基于ITS2序列的苍术属植物遗传关系

目的:应用内部转录间隔区2(ITS2)序列鉴定东北产栽培和野生苍术及其近缘种药材,明确其种间遗传关系远近,并对东北产朝鲜苍术的栽培起源进行初步探索。方法:提取不同栽培区包括北苍术、朝鲜苍术在内的五种苍术属40份样本以及朝鲜苍术7份野生种质样本的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS2序列并进行双向测序,所得所有序列用MEGA5. 0软件进行比对分析(clustal W),去除两端5. 8S和28S序列,获得完整的ITS2序列,构建系统聚类树(NJ树)。结果:苍术属5种药材ITS2序列长度均为232 bp。根据NJ树和ITS2二级结构结果,除北苍术和朝鲜苍术未被区分开,其余几种药材均可明显区分,表现出良好的单系性。根据NJ树结果可知,朝鲜苍术的栽培品系和野生种质也能很好的聚在一起。结论:ITS2序列能稳定、准确鉴别苍术属5种药材。朝鲜苍术与北苍术亲缘关系很近,可认为是苍术北方分支中的一种变种,建议将朝鲜苍术并入北苍术。且在辽宁有大规模栽培的朝鲜苍术可能起源于辽宁本地的野生群体,种源可能来自于辽宁岫岩等地的野生种。     

基于ITS2序列的中药材桔梗种子DNA条形码鉴定

目的：桔梗为中国常用大宗药食兼用中药材,种植面积广,建立基于DNA 条形码技术的桔梗种子鉴定方法具有重要意义。方法：本研究共收集29份中药材桔梗基原植物和种子样品;利用体式显微镜、X射线影像工作站观察种子的形态特征及种子成熟度;优化DNA提取方法;基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》对种子物种进行鉴定。结果：不同群体来源或同一群体来源桔梗种子形态特征存在较大差异,识别困难;本实验可以实现单粒桔梗种子（约1mg）的DNA提取、PCR扩增和序列测定;5份样品同一群体内种子ITS2序列存在差异;中药材DNA条形码鉴定系统和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》可以作为种子物种鉴定的依据。结论：DNA条形码分子鉴定法可以对中药材桔梗种子进行鉴定,同时为中药材种质资源鉴定提供了新方法,对中药材种子质量标准的建立提供依据。     

基于ITS2条形码的市售延胡索鉴别

目的：利用DNA条形码技术对市售的经过蒸煮等加工的延胡索饮片进行分子鉴定,以评价内转录间隔区2 (internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对延胡索饮片的鉴别能力。方法：采用改良后的试剂盒法提取样品DNA,用ITS2序列引物进行PCR扩增后测序,采用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行拼接、校对,采用MEGA 7.0软件进行种内、种间变异比对及Kimura 2-parameter (K2P)遗传距离分析,并基于邻接法构建系统聚类树。结果：约80%的样品的ITS2序列被成功扩增与测序,系统聚类树显示,所得延胡索ITS2序列和参考序列紧密聚合,具有良好的单系性,能够明显区分混伪品。结论：ITS2条形码可以准确鉴别延胡索不同加工品及其常见混伪品,为延胡索的鉴定提供分子生物学依据。     

应用ITS2条形码鉴定中药材地黄

目的：应用ITS2 条形码序列准确、快速鉴定中药材地黄及其同属密切相关种,以确保该药材的质量及临床用药安全。方法：PCR 扩增产物测序后所得序列经质量分析和拼接,计算地黄及其同属物种的种内、种间K2P 遗传距离,基于K2P 模型构建NJ 树,对地黄药材进行鉴定。结果：地黄药材ITS2 序列长度为231 bp,种内变异较小,平均K2P 遗传距离为0.000 4,地黄药材及其同属密切相关种的种间平均K2P 遗传距离为0.031 2,种间最小K2P 遗传距离大于地黄药材种内的最大K2P 遗传距离。利用构建的NJ 树可以明显鉴定中药材地黄。结论：ITS2 作为条形码可以有效鉴定中药材地黄及其同属的密切相关种,为保障地黄药材的临床安全用药奠定了基础。     

应用ITS2条形码鉴定中药材麻黄

目的:应用ITS2条形码快速、准确地鉴定中药材麻黄,为其用药安全、有效提供保障。方法:提取麻黄药材及其同属密切相关种的DNA、扩增ITS2序列并测序,采用软件CodonCode Aligner V3.0对测序峰图进行校对拼接,并进行质量控制。应用MEGA5.0软件计算种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。应用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建NJ系统聚类树直观反映鉴定结果。结果:麻黄药材基原物种种内K2P遗传距离分布于0～0.002,基原物种与其他密切相关种之间的K2P遗传距离分布于0.004～0.034;几种鉴定方法分析结果表明ITS2序列能将麻黄药材与其他密切相关种鉴别开。结论:ITS2条形码适用于鉴别中药材麻黄,进一步验证了DNA条形码技术鉴定中药材的有效性。     

基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定

目的：通过DNA条形码鉴定技术区分中药材藤梨根及其常见混伪品。方法：对采集的中药材藤梨根样品及其常见混伪品进行DNA 提取,PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner 3.5.7对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA 5.0软件计算藤梨根及其常见混伪品的Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建NJ（邻接）系统聚类树,最后分析种间ITS2序列的二级结构差异。结果：中药材藤梨根两种基原植物的平均种内K2P遗传距离分别为0.001和0.002,远小于藤梨根与其常见混伪品之间的平均K2P遗传距离0.120;藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异;NJ树显示藤梨根的基原植物聚在一起,与混伪品可明显区分,但无法区别所有猕猴桃属植物。结论：ITS2序列可高效区分藤梨根及其常见混伪品,弥补了传统鉴定方法的不足,提高了鉴定效率及准确性。     

基于4种序列的辽产苍术属植物DNA条形码鉴定

目的：采用4种序列对辽宁产苍术属植物进行鉴定,进而选择适合苍术属植物DNA条形码鉴定的序列。方法：使用试剂盒提取辽宁产4种苍术属植物关苍术Atractylodes japonica Koidz.ex Kitam、朝鲜苍术A.coreana （Nakai） Kitam、茅苍术A.lancea （Thunb.） DC.、北苍术A.chinensis （Bunge） Koidz.共43份样品的总DNA,进行聚合酶链式反应（PCR）扩增及产物测序;使用DNAMAN 8.0软件对测得的双向序列进行拼接;使用MEGA 6.0软件进行序列比对;使用邻接法构建系统聚类树。结果：仅内转录间隔区2（ITS2）序列将4种苍术属植物各分为一支,聚类效果较好,psbA-trnH、matK、rbcL聚类混乱,物种分离度低。结论：ITS2序列可作为苍术属植物DNA条形码鉴定的有效序列片段,苍术野生品和栽培品、叶裂与叶不裂均聚在一起,ITS2序列片段不能区分。     

基于ITS2条形码的中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定

该研究收集天南星及其混伪品7种,共58份样品,通过DNA提取和PCR扩增,经注释后获得其ITS2条形码,然后进行序列变异分析和NJ树聚类分析。结果表明天南星3种基原天南星、异叶天南星和东北天南星的种内K2P距离均小于其种间K2P距离,在NJ聚类树上天南星3种基原分别聚为独立的支。天南星3种基原与天南星混伪品聚为不同的支。因此,ITS2作为DNA条形码可以鉴定天南星3种基原及其混伪品,DNA条形码技术可为天南星及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

五味子与南五味子药材的DNA条形码鉴定

目的:利用内转录间隔区2(ITS2)序列对五味子及南五味子药材进行DNA条形码鉴定。方法:对五味子和南五味子样品的ITS2序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序。从Gen Bank中下载了五味子属10个近缘种和2个外类群的ITS2序列。利用Codon Code Aligner软件拼接,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建聚类树(NJ树),应用Blast法进行鉴定分析。获取所测样品序列的ITS2二级结构信息,分析各样品间ITS2序列二级结构的差异。结果:五味子、南五味子样品序列长度分别为231,225~227 bp,Blast鉴定五味子药材原植物为五味子Schisandra chinensis,南五味子药材原植物为华中五味子S.sphenanthera。五味子与南五味子药材的种间K2P遗传距离(0.010 4~0.015 7)远大于五味子种内K2P遗传距离(0~0.002 5)和南五味子种内K2P遗传距离(0~0.005 1)。在NJ树模型中,五味子样品被独聚为1支,南五味子样品被独聚为1支,皆表现出单系性,Bootstrap支持率较高,可与五味子属近缘种区分开。结论:以ITS2序列为标准的DNA条形码能够有效地鉴定五味子和南五味子药材。     

基于ITS2条形码的中药材赤芍及其易混伪品的DNA分子鉴定

目的:对中药材赤芍及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。利用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果:赤芍两基源植物ITS2序列长度均为227bp;由所构建的系统聚类树图可以看出,无论芍药还是川赤芍,它们的不同来源样本均分别聚在一起,表现出单系性;比较赤芍及其易混伪品的二级结构发现,赤芍的正品来源芍药与川赤芍彼此间差异甚微,而与其它物种在螺旋区茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面具有较明显区别。结论:ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区别中药材赤芍基源植物与其易混伪品,在中药材的鉴定中具有重要的应用前景。     

白术与苍术及其混伪品DNA条形码鉴定研究

药材白术与苍术为苍术属植物,为常用健脾之要药,但二者功效不完全相同,古代对二者未进行区分,现代用药也容易将其混用,为了确保用药安全,该文采用ITS2序列对药材白术与苍术及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。白术与苍术的3个基原物种（苍术、关苍术和朝鲜苍术）ITS2序列均为229 bp。13条白术的序列仅在98 bp处有C-G变异,平均GC含量为69.42%;4条苍术序列无变异位点;关苍术与朝鲜苍术的种内最大K2P距离均为0.013。白术、苍术、关苍术和朝鲜苍术种内最大K2P距离均小于与混伪品的种间最小K2P距离。邻接（NJ）法构建的系统聚类树,白术、朝鲜苍术序列能各自聚为一支,关苍术与苍术聚为一支,但都能与混伪品明显分开。ITS2序列在药材白术与苍术及其混伪品的鉴定方面具有很好的鉴别效果。     

基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性。方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性。收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列。知母psbA-trnH序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支。共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides。结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定。所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品。     

中药络石藤及其习用品的DNA条形码鉴定

目的：本研究应用ITS2序列鉴定区分络石藤及其习用品广东络石藤、地瓜藤、薜荔藤和扶芳藤。方法：提取以上5种中药基原植物基因组DNA,扩增不同样品的ITS2序列。采用隐马尔科夫模型HMMer进行序列注释,ClustalW法进行序列比对,K2P模型计算种内和种间遗传距离分析,邻接法和最大似然法构建进化树。结果：5个物种的ITS2序列长度各不相同,在220-243bp之间。遗传距离分析显示,5个物种的最大种内遗传距离为0.038,最小种间遗传距离为0.113,最大种内遗传距离大于最小种间遗传距离。同时5个物种可以在进化树上区分开来。结论：ITS2序列可以用于中药络石藤及其习用品的分子鉴定,为准确区分该类药材提供新的技术手段。     

多基原民族药岩陀DNA条形码鉴定

目的:采用ITS,ITS2,rbcL,matK和psbA-trnH这5种热门DNA条形码序列对多基原民族药岩陀的鉴别能力进行评价,筛选出适合该物种鉴定的DNA条形码。方法:通过比较各序列聚合酶链式反应(PCR)扩增成功率及测序成功率,计算种内种间遗传距离,运用Wilcoxon非参数秩和检验进行遗传差异分析,邻接(NJ)法构建系统发育树以及采用Blast 1和NJ建树方法评价不同序列对物种的鉴定成功率等策略的实施,综合评价上述5种DNA候选条形码在多基原岩陀植物中的鉴别效果。结果:ITS序列扩增成功率及测序成功率分别为100%和96.61%;ITS2序列扩增成功率及测序成功率分别为100%和98.31%;psbA-trnH序列扩增成功率及测序成功率均为100%;rbcL序列扩增成功率及测序成功率均为100%,matK扩增成功率及测序成功率均为98.31%。psbA-trnH序列拥有最高的种内及种间遗传变异,且种内最大变异的平均值小于种间最小变异的平均值。系统发育树构建结果显示,psbA-trnH序列能区分3种不同来源的岩陀药用植物,而ITS,ITS2,rbcL和matK序列聚类效果较差。psbA-trnH序列鉴定成功率均为100%,而ITS,ITS2,matK和rbcL序列对物种鉴定成功率均低于50%。结论:psbA-trnH较其他序列有明显优势,因此推荐psbA-trnH序列作为理想的DNA条形码,用于多基原民族药岩陀的鉴定研究。     

基于ITS2序列的茄科酸浆属植物的DNA分子鉴定

目的:利用内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对茄科酸浆属植物进行分子鉴定。方法:对酸浆属与散血丹属植物样本的ITS2序列进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增和测序。为扩大研究范围,从Gen Bank中下载了上述2个属植物样本的ITS2序列。所有序列经Codon Code Aligner V3.0.1软件拼接,DNAMAN软件比对分析,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建邻接聚类树。从ITS2数据库中获得所测样本及下载序列的ITS2二级结构信息,分析各样本间ITS2序列二级结构的差异。结果:从邻接聚类树分析可知,所有样本被聚为两大支。酸浆属植物自成1支,散血丹属植物为1支,且除极个别样本外,2个属的各物种种内样本可各为1支,表现出单系性;且每2支之间的Bootstrap支持率均很高。结论:ITS2序列在近缘物种间的系统学研究、品种的鉴定方面具有较大的应用潜力,适用于酸浆属植物的分子鉴定。     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。     

Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2

Aim of the study

To test whether the ITS2 region is an effective marker for use in authenticating of the family Fabaceae which contains many important medicinal plants.

Materials and methods

The ITS2 regions of 114 samples in Fabaceae were amplified. Sequence assembly was assembled by CodonCode Aligner V3.0. In combination with sequences from public database, the sequences were aligned by Clustal W, and genetic distances were computed using MEGA V4.0. The intra- vs. inter-specific variations were assessed by six metrics, wilcoxon two-sample tests and “barcoding gaps”. Species identification was accomplished using TaxonGAP V2.4, BLAST1 and the nearest distance method.

Results

ITS2 sequences had considerable variation at the genus and species level. The intra-specific divergence ranged from 0% to 14.4%, with an average of 1.7%, and the inter-specific divergence ranged from 0% to 63.0%, with an average of 8.6%. Twenty-four species found in the Chinese Pharmacopoeia, along with another 66 species including their adulterants, were successfully identified based on ITS2 sequences. In addition, ITS2 worked well, with over 80.0% of species and 100% of genera being correctly differentiated for the 1507 sequences derived from 1126 species belonging to 196 genera.

Conclusions

Our findings support the notion that ITS2 can be used as an efficient and powerful marker and a potential barcode to distinguish various species in Fabaceae.     

蝙蝠蛾拟青霉及金水宝胶囊的DNA条形码鉴定

目的:由于传统方法对发酵菌丝体鉴定困难,采用DNA条形码技术对金水宝胶囊原料菌种蝙蝠蛾拟青霉及相关产品进行快速鉴定。方法:采用内转录间隔区(ITS)序列对收集的蝙蝠蛾拟青霉及其易混淆物种共8种168份样品进行条形码鉴定,并基于ITS序列设计蝙蝠蛾拟青霉特异引物对相关产品进行快速鉴定。结果:44份不同来源蝙蝠蛾拟青霉的ITS序列长度均为499 bp,无变异位点。基于ITS序列可对蝙蝠蛾拟青霉及其7种易混伪品进行区别;通过ITS序列设计的蝙蝠蛾拟青霉特异性引物(ITS-BF/ITS-BR)可特异扩增得到长度102 bp的短片段,采用该片段可快速鉴别蝙蝠蛾拟青霉与其他虫草菌,并可区分市场上相关产品。结论:通过ITS序列及特异性引物可以实现蝙蝠蛾拟青霉及其相关产品的快速鉴定,为金水宝胶囊的生产及质量控制提供参考。     

白术和4种不同来源的苍术对脾气虚大鼠的药效学比较

目的:探讨茅苍术、朝鲜苍术、关苍术、北苍术和白术对采用饮食不节加力竭游泳诱导的脾气虚证大鼠模型健脾益气作用的疗效异同。方法:将80只雄性SD大鼠随机分为8组,分别为空白组、模型组、参苓白术散组、关苍术组、朝鲜苍术组、茅苍术组、北苍术组和白术组,除空白组外,其余组大鼠均采用饮食不节加力竭游泳的方法造成大鼠脾气虚模型,观察大鼠体质量增减变化、肛温变化、外观皮毛光泽度、精神活动度以及大小便的性状等变化。造模成功后,各组大鼠连续给药7 d,1次/d:阳性药参苓白术散组灌胃给药剂量为6. 7 g·kg~(-1),其余给药组灌胃剂量为3. 75 g·kg~(-1),正常组与模型组给予等量生理盐水。灌胃结束后称取大鼠重量,给予10%水合氯醛(4 mL·kg~(-1))进行麻醉后,大鼠腹主动脉取血后迅速取出脾脏和胸腺进行称重。大鼠腹主动脉取血,分离取上清液,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),干扰素-γ(IFN-γ),免疫球蛋白G(IgG),胃动素(MTL),胃泌素(GAS),血清淀粉酶(AMS),琥珀酸脱氢酶(SDH),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),过氧化氢酶(CAT),丙二醛(MDA)的含量。结果:与空白组比较,模型组IgG,IL-6,TNF-α,MDA的含量明显上升(P0. 05),IFN-γ,MTL,GAS,AMS,SDH,GSH-Px,CAT,SOD的含量明显下降(P0. 05);与模型组比较,参苓白术散组、关苍术组、朝鲜苍术组、茅苍术组、北苍术组和白术组均能升高脾虚偏实虚证大鼠体内IFN-γ,GAS,AMS和CAT的含量,其中朝鲜苍术组、关苍术组和茅苍术组大鼠除CAT指标外,其余指标明显上升(P0. 05);北苍术组、茅苍术组、朝鲜苍术组和关苍术组MTL含量明显上升(P0. 05);关苍术组和北苍术组SDH含量上升,差异不具有统计学意义。北苍术组GSH-Px含量明显上升(P0. 05);各给药组均能降低脾虚偏虚证大鼠体内IgG,TNF-α和MDA的含量,其中北苍术组和茅苍术组IgG含量明显下降(P0. 05);关苍术组TNF-α含量明显下降(P0. 05);北苍术组、茅苍术组、朝鲜苍术组、关苍术组和白术组的MDA含量明显下降(P0. 05);茅苍术组IL-6含量明显下降(P0. 05)。结论:4种不同来源的苍术和白术对偏于虚证的脾虚大鼠均有一定的治疗作用,其中茅苍术和关苍术的治疗效果基本一致,调节偏于虚证脾虚大鼠消化系统吸收、分泌和消除炎症方面。朝鲜苍术、北苍术和白术则分别在消化系统、消化道炎症和抗氧化酶促系统方面具有一定的调节作用。此外从关苍术和白术药效学结果比较来看,与先前人们普遍认为的关苍术的功效更类似白术不完全一致,需要进行进一步研究。