VEGF反义核酸增强HL60和K562细胞对柔红霉素敏感性

研究发现恶性血液病细胞高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并不同程度表达VEGF受体[1~2],VEGF在白血病中的作用不够明确,可能是通过自分泌作用机制,促进白血病细胞存活和生长、降低白血病细胞对化疗药物的敏感性等。以前的研究已证实:VEGF反义     

Pre-miR-15a增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性

MicroRNA(miRNA)是22个左右核苷酸组成的内源性RNA,通过切割mRNA或翻译抑制两种机制,在转录后水平对基因表达进行负性调控.它广泛地参与细胞的生长、发育、分化、增殖和凋亡.我们前期的研究表明,转染miR-15a寡核苷酸人人淋巴瘤细胞系Raji,可负性调控BCL-2的表达,进而诱导Raji细胞的凋亡[1].本实验转染miR-15a的前体(precursor of miRNA 15a,pre-miR-15a)并联合阿糖胞苷(eytambine,Ara-C),探讨pre-miR-15a能否提高Raji细胞对Ara-C的敏感性.     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

siRNA对Hela细胞表达VEGF的干涉作用

目的：研究体外转录合成的siRNA对Hela细胞中VEGF表达的干涉作用。方法：根据人VEGF 1～5外显子序列进行siRNA设计，应用T7 RNA聚合酶体外转录合成3条siRNA。并利用siPORT Lipid将siRNA转染人Hela细胞中，通过半定量RT-PCR和免疫荧光方法检测Hela细胞VEGF表达情况，评价不同序列siRNA对VEGF基因表达的干涉作用。结果：体外转录合成的3条siRNA均能高效地抑制Hela细胞中VEGF的表达，干涉效率分别为88．7％、94．2％和80．3％，而1个错配碱基的siRNA及ssRNA（＋）未显现明显干涉作用。另外实验显示在5～10 pmol范围内，TV-siRNA对VEGF表达的抑制作用具有剂量依赖性。结论：利用T7 RNA聚合酶体外转录合成的siRNA可以高效干涉Hela细胞中VEGF的表达且具有良好的序列特异性，为肿瘤的基因治疗提供了新方法。     

VEGF siRNA的筛选、评价及siRNA的设计规则探讨

目的设计并评价9条VEGFsiRNA的干扰效果,并提出新的高效siRNA设计规则。方法用siRNA现有设计规则与计算机辅助结合共设计9条VEGFsiRNA序列,长度为19 bp。体外转录法构建9条VEGFsiRNA,通过脂质体介导转染神经胶质瘤U251细胞株,培养48 h,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的表达量,分析9条VEGFsiRNA序列特征与其干扰效果的关系。结果用“H-b”指数可以量化VEGFmRNA二级结构;VEGF蛋白表达的抑制程度与“H-b”指数呈负相关(r=-0.498),靶向VEGFmRNA第386~406位置核苷酸的siRNA和第401~421位置核苷酸的siRNA的“H-b”指数小,抑制蛋白表达的效果好。siRNA正义链的第19个核苷酸碱基为A/U,且第6个核苷酸碱基为A,有较好的沉默靶基因的效果。siRNA的热动力学特征也影响其干扰效果,反义链第9~14位置的内部能量稳定性的均值(AIS)大,易于发挥干扰效果;siRNA反义链的结合能量越低,siRNA反义链与靶序列mRNA结合越稳定,有利于RNA诱导的沉默复合物(R ISC)剪切靶序列mRNA。结论成功地设计并合成VEGFsiRNA序列,能有效地抑制VEGF蛋白表达。     

VEGF家族新成员:VEGF-B,VEGF-C和VEGF

血管内皮生长因子（ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ） 近年又发现了下列新成员： Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｂ, Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｃ 及 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｄ,三种因子与 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ 具有相似的结构、功能及分布。 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｂ 的受体尚未明确,该因子具有促进内皮细胞生长的功能; Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｃ 主要作用于淋巴管内皮,其受体为 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ２ 和 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ３ ; Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｄ 与 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｃ 的作用及结构相似,受体相同。     

急性白血病患者治疗前后血浆VEGF水平的临床意义

目的：探讨急性白血病患者血管内皮生长因子水平的变化。方法：应用酶联双抗体夹心法测定了34例急性白血病患者血管内皮生长因子的含量，并与35名正常健康人作比较。结果：急性白血病患者在治疗前血管内皮生长因子含量非常显著地高于正常人组（P〈0．01），经抗癌和中西医结合治疗三个月后与正常人组比较，仍有显著性差异（P〈0．05）。结论：急性白血病的发生与发展与血管内皮生长因子水平密切相关。     

阿糖胞苷联合光动力疗法对人白血病HL-60细胞作用的研究

目的 探讨阿糖胞苷（Ara-c）在癌光啉（PSD-007）介导的光动力疗法（PDT）杀伤人早幼粒白血病HL-60细胞中的联合作用.方法 实验分为空白对照组、PDT单独作用组（PDT l～4组,为光敏剂剂量（5、7.5μg/ml）和激光能量密度（1.2、2.4 J/cm^2）的两两组合）、Ara-c单独作用组（Ara-c A组和Ara-c B组中Ara-c质量浓度分别为0.3 μg/ml和1.2μg/ml）和联合作用组即上述PDT单独作用组和Ara-c单独作用组的两两组合.所有分组分别按3种时序即P24A时序（PDT作用24h后再加入Ara-c共同作用24h）、A24P时序（Ara-c作用24h后进行PDT再共同作用24h）和PA24时序（PDT作用的同时加入Ara-c再共同作用24h）进行处理.采用CCK-8法检测各组细胞活性,用金氏公式分析联合效应,并用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 小剂量PSD-007介导的PDT和Ara-c联合时,3种时序的联合作用均表现为协同效应;而大剂量PSD-007介导的PDT和Ara-c联合时,P24A和A24P 2种时序的联合作用效应为协同或相加,PA24时序则主要为相加或拮抗.流式细胞仪检测细胞周期变化结果显示,Ara-c和PSD介导的PDT均能引起细胞周期G0/G1期阻滞.结论 Ara-c与PSD-007介导的PDT联合作用对HL-60细胞的杀伤有协同作用,其协同作用与剂量和作用时序相关,小剂量比大剂量协同效果明显,且Ara-c和PDT间隔24h作用比2者同时作用于该细胞的协同效果明显.     

慢病毒载体携带的VEGFR2shRNA对HL60的体外杀伤作用

目的:为寻找高效低毒的选择性抗白血病药物,研究慢病毒载体携带的血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)基因短发夹RNA(shRNA)对肿瘤细胞株HL60的体外杀伤作用。方法:制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA,并据此设计shRNA寡核苷酸链,构建pU6/shVEGFR2入门克隆。瞬时转染细胞,采用MTT法、RT-PCR法及Western blotting测定VEGFR2表达抑制情况。构建表达克隆,与ViraPowerTMPackaging Mix共转染到293FTTM细胞中,产生携带Lenti6/shVEGFR2的慢病毒载体。将病毒上清加入HL60细胞中转导,测定HL60细胞抑制率并与pU6/shVEGFR2入门克隆脂质体转染结果比较。结果:VEGFR2siRNAc抑制HL60细胞效率最高,利用其shRNA和pENTRTM/U6构建的入门克隆转染HL60,抑制细胞效率达84·9%;显著抑制HL60细胞VEGFR2基因mRNA和蛋白的表达。pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后48h细胞抑制率相近,48h后入门克隆转染组细胞抑制率明显下降;而表达克隆转导组细胞抑制率变化缓慢,在96h达高峰,120h稍降,变化无显著差异。结论:在体外慢病毒载体携带的VEGFR2shRNA可有效阻断HL60细胞VEGF/VEGFR自分泌链,有效抑制白血病生长。     

miR-155特异性siRNA增强阿糖胞苷诱导的Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡

 目的：研究miR-155特异性siRNA增强阿糖胞苷（Ara-C）诱导的Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡及其机制。方法：Ara-C与miR-155 siRNA单独或者联合干预Raji细胞增殖。qRT- PCR检测脂质体转染siRNA后miR-155的表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting法检测caspase-3的表达。结果：qRT-PCR显示,转染miR-155 siRNA后,Raji细胞的miR-155表达明显下降（P<0.05）,Ara-C或miR-155 siRNA单独处理细胞后均显示出增殖抑制作用,而两者联合使用的增殖抑制作用更显著（P<0.05）。各组细胞进行药物干预48 h后行流式细胞术,结果显示Ara-C或miR-155 siRNA单独处理细胞凋亡率分别为（16.5±0.3）%和（14.6±0.3）%,与对照组［（3.6±0.4）%］比较差别有统计学意义（P＜0.05),Ara-C+miR-155 siRNA组的凋亡率［（38.4±1.4）%］分别与Ara-C和miR-155 siRNA单独处理组比较,差别有统计学意义（P＜0.05）。Ara-C+miR-155 siRNA组与Ara-C组及miR-155 siRNA组相比,caspase-3的水平明显增高。结论：miR-155特异性siRNA具有增强阿糖胞苷对Raji细胞增殖抑制及诱导Raji细胞凋亡的作用,其机制与caspase-3凋亡途径有关。     

Hax-1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨Hax-1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响.方法:MTT法、 AnnexinV-FITC/PI染色、 Hoechst 33258染色、 Western blot检测Hax-1 siRNA联合顺铂或苦参碱对细胞增殖、凋亡和caspase-3活性形式表达的影响.结果:相同药物浓度作用下, Hax-1 siRNA转染组细胞抑制率、凋亡率及cleaved caspase-3表达明显高于未转染组和转染无关载体组(P＜ 0.05);荧光显微镜下观察, 相同药物浓度作用下, Hax-1 siRNA转染组细胞凋亡现象较明显.结论:Hax-1 siRNA增强顺铂或苦参碱对黑素瘤A375细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用, 该作用可能和caspase-3的活性形式表达增强相关.     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

MR1 siRNA抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖

目的 研究MR1基因对肝癌细胞增殖的影响及机制。 方法 化学合成MR1 siRNA,用脂质体lipofectamine 2000转染肝癌细胞系BEL-7402细胞,RT-PCR检测MR1 siRNA基因沉默效果。用SRB法、集落形成法和生长曲线法检测MR1 siRNA对BEL-7402细胞增殖的影响。流式细胞术检测BEL-7402细胞周期,用细胞同步化的方法,即与G2期阻滞药物噻氨酯哒唑（nocodazole）联合应用,以间接反映MR1 siRNA对肿瘤细胞周期的影响。Western blot法检测Cyclin D1蛋白。结果（1）300nmol/L MR1 siRNA处理BEL-7402细胞24h后,MR1基因的mRNA水平明显降低。（2）经siRNA处理后,BEL-7402细胞存活细胞数明显下降,细胞生长速度明显减慢,集落形成率显著下降,Cyclin D1表达水平明显降低。（3）MR1 siRNA与nocodazole联合处理BEL-7402细胞后,G2期细胞比例显著减少,而G1期细胞明显增多。结论 MR1基因与人肝癌BEL-7402细胞增殖相关,抑制MR1表达,能够引起细胞的增殖抑制,其作用机制与诱导细胞的G1期阻滞有关。     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

Tumor targeting RGD conjugated bio-reducible polymer for VEGF siRNA expressing plasmid delivery

Targeted delivery of therapeutic genes to the tumor site is critical for successful and safe cancer gene therapy. The arginine grafted bio-reducible poly (cystamine bisacrylamide-diaminohexane, CBA-DAH) polymer (ABP) conjugated poly (amido amine) (PAMAM), PAM-ABP (PA) was designed previously as an efficient gene delivery carrier. To achieve high efficacy in cancer selective delivery, we developed the tumor targeting bio-reducible polymer, PA-PEG_1k-RGD, by conjugating cyclic RGDfC (RGD) peptides, which bind α_vβ_3/5 integrins, to the PAM-ABP using polyethylene glycol (PEG, 1 kDa) as a spacer. Physical characterization showed nanocomplex formation with bio-reducible properties between PA-PEG_1k-RGD and plasmid DNA (pDNA). In transfection assays, PA-PEG_1k-RGD showed significantly higher transfection efficiency in comparison with PAM-ABP or PA-PEG_1k-RAD in α_vβ_3/5 positive MCF7 breast cancer and PANC-1 pancreatic cancer cells. The targeting ability of PA-PEG_1k-RGD was further established using a competition assay. To confirm the therapeutic effect, the VEGF siRNA expressing plasmid was constructed and then delivered into cancer cells using PA-PEG_1k-RGD. PA-PEG_1k-RGD showed 20–59% higher cellular uptake rate into MCF7 and PANC-1 than that of non-targeted polymers. In addition, MCF7 and PANC-1 cancer cells transfected with PA-PEG_1k-RGD/pshVEGF complexes had significantly decreased VEGF gene expression (51–71%) and cancer cell viability (35–43%) compared with control. These results demonstrate that a tumor targeting bio-reducible polymer with an anti-angiogenic therapeutic gene could be used for efficient and safe cancer gene therapy.     

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.