丝裂原在海马神经干细胞培养中的作用

目的 研究表皮生长因子(epidemal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在海马神经干细胞培养中的作用，确定适合海马神经干细胞体外培养的丝裂原。方法 应用EGF和bFGF刺激海马神经干细胞增殖，观察神经干细胞生长、增殖和分化等特性。结果 EGF和bFGF都能刺激神经干细胞扩增，bFGF反应性神经干细胞团增殖缓慢，细胞团中部分细胞迁出，迁出的细胞形成新的细胞团或分化成神经细胞或神经胶质细胞，而且bFGF反应性神经干细胞贴壁很紧，不易传代；相反，EGF反应性神经干细胞快速增殖，易于传代，较少迁移和分化。结论 EGF可促使海马神经干细胞快速增殖，是体外培养海马神经干细胞比较合适的丝裂原。     

碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对脊髓神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎脊髓神经干细胞(NSC)增殖与分化的影响。方法从14 d胚胎大鼠的脊髓组织中分离培养脊髓NSC,并随机分为3组:EGF组、bFGF组和bFGF+EGF组。通过光镜观察不同时间点各组脊髓NSC克隆细胞团数量及直径大小,并采用免疫荧光染色检测各组脊髓NSC向神经元和星形胶质细胞分化的情况。结果①EGF组培养1、3、7 d后NSC克隆细胞团数量和直径均少于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF+EGF组仅在培养1 d时克隆细胞团数量多于bFGF组,在培养3、7 d时差异无统计学意义。②EGF组分化细胞中神经元比例显著少于bFGF和bFGF+EGF组,星形胶质细胞数量明显大于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF和bFGF+EGF组组间差异无统计学意义。结论 EGF对脊髓NSC克隆形成有一定作用,而bFGF能较好地促进克隆细胞团的形成及生长,两者联合应用在培养早期可显著促进克隆细胞团形成。EGF可诱导脊髓NSC更多分化为星形胶质细胞,而bFGF则可促进脊髓NSC向神经元分化。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。 目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。 方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200 μm时,滴加DMEM/F12+2% B27+20 μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子+神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。 结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组均明显提高(P < 0.05),且碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组神经元的比例最高(P < 0.05)。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

脑缺血后内源性激活神经干细胞的机制研究

1 脑缺血后内源性神经干细胞的自身激活 近年来研究表明,脑缺血后自身的神经干细胞有大量的增殖分化[1,2],说明神经干细胞可能参与脑缺血的病理生理过程.Zhang等通过建立沙鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,观察缺血再灌注后不同时期的室管膜下层(SVZ)、海马颗粒细胞层(DG)、嗅球以及梗死灶周边皮质的神经干细胞增殖、分化情况,发现7 d后在梗死同侧脑SVZ出现神经干细胞增殖高峰,14 d达最高,而DG区则无增殖,且14 d后远离梗死区的嗅球有大量的神经干细胞增殖,但28 d后,标记Brdu阳性细胞大量减少,说明脑缺血只引起短暂的神经干细胞的增殖,Zhang认为是脑缺血损伤的应急保护反应[3].     

神经干细胞的基础和临床研究

由于固有观念的束缚,直到最近神经干细胞（neural stemcells）的概念才开始应用于成熟的中枢神经系统研究中。 一、基础研究 1.神经干细胞的定义和特性:1989年,Anderson参照造血系统干细胞的特性,提出了神经干细胞的概念:一类具有自我更新能力、高增殖潜能以及多分化潜能的细胞。关于神经干细胞的概念,目前尚无统一的定义。有人称之为神经祖细胞（neural progenitor cell）或神经前体细胞（neural precursorcell）。但这3个概念还是存在一定差异的,神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。祖细胞是相对于干细胞而言,仅具有单潜能或双潜能分化能力或其干细胞样特性只能维持较短的时间。而前体细胞则是一个不太严格的术语,是指在发育进程中较另一种细胞处于更早阶段的细胞,可统称干细胞和祖细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球促进神经干细胞生长的体外实验研究

目的 制备一种能够负载足量碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)并且能够以理想的速度缓慢释放的载体. 方法 构建负载bFGF的缓释微球,并检测其体外释放过程.将bFGF缓释微球与神经干细胞共培养,以常规多次添加bFGF的神经干细胞培养组作为对照,用AlamarBlue法检测培养细胞的存活情况,ELISA法检测培养上清bFGF含量,定期观察细胞形态学变化,并进行巢蛋白荧光免疫细胞化学染色,检测神经干细胞标记物. 结果 AlamarBlue法检测结果显示,培养3d、5d时bFGF缓释微球组和常规培养组之间细胞增殖率差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA法检测结果显示,仅负载bFGF缓释微球组能测量到培养上清中bFGF含量,大致维持在200 pg/mL水平.细胞形态学观察发现bFGF缓释微球组能够在培养第3天即形成神经干细胞球,并且在培养第7天仍保持较好透光度,保持较好的细胞活性.荧光免疫细胞化学染色发现bFGF缓释微球组培养的神经干细胞球巢蛋白染色阳性. 结论 本课题组制作的bFGF缓释微球材料具有较好的生物相容性.缓慢释放的bFGF能够满足神经干细胞生长需要,并且保持神经干细胞自身的细胞特性.该bFGF缓释微球安全有效,可应用于中枢神经系统损伤的在体实验研究.     

表皮生长因子对胎鼠纹状体神经干细胞的作用

目的：研究表皮生长因子（EGF）对胎鼠纹状体神经干细胞分裂增殖及分化的诱导作用。方法：应用EGF促使体外培养中的胎鼠神经干细胞分裂增殖并诱导其分化,随后使用透射电子显微镜及免疫组化方法研究干细胞的生物学特性。结果：胎鼠纹状体存在多潜能神经干细胞,EGF可以促使胎鼠纹状体神经干细胞分裂,并使其分化产生一定比例的神经元及胶质细胞。结论：EGF作为外源性信号因子作用于胎鼠纹状体神经干细胞的相应受体,对其分裂分化可产生重要作用。     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

bFGF和BDNF对小鼠神经干细胞体外增殖分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和脑源性神经生长因子（BDNF）对小鼠源性神经干细胞（NSCs）体外增殖及分化的影响。方法用无血清培养与单克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养,根据培养液中所加营养因子的不同将传代的NSCs分为bFGF组、BDNF组、bFGF＋BDNF组,观察不同组别对NSCs的定向分化作用。结果与bFGF和BDNF组相比,bFGF＋BDNF组细胞分化为神经元的比例较高（P〈0.05）。结论 bFGF可以提高BDNF诱导小鼠NSCs向神经元分化的比例。     

神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移*

背景：成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后。如何有效地使移植入创伤性脑损伤灶周边的神经干细胞存活分化,是目前神经修复再生研究的重点。 目的：探讨神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边的成活、迁移和分化情况。 方法：利用无血清培养技术,加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导刺激大鼠胚胎源性前脑神经干细胞生长增殖,并在体外进行克隆培养,移植前行BrdU标记,采用免疫组化和免疫荧光法检测其增殖特性和多向分化潜能,并观察其移植到Fenney’s落体脑损伤模型鼠脑皮质内的成活和迁移情况。 结果与结论：免疫组化及免疫荧光检测结果显示克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性,分化后呈NSE,GFAP,MAP-2阳性。免疫组化及荧光双标检测结果显示移植后7,14 d损伤灶周边散在BrdU阳性细胞,并且GFAP阳性细胞增多。提示前脑神经干细胞在体外培养中能够增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,移植后能够在创伤性脑损伤灶周边存活和迁移,形态上显示出与脑组织整合的特点。     

胚胎大鼠神经干细胞电生理特性检测

目的 探讨胚胎大鼠神经干细胞体外培养分化的子代细胞电生理特性。方法 传代细胞单层贴壁培养,细胞内电流钳记录静息膜电位、动作电位、膜阻抗等电生理指标。结果 神经干细胞在现有培养条件下可初步分化为神经元和胶质细胞,并表现出不同的电生理特性。结论 神经干细胞表现出多向分化潜能,但现有培养条件尚不能使子代细胞电生理功能完全成熟。     

Effects of lead exposure on proliferation and differentiation of neural stem cells derived from different regions of embryonic rat brain

Lead is a potent neurotoxin, causing brain damage and cognitive deficits in children even at low exposure levels. Although lead neurotoxicity can occur after prenatal or postnatal exposure, little is known of the effects of lead on embryonic neural stem cells (NSCs) or the extent to which NSCs originating in different brain regions may be differentially sensitive to the effects of lead exposure. The present study examined the effects of lead on proliferation and differentiation of neural stem cells (NSCs) originating from E15 rat cortex (CX), striatum (ST) or ventral mesencephalon (VM). Free-floating neurospheres were grown under standard conditions or in lead (0.01-100 microM)-containing conditioned media for 5 days and proliferation assessed by 3H-thymidine uptake. In other studies, control and lead-exposed neurospheres were collected, dissociated and re-plated in control or lead-containing differentiation media for 7 days. Cells were immunostained for visualization of mature neural and glial markers and counted. Lead exposure (0.01-10 microM) had no effect on neurosphere viability but caused a significant dose-dependent inhibition of proliferation in VM and ST but not CX neurospheres. The number of MAP2 positive neurons differentiated from lead-exposed neurospheres of VM and ST origin (but not CX) was significantly decreased from control as were the number of oligodendrocytes obtained, regardless of their region of origin. In contrast, lead exposure significantly increased the number of astrocytes obtained regardless of site of origin. These data suggest that even low levels of lead can differentially affect proliferation and differentiation of embryonic NSCs originating from different brain regions and supports the need for prevention of prenatal lead exposure.     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

挫伤脑组织对人胚神经干细胞影响的体外研究

目的 建立人胚胎来源的神经干细胞体外培养方法，初步研究挫伤脑组织提取液(TBITE)对人胚神经干细胞(HNSCs)存活、增殖能力和分化的影响。方法 10周龄左右的胎儿大脑皮层细胞体外培养，神经干细胞增殖2～3代后，剔除生长因子，分别加入不同浓度的脑外伤病人的挫伤脑组织提取液，培养2～3周后，免疫细胞化学方法鉴定细胞分化后的类型。用Laemrnli凝胶电泳法分析培养液上清。结果成功获得以神经球形式生长的人胚神经干细胞，Nestin表达阳性；与空白对照相比，TBITE组中的神经干细胞有明显的增殖，并分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着TBITE含量的增加，星形胶质细胞的比例增加。结论 脑外伤的局部微环境可促进神经干细胞增殖和分化。     

大鼠雪旺氏细胞支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化

目的 探讨大鼠雪旺氏细胞对人胚胎神经干细胞生长和分化的作用。方法 实验分为三组：组一：干细胞生长于培养雪旺氏细胞1天后的培养液中；组二：干细胞与雪旺氏细胞共培养；组三：干细胞生长于DMEM／F12培养液中，观察干细胞的形态学变化和免疫荧光的.组一的神经球分化生长，绝大多数细胞tubulin-β阳性，少数为GalC或GFAP阳性；组二中，在雪旺氏细胞生长密集和稀少的地方，干细胞分别表明为不分化和明显分化两种状态；组三的神经干细胞无法正常生长。结论 大鼠雪旺氏细胞分泌物支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化。     

神经干细胞移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究

目的 将神经干细胞(NSCs)移植于大鼠创伤性脑损伤部位,观察NSCs对创伤性脑损伤的治疗作用.方法 首先进行NSCs的体外培养,同时采用5-2-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,脑外伤模型采用自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区来制作,脑外伤后24h内移植NSCs,分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、3周时行神经运动行为学评分(NMFE)和免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷酯(GalC)蛋白表达和TUNEL原位杂交染色,经计算机图像分析系统处理.结果 大鼠自由落体撞击伤后,右下肢神经运动功能障碍明显.神经运动行为学评分在第1周时,实验组与对照组无明显差异,而在第2、3周时,实验组的评分明显低于对照组,有统计学意义(P＜0.05).第2、3周时实验组NSE、GFAP和GalC染色阳性细胞数要多于对照组,nestin染色在第1周时表达最高,而后逐渐下降.BrdU阳性细胞在损伤灶中心区最多,在损伤灶的远隔部位也有少许发现,而TUNEL染色则对照组明显比NSCs组高,有统计学意义(P＜0.05).结论 脑外伤移植NSCs可以在损伤区存活、增殖及分化,并在损伤的远隔部位有少许NSCs迁移、分化.NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复.     

成人脑神经干细胞体内外增殖、分化和迁移研究

目的探索从成人脑组织获取的神经干细胞（成人-hNSCs）在体外的增殖能力、分化特性、以及在裸鼠颅内的存活、迁移及分化情况。方法分别留取癫痫患者手术切除的颞叶脑组织和10W左右人类自然流产胎儿纹状体组织,体外分离成单细胞悬液,无血清培养基培养、传代并诱导分化。软琼脂糖集落形成实验检测NSCs的增殖能力。免疫荧光法检测NSCs标志物神经上皮巢蛋白（Nestin）和诱导分化后神经元标志物13．tubllin以及神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达;利用动物立体定向仪将体外悬浮培养2W的人NSCs移植入裸鼠颅内,检测NSCs在裸鼠脑组织局部的存活、迁移和分化状况。结果成人-hNSCs集落形成能力较胚胎脑组织来源的NSCs（胎儿-hNSCs）明显减弱,免疫荧光染色显示分离的NSCs呈Nestin阳性,诱导分化后可见（β-tubllin和GFAP阳性的神经细胞,其中80％的细胞为GFAP阳性的星形胶质细胞,20％左右为β-tubllin阳性细胞。分别将成人-hNSCs和胎儿．hNSCs移植入裸鼠纹状体,1个月后,冰冻切片,荧光显微镜观察到来源于成人脑组织来源的NSCs仅见沿针道的近距离迁移,免疫荧光染色在成人-hNSCs移植裸鼠颅内只检测到GFAP阳性的星形胶质细胞。而胎儿-hNSCs可穿过针道,沿大脑廉向脑实质广泛迁移,免疫荧光染色能检测到GFAP和少量（β-tubllin阳性细胞。结论成人脑组织和胚胎纹状体组织中均能成功分离到神经前体细胞,而与胎儿．hNSCs相比,成人-hNSCs体外增殖能力、多向分化潜能和体内迁移能力都明显减弱。     

体内外不同环境对大鼠胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探讨体内外不同环境条件对大鼠胚胎神经干细胞分化影响。方法 孕龄16天的大鼠胚胎神经干细胞体外扩增后移植至大鼠脑内尾状核出血部位；同时体外将其与新生大鼠Schwann细胞共培养，应用免疫组织化学和免疫荧光方法分另检测神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性标志蛋白tubulin-β、MAP2，GFAP和GalC的表达。结果 移植到脑内的BrdU阳性细胞环绕脑出血区域分布，大部分细胞GFAP阳性，少部分细胞tubulin-β或ＧalC阳性；而与Ｓchwann细胞共培养后，神经干细胞大部分呈tubulin-β和ＭＡＰ２免疫荧光阳性，少部分呈ＧＦＡＰ或ＧalC免疫荧光阳性。结论 脑内尾状核出血环境诱导神经干细胞主要分化成神经胶质细胞；而体外与Ｓchwann细胞共培养主要诱导其分化成神经细胞。     

葡萄糖浓度对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对神经干细胞增殖、分化的影响。方法胚胎小鼠脑细胞原代培养并鉴定。生理浓度和高浓度葡萄糖培养及诱导分化后．四唑盐比色（MTT）法及免疫荧光法观察两组不同葡萄糖浓度对神经干细胞增殖、分化的影响。结果原代培养的神经球表达巢蛋白（hestin），神经球分化的细胞表达神经丝200（NF200）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。与生理浓度葡萄糖相比，高浓度葡萄糖降低了神经干细胞的增殖活力：分化3d后，高糖组的NF200阳性细胞和GFAP阳性细胞比例高于生理浓度组（P〈0．01），而nestin阳性细胞比例则反之（P〈0．01）；分化10d后，神经干细胞完全分化，免疫荧光检测发现生理浓度葡萄糖提高了NF200阳性细胞比例。结论高糖损害了神经干细胞的增殖活性。加速了神经干细胞的早期分化．降低了神经元的分化率。     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

目的 研究大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的可行性。方法 从孕龄16天的大鼠胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞并诱导其分化，通过免疫组化学技术研究其特性。制作大鼠脑出血模型，3天后将未分化的神经干细胞注入血肿同侧或对侧的尾状核内，记录损伤和移植后的大鼠运动功能。不同时间杀死大鼠，研究移植后的干细胞在体内分化和迁徙的情况。结果 实验中分离、培养的神经干细胞体外能够被诱导分化成神经元、光突胶质细胞和星形胶质细胞，血肿同侧移植干细胞的大鼠运动功能的改善显著好于血肿对侧移植干细胞组及未移植干细胞的对照组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可分化成神经元和胶质细胞，并向损伤区域迁徙。结论 大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，其分化成各种类型神经细胞的比例与所处的外界环境有关，在脑内靠近损伤部位移植胚胎神经干细胞后能够有效改善脑出血动物的运动功能。