基于形态学和多基因位点鉴定甘肃秦艽斑枯病菌

目的:旨在明确甘肃省栽培秦艽斑枯病病原菌分类地位及其生物学特性,为该病的防控提供一定的理论依据。方法:通过形态学和分子生物学方法相结合确定病原分类地位,利用常规植物病原学培养的方法测定病原菌生物学特性。结果:秦艽斑枯病菌分生孢子器近球形、扁球形、黑褐色,55.3~125.8μm×51.7~115.3μm(平均83.3μm×83.2μm);分生孢子细镰刀形、披针形,具1~5个隔膜,多为3个,大小18.8~30.6μm×2.4~3.5μm(平均23.5μm×3.2μm)。通过ITS、LSU、RBP2和β-tubline多基因位点构建系统发育树,将秦艽斑枯病病原菌鉴定为龙胆壳针孢Septoria gentianae Thüm.。该菌菌丝生长、分生孢子萌发和产孢的温度范围分别为0~35℃、5~30℃和15~25℃,最适温度分别为20~25、20和15℃;连续光照有利于菌丝生长,连续黑暗有利于孢子萌发和病菌产孢;此菌在相对湿度75%以上时均可萌发,以水中萌发最好;菌丝生长、分生孢子萌发和产孢的适宜p H范围分别为4.0~10.0、4.51~9.19和5.0~8.0,最适p H为6.0、6.49和6.5;土壤浸渍液以及秦艽叶或根浸渍液对孢子萌发有较强的促进作用。结论:秦艽斑枯病是秦艽生长中的主要病害,在栽培过程中应注意药剂防治。     

云南粗茎秦艽斑枯病病原鉴定

目的:明确云南种植的粗茎秦艽斑枯病的发生规律及病原菌的分类地位,以期为该病的防治提供依据。方法:通过田间调查掌握该病发生的基本规律,经组织分离、柯赫氏法则验证获得病原菌,依据真菌的形态特征和ITS序列特征确定其分类地位。结果:基于真菌形态和ITS序列特征,粗茎秦艽斑枯病病原被鉴定为小孢壳针孢Septoria microspora,该病在云南粗茎秦艽主要种植区普遍发生。结论:小孢壳针孢Septoria microspora是粗茎秦艽斑枯病病原菌。     

甘肃省黄芩灰霉病的发生及其病原鉴定

目的:据2013—2016年调查,甘肃省黄芩灰霉病发生严重,常年发病率为10~15%,严重度2~3级。本研究旨在明确该病在甘肃省的发生情况及其病原菌的分类地位,为该病的防控提供一定的理论依据。方法:通过植物病害田间调查确定病害发生情况,将形态学和分子生物学方法相结合确定病原分类地位。结果:黄芩灰霉病症状主要表现为在叶片和茎秆上形成褐色病斑,严重时整株叶片干枯,植株死亡。病原菌分生孢子梗褐色,多隔,长宽450.0~716.6μm×9.4~18.8μm;分生孢子长椭圆形至椭圆形,无色,大小8.2~16.5μm×5.9~8.2(平均10.6×7.3)μm。基于形态学和r DNA ITS基因片段构建的系统发育树分析,将黄芩灰霉病病原鉴定为灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)。结论:黄芩灰霉病在甘肃省各个黄芩产区均有发生,依据病害传播规律,将栽培措施和药剂喷施相结合进行病害的防治。     

滇重楼灰霉病及其病原鉴定

灰霉病是滇重楼的主要病害之一,常引起滇重楼花器腐烂而导致种子绝收,该研究通过田间病害调查,掌握了该病发生的基本情况,通过带病组织和菌核培养分离获得病原菌,并依据柯赫氏法则验证其致病性。结果表明,病原菌分生孢子梗葡萄状分枝,分生孢子椭圆形,长9.70~13.70μm,平均(11.32±0.82)μm,宽(7.05~9.12)μm,平均(8.24±0.48)μm,精孢子球形,直径(3.34±0.31)μm,病原菌在发病植株及PDA培养基上均易产生黑色菌核,基于形态特征鉴定病原菌为一种葡萄孢属Botrytis真菌。基于病原菌RPB2,HSP60,G3PDH基因及其联合基因构建的系统发育树,支持该病原菌为葡萄孢属真菌一个新种,该菌最适培养温度为20℃,最适pH为8,持续光照会抑制病原菌生长。     

山牵牛炭疽病病原分离与鉴定

目的:明确为害山牵牛的叶部病害的病原菌,为其防治奠定基础。方法:采用常规组织分离法对山牵牛炭疽病的病原菌进行分离,利用形态学特征和ITS r DNA序列分析法鉴定该病原菌的分类地位。结果:该病原鉴定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。结论:该病原菌危害山牵牛造成其叶部病害,在国内为首次报道。     

堇菜属11种药用植物rDNAITS序列的克隆与分析

目的通过测定和分析11种堇菜属药用植物的核糖体DNA内转录间隔区(r DNA ITS)序列,为该属药用植物的分子鉴定提供依据。方法利用PCR法克隆ITS序列,借助生物信息学工具进行序列分析、遗传距离估算和系统发育树构建。结果 11种堇菜属植物的ITS全长为612~638 bp,ITS1与ITS2的长度为251~265 bp和198~211 bp,5.8 S的长度十分保守,均为163 bp;ITS1、ITS2与5.8 S的信息位点数分别为50、23和3。11种堇菜属植物的遗传距离为0.025~0.137,紫花堇菜与七星莲的遗传距离最大,亲缘关系最远;紫花堇菜和鸡腿堇菜的遗传距离最小,亲缘关系最近。结论克隆到堇菜属11种药用植物的ITS序列,它们的信息位点丰富,可用于分子鉴定。     

白及新病害叶枯病及其病原菌鉴定

目的：白及叶枯病于2021年首次在云南栽培白及上被发现,本研究旨在描述该病害的症状和病原菌形态特征;分离纯化和鉴定其病原菌。方法：用病组织分离法和菌丝尖端纯化法获得真菌菌株,用柯赫氏证病试验确定致病菌;通过PCR扩增获得致病菌株的ITS序列,由此做Blastn和系统树演化分析,结合形态特征鉴定病原菌。结果：该病害侵染叶片形成褐色圆形至椭圆形典型病斑,病斑后期扩展使叶缘或叶尖大面积枯死,重病植株可枯死。致病性试验结果表明分离纯化获得的真菌菌株BJ02为白及叶枯病的致病菌。菌株BJ02在PDA培养基上长出的菌落、分生孢子梗和分生孢子特征与水稻弯孢菌和里斯弯孢菌的形态相似。PCR扩增获得菌株BJ02的ITS片段长度为574 bp(OL587997),Blastn分析表明该序列与里斯弯孢Curvularia reesii(菌株BRIP4358)的ITS序列(MH414907)相似率达99.27%,在系统演化树上,菌株BJ02与菌株BRIP4358聚集于同一末端分枝(置信限100%)。结论：菌株BJ02为里斯弯孢菌Curvularia reesii Y.P.Tan&R.G.Shivas,...     

蒙药并头黄芩的DNA条形码鉴定研究

目的:利用ITS2序列鉴定方法鉴别并头黄芩Scutellaria scordifolia Fisch.及近缘种植物。方法:提取并头黄芩及黄芩的DNA,对ITS2序列进行扩增和测序,并在Gen Bank获取近缘种植物的ITS2序列,计算物种种间种内遗传距离(Kimura 2-parameter,K2P),采用构建Neighbor-joining(NJ)系统发育树及ITS2序列二级结构进行鉴定分析。结果:并头黄芩及近缘种的ITS2序列的遗传距离为0.014~0.141,大于并头黄芩种内遗传距离。通过ITS2序列的NJ系统发育树和二级结构,可以准确地区分并头黄芩与其近缘种。结论:ITS2序列可有效准确的鉴别蒙药并头黄芩及其近缘种。     

广豆根根腐病病原鉴定

目的:鉴定引起广豆根根腐病的病原菌,为广豆根根腐病病害的防治提供理论依据。方法:通过组织分离法分离得到病原菌,对其形态特征的观察及该菌rDNA-ITS序列的测定,并与Gen Bank中的序列进行比对。结果:该菌在PDA培养基上菌落圆形,气生菌丝薄绒状,白色,浅灰色,间有土黄色分生孢子座,基物表层肉色。小型分生孢子数量多,卵形、肾形,8～16μm×2.5～4μm;大型分子孢子马特型,多数3～5个隔膜。该菌rDNA-ITS序列长度为553 bp,它与Fusarium solani(登录号为:AB518683.1、AB470903.1、AB369488.1、AJ608989.1、GQ365154.1、EF152426.1)和Fusarium oxysporum(登录号为:GQ922558.1、GQ922559.1、DQ452447.1)的序列同源性均达99%。结论:结合以上两种鉴定方法,得出引起广豆根根腐病的病原菌为半知菌类镰孢霉属真菌茄腐镰孢菌Fusarium solani。     

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3~4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。     

基于ITS2条形码序列鉴定商品沉香基源植物

目的在沉香性状、显微和理化鉴别、浸出物含量测定的基础上,通过探讨不同品种间的r DNA TIS2序列差异及系统发育分析,为商品沉香的鉴定提供分子生物学依据。方法以白木香、商品沉香及人工诱导沉香为材料,对其进行醇溶性浸出物测定、性状及显微鉴别,提取总DNA、扩增r DNA ITS2片段并直接测定序列,MEGA5.0软件计算种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离并进行系统发育分析,构建邻接树(NJ)和最大简约树(MP)。结果人工沉香、商品沉香醇溶性浸出物含量均高于10%,性状和显微鉴别均符合《中国药典》(2010年版)一部有关规定。沉香种内平均K2P遗传距离为0~0.003,种间平均K2P遗传距离为0.005~0.023。白木香、人工沉香和商品沉香在系统发育树上聚为一支。结论在沉香性状、显微和理化鉴别、浸出物含量分析的基础上,基于ITS2条形码序列可以准确鉴别沉香基源植物,为商品沉香的鉴定提供分子生物学依据。     

金莲花白粉病病原菌鉴定

目的：明确导致药用金莲花Trollius chinensis Bge.白粉病发生的病原种类及其分类学地位。方法：田间调查观察病害发生及为害特征;借助光学显微镜观察白粉菌闭囊壳、子囊、子囊孢子、附属丝等的显微形态特征;核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)-内转录间隔区(ITS)扩增引物ITS1/PM6用于白粉菌分子鉴定,扩增序列用MegaX软件中的邻接法(NJ)构建系统发育树。结果：白粉病每年7月中旬至9月上旬在成株期金莲花茎秆、叶柄及叶片上发生,造成金莲花及种子严重减产,甚至植株早衰死亡。金莲花白粉菌闭囊壳聚生,暗褐色,近球形,直径60～100μm,壁细胞不规则多角形,有凸起;闭囊壳内子囊单个,内含8个浅褐色、卵圆形的子囊孢子;附属丝多根,聚生于闭囊壳一侧,菌丝状,浅褐色,有隔膜,近等粗,直径4～6μm。金莲花白粉菌rDNA-ITS序列与叉丝单囊壳属白粉菌Podosphaera fuliginea (MF543026、AB046986)同源性最高,分别为98.88%、98.73%,与叉丝单囊壳属其他多个种的序列也有较高的同源性(96.00%～98.03%)。根据上述同源菌株的rDNA-ITS...     

木香根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

目的:分离和鉴定木香根腐病的病原菌,探讨不同培养基、碳氮源、温度、pH等条件对根腐病病原菌产孢和菌丝生长的影响,以期掌握生物学特性,为该病的田间防治提供理论依据。方法:通过病原菌形态学观察,结合rDNA-ITS测序,在Genbank中经Blast搜索相似性序列,以ITS序列经MEGA 6.0程序构建其分子系统发育树,确定引起木香根腐病的病原菌15b为镰刀菌属真菌Fusarium oxysporum f.sp.ciceris isolate。结果:菌株15b最适菌丝生长的培养基为PDA,生长最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨,最适温度为25℃,最适pH值为6;产孢最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨,最适温度为30℃,最适pH值为7;光照对菌丝生长发育没有明显影响,但24 h黑暗条件有利于促进孢子产生;菌丝致死温度为61℃、10 min。结论:Fusarium oxysporum f.sp.ciceris isolate是引起木香根腐病的致病菌。     

细辛属8种药用植物rDNA ITS的克隆与序列分析

目的克隆和分析8种细辛属药用植物的ITS序列,为开展该属植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定基础。方法以基因组DNA为模板,利用PCR法克隆ITS全长序列,借助生物信息学软件对序列进行比对分析,并构建系统发育树。结果测序结果表明,8种细辛属植物的ITS全长为637~646 bp,其中的5.8 S序列最为保守,长度和碱基组成完全一致;ITS1与ITS2均存在一定的变异,它们的长度分别为255~257 bp和226~232 bp,序列中出现大量插入/缺失和转换/颠换现象,ITS1、ITS2的可变位点和简约信息位点数分别为46/30和14/9。系统发育分析结果表明,8种细辛属植物在进化树上可分为4组,与传统分类结果完全一致,I~IV分别对应细辛组、华细辛组、长花组和杜衡组。结论 8种细辛属植物ITS序列具有丰富的信息位点,可用于这些植物的分子鉴定。     

北京地区一种菘蓝白粉病病原菌的鉴定

目的 明确北京地区菘蓝白粉病病原菌的种类及分类地位。方法 通过田间调查了解病害发生情况及为害特征;通过显微镜观察病原菌菌丝形态、产孢结构、分生孢子及其着生方式等;采用特异性引物ITS1/PM6扩增病原菌核糖体脱氧核糖核苷酸-内部转录间隔区,病原菌扩增序列及其高度同源序列用MegaX软件中的邻接法构建系统发育进化树。结果 菘蓝白粉病病原菌菌丝直或略弯,上有浅裂叶状附着胞;分生孢子梗直立或微弯,不分枝;顶端串生分生孢子,长椭圆形或近圆柱形;芽管在分生孢子近端处萌发,直或弯曲,芽管顶端有吸器。根据显微形态特征初步推测,该病原菌属于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）白粉菌属（Erysiphe）。核酸序列比对结果表明,其与十字花科白粉菌Erysiphe cruciferarum核酸序列（MT309701、MK341128、MF192845、KY660929）一致性均为100%。该病菌与十字花科白粉菌聚为一枝,与其他白粉菌亲缘关系较远。结论 综合形态学特征及分子鉴定结果,该菘蓝白粉病病原菌为十字花科白粉菌。     

基于DNA条形码技术鉴别5种列当属药用植物

目的:建立一种快速、准确、标准化的5种列当属药用植物的DNA条形码鉴别方法。方法:采集5种列当属药用植物,所有样品进行总DNA提取,PCR扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,测序结果使用CONTIG、Bio Edit、MEGA6.0软件进行分析,构建系统发育树。结果:测得5种列当属植物的ITS、rbc L、trnL-F和mat K全长序列共200条,4种序列长度范围在364~1240 bp,其中ITS、trnL-F和mat K可将其鉴别出来。结论:rbc L序列无法有效鉴别5种列当属药用植物,trnL-F与ITS序列能够成功鉴别,可作为列当属植物的分子鉴别方法。     

农田栽参模式中人参根腐病原菌鉴定与防治

根腐病是东北农田栽培人参的主要病害之一。该研究为明确引起该病害的病原菌类型,验证苏子粗提物对病原菌的抑制作用,为人参根腐病的防治提供依据。采用组织分离法从人参根腐病株中分离得到单菌株;形态学结果表明,该病原菌的分生孢子有2种形态,小型分生孢子呈镰刀形或长柱形,大型分生孢子呈卵圆形,且有明显分隔;分子生物学鉴定结果表明,通过Blast比对,该菌株18s r DNA扩增产物与Fusarium oxysporum已知序列(JF807402.1)的同源性为100%,确定该病原菌为尖孢镰刀菌F.oxysporum。利用牛津杯法评价苏子粗提物对尖孢镰刀菌的抑制作用,结果表明,当提取物质量浓度为0.50 g·L-1时抑菌效果较好,抑菌直径为11.75 mm。该研究确定农田栽参中根腐病的病原菌类型,为根腐病植物源农药的开发提供材料,保障农田栽参的顺利开展。     

市售中药材冬葵子和苘麻子ITS2条形码鉴定

目的利用ITS2条形码序列对市售中药材冬葵子、苘麻子进行分子鉴定,以保证药材使用的正确性和临床药效。方法收集冬葵子、苘麻子及其3种混伪品样品共87份。对实验样品进行ITS2基因片段扩增并双向测序,利用HMMer注释方法获得ITS2序列,再经Codon Code Aligner 6.0.2拼接,使用MEGA6.0进行种内、种间变异分析,遗传距离计算并构建NJ系统发育树;将所得序列转换成二维码图片,扫描识读后通过中药材DNA条形码数据库进行验证。结果冬葵子和苘麻子外观形态相似;冬葵子ITS2序列长度232 bp;GC量为67.6%;苘麻子ITS2序列长度231 bp,GC量为54.1%,二者均无种内变异。冬葵子和苘麻子ITS2序列比对后长度为233 bp,共存在50个变异位点。鉴定结果显示,收集的56份冬葵子药材中26份均为苘麻子,剩余30份为正品。冬葵子和苘麻子与其他3个混伪品的K2P遗传距离为0.224~0.868,平均距离为0.630,种间遗传距离远大于种内遗传距离。基于ITS2序列构建系统发育树可见冬葵子、苘麻子及其3个混伪品各自单独聚成一支,ITS2序列能够明显将其区分;此外,使用二维DNA条形码扫描可准确验证5个物种。结论 ITS2序列能够成功鉴定冬葵子、苘麻子及其常见混伪品,为种子类药材鉴别提供了新工具;二维码技术与DNA条形码技术的结合可以为药材的基原物种提供准确唯一的二维DNA条形码信息,可更好实现药材市场的信息化监管。     

刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析

目的对刺革菌科桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌及鲍姆木层孔菌4种药用真菌rDNA ITS片段进行分析,探讨该片段在中外同类真菌的系统学及鉴别研究意义。方法对这4种药用真菌的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用Clustal X、Mega3.1等软件对ITS区序列进行分析。结果获得rDNA ITS1、ITS2和5.8SrDNA完整序列,桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌、鲍姆木层孔菌的ITS1序列长度范围为244~324bp,ITS2序列长度范围为229~274bp。以圆瘤孢多孔菌(DQ200923)为外类群,用分子进化遗传分析软件得到了包括这4种药用真菌及GenBank中3个与这4种中3种相应真菌的ITS序列的系统发育树。这一分析结果与来自形态学的鉴别结果相吻合。结论ITS序列可作为这4种药用真菌分子鉴定的依据。     

沉香DNA的提取及其ITS2-PCR体系的优化

目的:建立沉香的总DNA提取方法及r DNA第二内转录间隔区序列(ITS2)聚合酶链式反应(PCR)扩增体系。方法:分别采用改良的CTAB法、改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法及DNA提取试剂盒法提取沉香总DNA,利用通用引物ITS2P1/ITS2P2扩增r DNA ITS2目的片段,通过正交试验优选沉香的PCR扩增条件并对目的片段进行测序。结果:改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法提取总DNA的A260 nm/A280 nm1.79,质量浓度350 mg·L-1,PCR扩增目的片段产率最高。不同因素水平对沉香ITS2-PCR反应的影响顺序为模板DNA引物Taq DNA聚合酶d NTP。最佳反应体系为20μL体系,DNA模板40 ng,引物0.2 mmol·L-1,d NTP 0.5 mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.5 U。测序获得的目前片段长度230 bp,与Gen Bank中瑞香科沉香属白木香序列相似性100%。结论:CTAB法联合DNA试剂盒法可简单、快速获得高质量沉香总DNA,正交试验可快速获得ITS2目的片段,为沉香的分子鉴定和系统发育分析提供参考。