北京鸭载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的:克隆不易感动脉粥样硬化动物北京鸭载脂蛋白AI的基因。方法:分离提取北京鸭肝组织mRNA,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织cDNA文库。利用制备的兔抗鸭载脂蛋白AI(apoAI)多抗血清为探针筛选该文库,获得10个阳性克隆,测序及序列分析。结果:包括18bp、240bp组成的5’和3’非翻译区,792bp组成的一个完整开放阅读框架,编码264个氨基酸的鸭apoAI前体,含18个氨基酸构成的信号肽、6个氨基酸的原肽片段和240肽的成熟蛋白。推译出的成熟肽与鸭apoAI氨基酸的直接测序结果完全一致。该新基因已被GenBank接受。Northern blot显示鸭apoAI mRNA不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳类动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布。结论:结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭apoAI基因组结构、功能及其抗动脉硬化机制奠定了基础。     

树Ju载脂蛋白AIcDNA的克隆及其组织表达

克隆不易感动脉粥样硬化动物树Ｊｕ（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白Ａ－Ｉ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点,方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序,序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８     

人血清载脂蛋白A-I的分离、纯化及其测定

用超离心法制备人血清高密度脂蛋白(HDL);甲醇/氯仿脱脂;经Sephadex G-150层析及DEAE-纤维素(DE-52)离子交换得纯化载脂蛋白A-I(Apo A-I),免疫新西兰兔,获得效价为1:32的特异性抗人Apo A-I抗血清。用本室建立的单向火箭免疫电泳法测定了158名健康中年人与9名老人的血清Apo A—I含量,结果发现:β-脂蛋白<5g/L,总胆固醇<2mmol/L的人血清Apo A-I含量男女分别为2.06±0.16g/L和2.07±0.15g/L;而β脂蛋白≥5g/L,总胆固醇≥2mmol/L的人血清Apo A-I含量男女分别为1.75±0.15g/L和1.82±0.1g/L,由此可见,血脂正常的男性和女性的Apo A—I含量均显著高于血脂高的男性和女性。80岁以上老年人的血清Apo A-I含量为2.1±0.1g/L,也在正常范围。与文献报道比较,我国人的血清Apo A-I含量高于外国人,这与我国人HDL水平较外国人高一致。     

树鼩HGF全长编码序列的克隆及分子特征分析

目的获取树鼩肝细胞生长因子的全长编码序列并进行分子特征分析。方法以树鼩肝组织总RNA为材料,通过RT-PCR扩增和序列拼接获得树鼩肝细胞生长因子全长编码序列,进而通过DNAMAN,Pymol等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析。结果树鼩HGF分子结构在进化中相对保守,树鼩HGF整体结构与人相似。但树鼩HGFαNK1区域相比人HGF多出一个α螺旋,并且有两个更长的β折叠片,另外,树鼩在该区域存在一个很强的表面正电荷区域。这些差异可能会对树鼩HGF与其受体的作用方式产生影响。结论本实验为明确树鼩HGF与其受体的作用方式和树鼩HGF的合成与制备奠定了基础。     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式ＰＣＲ的方法从Ｒａｊｉ细胞中扩增出人ＣＤ８０ ｃＤＮＡ，并将这一ｃＤＮＡ克隆入载体ｐＵＣ１９中，经ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，进行初步鉴定后，再将入ＣＤ８０ｃＤＮＡ克隆到ｐｃＤＮＡ表达载体上，构建成ｐＣＤ－ＣＤ８０重组质粒。应用脂质本介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞后，用ＳＡＢＣ法进行瞬时表达的检测。结果表明，转染后４８ｈ就具有明显人ＣＤ８０基因的表达产物。     

载脂蛋白E3及其突变体apoE2、apoE4的克隆与表达

目的：克隆人3种类型载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)cDNA，表达并纯化3种apoE融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从肝组织中克隆得到apoE3 cDNA．以此为基础通过定点突变得到apoE2和apoE4的cDNA。将上述3种cDNA亚克隆到含有His标签的融合表达载体pT7-PL中，表达的蛋白经镍离子柱亲和层析纯化。结果：序列分析表明。获得的apoE2、apoE3、apoE4与GenBank中的一致。表达并纯化了N端带有6个组氨酸的apoE2、apoE3、apoE4融合蛋白。结论：成功地获得了人3种类型apoE cDNA和3种apoE融合蛋白。     

一个新的高血压病相关基因的克隆和表达

目的寻找和克隆新的高血压病相关基因，探讨高血压病的发病机制。方法应用差异显示筛选的方法，对正常（ＷＫＹ）大鼠和自发性高血压病大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞进行ＲＮＡｍａｐｐｉｎｇ分析，选择下调的ｃＤＮＡ进行克隆。结果获得一个新的ｃＤＮＡ，其长度为４１６０ｂｐ，可编码５５１个氨基酸，蛋白质分子量为６２６４４。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，这一基因不仅存在于血管平滑肌细胞中，而且也广泛分布在大鼠心、肾、脑、肺和肝组织中。这一基因在ＳＨＲ大鼠的心、肾、脑、肝中低表达，在ＷＫＹ大鼠高表达；血管紧张素ＩＩ、内皮素－１、ＩＬ－１等致血管平滑肌细胞增殖和高血压的因素可以抑制这一基因的表达，其作用可为相应的拮抗剂所阻断；心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖和降低高血压的因素可以上调这一基因的表达。结论获得了一种新的与血管平滑肌细胞增殖或高血压相关的基因，它可能拮抗ＶＳＭＣ增殖，在高血压的发生中起重要作用。     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式PCR(nested PCR)的方法从Raji细胞中扩增出人CD80 cDNA,并将这一cDNA克隆入载体pUC19中。经PCR扩增和限制性酶切分析,进行初步鉴定后,再将人CD80 cDNA克隆到pcD-NA表达载体上,构建成为pCD-CD80重组质粒。应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤B16细胞后,用SABC法进行瞬时表达的检测。结果表明,转染后48h就具有明显人CD80基因的表达产物。     

树鼩肝组织cDNA文库的快速构建

目的:为了研究不易感动脉粥样硬化动物树鼩多种载脂蛋白的基因分子结构,我们在国内外首次快速构建了树鼩肝细胞cDNA文库。方法:采用一步法提取树鼩肝细胞总RNA;以寡核胸苷酸为吸附介质,柱层析法进一步纯化mRNA。以此为模板,利用改良的cDNA快速合成方法,反转录合成树鼩肝细胞cDNA第一、二链。对cDNA双链末端修饰,连接含双酶切位点的连接子后重组于噬菌体载体。结果:包装后获得2.1×10~6高滴度的树鼩肝细胞cDNA文库,放射自显影显示合成的cDNA产物大小在400～5000个核苷酸之间,该文库的克隆重组率为98.5％以上,PCR扩增随机提取的白色噬菌斑DNA,电泳鉴定均有cDNA插入片段。以制备的两种多价抗血清为探针,从构建的cDNA文库中筛选克隆出完整的树鼩apoAI和apoCI的cDNA核苷酸序列。结论:与常规方法比较,本法简便、快速,易于操作和掌握。本研究还对应用此方法构建cDNA文库的某些环节进行了探讨。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

树鼩胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的　获得不易感动脉粥样硬化动物树胆固醇酯转运蛋白 (CETP)的cDNA和蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法　以从树肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板 ,应用SMART RACE技术 ,获得了树CETP的cDNA序列 ,并推导出其蛋白质氨基酸序列 ,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果　获得的树CETPcDNA(在GenBank中的注册号为AF334 0 33)长 16 36bp ,编码 485个氨基酸 ,其成熟蛋白由 477个氨基酸组成 ,比人多一个氨基酸 (Gly318) ,该蛋白与人、家兔的同源性分别为 88%和 82 %。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守 ,但在Asn34 2位的N 糖基化位点缺失 ,可能使其转运胆固醇酯的活性增加 ,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较 ,初步分析了树CETP蛋白与功能相关的结构特点。结论　树CETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响

目的研究载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ）基因表达调控对血浆高密度脂蛋白（ＨＤＬ）代谢的影响。方法采用已建立的含小鼠金属硫蛋白Ｉ（ＭＴ－Ｉ）启动子的人ａｐｏＡＩ转基因Ｃ５７ＢＬ／６小鼠系,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测锌诱导前后人ａｐｏＡＩ基因整合和表达的情况。结果转基因小鼠整合４～１５拷贝的人ａｐｏＡＩ基因。人ａｐｏＡＩ基因主要在肝和肾中表达,经重金属锌诱导后,人ａｐｏＡＩ基因可在肝、小肠及肾中高效表达。转基因鼠血浆总ａｐｏＡＩ水平比对照组明显增高,其中人ａｐｏＡＩ水平经锌诱导后增高约４６％。与对照组相比,血浆ＨＤＬ水平在锌诱导前后分别增高约４７％和１０３％。转基因鼠ＨＤＬ和人ａｐｏＡＩ水平间呈显著正相关（ｒ＝０．８５,Ｐ＜０．０１）。结论ＡｐｏＡＩ对血浆ＨＤＬ水平升高有重要的调节作用,该转基因鼠是进一步研究ａｐｏＡＩ在高脂血症时对脂质代谢的影响和抗动脉粥样硬化（ＡＳ）作用机制的理想动物模型     

哈萨克族原发性高血压患者载脂蛋白B/载脂蛋白AI比值的影响因素

目的：探讨影响哈萨克族原发性高血压患者血清载脂蛋白B/载脂蛋白AI (ApoB/ApoA1)比值的相关因素。方法随机选取2013年8月至2015年3月在新疆沙湾县流行病学调查的217例哈萨克族原发性高血压患者,按血清ApoB/ApoA1比值水平分为≥0.9组(89例)与<0.9组(128例),收集两组患者的血压、体质量指数(BMI)、尿酸(UA)、同型半胱氨酸(Hcy)等资料。相关性分析采用Pearson直线相关分析,多因素分析采用Logistic回归分析。结果≥0.9组患者的UA、Hcy、舒张压(DBP)、腰围(WC)、BMI均高于<0.9组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ApoB/ApoA1比值与UA、Hcy、腰身比(WHtR)、WC、BMI呈正相关(r分别为0.216、0.217、0.219、0.259、0.162,P<0.05)。Logistic回归分析显示：Hcy、BMI是ApoB/ApoA1比值升高的独立危险因素(OR值分别为1.055、1.133,P<0.05)。结论在哈萨克族原发性高血压患者中,Hcy和BMI与ApoB/ApoA1比值的升高密切相关。     

人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的：构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA，克隆到pGEM-T载体，测序正确后，再亚克隆到质粒pGEX-4T1中，构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin，并转化大肠埃希菌DH5α，诱导GST-granulysin融合蛋白表达。结果：诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后，免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44000的蛋白条带。结论：获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。     

超体质量/肥胖及糖尿病患者血清载脂蛋白B与载脂蛋白A1比值的临床意义

目的 探讨ApoB/ApoA1比值在超体质量、肥胖及2型糖尿病患者的变化情况并进一步研究其临床意义.方法 收集2012年7月～2013年4月来我院进行健康体检的受检者181例,以研究对象的BMI及糖调节状况为依据对其进行分组,A组[n=38 (20/18)],该组患者具有正常的糖调节与体质量;B组[n=41 (24/17)],该组研究对象均为2型糖尿病患者并且具有正常的体质量;C组[n=54(31/23)],该组患者为超体质量/肥胖且具有正常的糖调节;D组[n=48 (26/22)],该组患者为超体质量/肥胖的2型糖尿病.对四组患者FPG、血脂、hs-CRP、胰岛素水平进行检测,各组患者的胰岛素敏感性采用HOMA-IR进行评价.结果 ①B、C、D组与A组比较具有较高的ApoB/ApoAl比值(P＜0.05),D组与B、C组比较水平更高(P＜0.05).②ApoB/ApoA1的独立相关因素为年龄、BMI、TG、HDL-C、LDL-C、HOMA-IR(P＜ 0.05).③高ApoB/ApoA1组患者的年龄、BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、HS-CRP、HOMA-IR水平与低ApoB/ApoA1组比较均明显较高,高ApoB/ApoA1组患者也具有较高的高血压及代谢综合征的发生率,HDL-C水平明显将低.④高血压及代谢综合征的发生中ApoB/ApoA1为其独立危险因子(P＜0.05).结论 在超体质量、肥胖及糖尿病人群中ApoB/ApoA1比值对其风险评估较为适用.