2 及其受体Robo1 参与肾输尿管 芽的萌出、输尿管芽与生后肾组织的诱导、肾小体发育及泌尿小管发育和成熟过程。     

兔胚胎干细胞的早期培养条件初步研究

目的探索小鼠胚胎内胚层细胞和鸡胚提取物（CEE）对兔胚胎干细胞早期培养的影响。方法用全新的方法对兔胚胎干细胞的建系条件进行探讨。将分离到的囊胚期内细胞团接种到丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎内胚层细胞饲养层和几种不同的培养液构成的培养体系中,观察内细胞团的贴壁和生长状况,并对由内细胞团生长出的具有胚胎干细胞形态的细胞集落进行传代。结果以灭活的小鼠胚胎内胚层细胞作为饲养层,以78％D-MEM／F-12＋20％Knockout SR＋2mmol／L L—Glutamine＋1％MEM NAA＋O．1mmol／L β-mercaptoethanol＋8ng／ml hrbFOF＋2％CEE做培养液,兔内细胞团可以很好的贴壁,生长成具有标准的胚胎干细胞（ESC）形态的细胞集落。结论小鼠内胚层细胞和CEE联合使用可以很好的支持原代兔胚胎干细胞（RESC）的生长,小鼠内胚层细胞和CEE中可能含有某些抑制RESC分化的因子。     

人胚胎干细胞系的初步建立

目的：探讨人受精卵建立人胚胎干细胞系。方法：将体外受精获得的人受精卵发育至胚胎泡期,用机械法去除胚泡透明带后,取出内细胞团,分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,进行传代培养。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷（SCD）小鼠体内畸胎瘤形成实验,对连续传代的细胞进行鉴定。结果：9枚受精卵在体外培养5-7d后,5个存活并发育为胚泡,取出的内细胞团经接种培养,3个内细胞团存活,呈克隆性生长,发育为胚胎干细胞,并连续体外传代7个月保持未分化状态,建系成功。3个细胞系分别命名为CHE1、CHE3和CHE3。取3个细胞系第5、15和30代的细胞进行碱性磷酸酶染色,均为阳性。对CHE3第25、30、40代、CHE1和CHE2第21、22、30代的细胞检测人胚胎干细胞表面标志SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和GCTM-2,结果均为阳性;检测小鼠胚胎干细胞表面标志SSEA-1,结果为阴性。染色体核型分析为二倍体核型。将连续传代5个月后（30代左右）的3个细胞系接种到SCID小鼠体内,6周后均形成畸胎瘤,组织病理学检查显示含有3个胚层的组织结构。结论：使用5个人受精卵来源的胚泡,成功地在体外建立了3个胚胎干细胞系,长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。     

RCS大鼠自然病程中视网膜边缘生发区细胞增殖及Shh/Ptc信号途径改变的观察

目的 观察遗传性视网膜色素变性RCS大鼠病程发展中视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径改变及其与该区细胞增殖能力变化的关系.方法 RCS大鼠按出生后病程变化分为15、30、60、90 d 4组(免疫组化每组4只,PCR每组3只),以同龄含色素的正常大鼠(Long-Evan's 大鼠)作为正常对照.视网膜组织切片DAPI荧光染色观察外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度的变化;视网膜细胞增殖标记Ki67免疫荧光染色观察视网膜边缘生发区细胞增殖能力的变化;荧光定量PCR检测视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径中关键分子Shh、Ptc1、Smo和Gli1 mRNA表达水平.结果 ①RCS大鼠从第15天开始,随着年龄的增加视网膜ONL逐渐变薄,第90天ONL几乎消失.②正常对照组大鼠视网膜边缘生发区Ki67阳性细胞较少,与同龄正常对照组大鼠相比,出生30、60 d组大鼠Ki67阳性细胞数均显著增多(P＜0.05);大鼠各年龄组间比较,60 d组Ki67阳性细胞数明显增多(P＜0.01).③60 d组大鼠视网膜边缘生发区Shh、Ptc1、Smo和Gli1mRNA表达水平明显上调.结论 出生后60 d RCS大鼠视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径的激活,可能刺激了该部位细胞短期的增殖.     

Calbindin—D28k在胚胎期小鼠肾组织的表达

目的 观察Calbindin-D28k在胚胎发育不同时期小鼠肾组织中的表达规律,探讨Calbindin-D28k在胚胎小鼠肾发育中的作用.方法 应用免疫荧光技术及蛋白印迹技术(Western blotting)对胚龄10、12、14、16、18 d小鼠肾组织中Calbindin-D28k的表达进行定性观察和半定量分析.结果 Calbindin-D28k在胚龄12 d胎鼠肾输尿管芽开始微弱表达,之后随胚龄增加其表达量逐渐增加.胚龄12 d在输尿管芽表达;胚龄14 d在输尿管芽Y型分支表达;胚龄16 d在榆尿管芽壶腹表达,且在S小体与输尿管芽壶腹连接处有少量表述;胚龄18 d定位于连接小管、皮质集合管上皮细胞胞浆内.结论 推测Calbindin-D28k可能对胚胎小鼠肾集合管系的发育有一定作用.     

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的:探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的方法.方法:以鼠间充质干细胞作为饲养层,收集受孕3.5～4 d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化细胞集落,使其稳定传代后,采用光镜,碱性磷酸酶染色及Oct-4染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定.结果:以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,末分化的Es细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;Oct-4染色阳性.结论:以间充质下细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态.     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞，制成饲养层，用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好，增殖快，易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好，当培养4~5 d时，其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后，各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

Sonic hedgehong信号通路对AGM区来源的成血-血管细胞增殖、迁移和分化作用

为探讨Sonic hedgehong（Shh）信号通路对小鼠主动脉-中肾-肾上腺（AGM）区来源的成血-血管细胞增殖、分化和迁移的影响，联合应用抗小鼠CD34、Flkl单克隆抗体（单抗）的磁珠，从孕11d BALB/c鼠胚胎AGM区分离培养成血一血管干细胞，并同时培养AGM区来源基质细胞，用流式细胞术对所分离细胞进行表型鉴定。用免疫组织化学法检测基质细胞表达Shh蛋白的情况；