锌对小鼠精子受精能力影响的实验研究

本研究运用胶体金标记的Con A.明胶膜方法,检测2.5×10~(-4)M浓度的Zncl_2(模拟小鼠精浆中锌的浓度)对小鼠附睾尾部精子受精能力的影响,并运用原子吸收分光光度计测定了小鼠精子在获能过程中精子锌的释放,及高锌(5μg/ml)溶液对锌释放的影响。实验结果表明:锌能阻止小鼠精子获能过程中糖蛋白的丢失,以及能可逆性地抑制顶体蛋白酶的活性,从而影响精子的受精能力,认为精浆锌作用可能与抑制精子锌的释放,提高糟子内含锌浓度有关。本实验显示了锌应用于抗生育作用的可能性。     

氯化铵对小鼠精子顶体蛋白酶、顶体反应和体外受精的影响

本文从顶体蛋白酶、顶体反应和体外受精三个方面研究了获能前就使用不同浓度的氯化铵对小鼠附睾精子的影响,精子经加有1mM、3mM、10mM和50mM氯化铵的孵育液孵育1小时后,用明胶底物膜法测定顶体蛋白酶活性,孵育2小时后制作电镜标本,观察顶体反应的发生情况,并用体外受精的方法检测精子的受精能力。结果,NH_4Cl在高浓度(≥10mM)时,能抑制小鼠精子的顶体蛋白酶活性和顶体反应,且药物浓度越高,抑制越明显,当NH_4Cl浓度为50mM时才对精子的体外受精能力产生抑制作用。提示从抑制溶酶体内容物释放方面寻找抑制顶体反应的药物作为避孕的新途径是切实可行的。     

顶体蛋白酶抑制剂KF-950对精子顶体蛋白酶的抑制作用

本文研究蛋白酶抑制剂KF-950对人精子顶体蛋白酶的抑制作用.醋酸抽提并纯化人精子顶体蛋白酶,BAEE/ADH法测定不同浓度KF-950作用后残余酶的活性.结果正常人精子顶体蛋白酶活性为37.65±4.47mu/ml(pH 8.5,25℃);在加入不同浓度KF-950后,残余酶的活性与KF-950的浓度呈负相关(r=-0.998),1 μgKF-950可抑制1.895 mu人顶体蛋白酶活性(pH 8.5,25℃).结论KF-950对人精子顶体蛋白酶具有很强的抑制作用.     

一种新型高效的顶体酶抑制剂──KF－950

本文的目的是研究ＫＦ－９５０对人类精子顶体酶活性的抑制关系。我们采用明胶薄膜底物法检测不同浓度的ＫＦ－９５０对人精子顶体酶活性的抑制程度。实验发现：ＫＦ－９５０是一种很强的精子顶体酶抑制剂，其ＥＤ５０为４．４１１８×１０－９ｍｇ／ｍｌ，比标准的顶体酶抑制剂ＴＬＣＫ的抑制能力强１万余倍。     

附睾蛋白酶抑制剂对前列腺特异性抗原活性的抑制作用

目的 观察附睾蛋白酶抑制剂(Eppin)是否抑制前列腺特异性抗原(PSA)酶活性.方法 利用分子克隆技术体外构建、表达、纯化重组Eppin和PSA.利用PSA水解变色底物S-2586的颜色变化,于分光光度计下测定其吸光度值,代表PSA酶反应速度,反应体系是在缓冲液0.1 mol/LTris-HCl,pH8.3,1.0 mol/L NaCl中进行,观察不同浓度Eppin的加入对PSA酶反应速度的影响.结果通过体外重组技术获得较高纯度和生理活性的Eppin和PSA,通过PSA水解变色底物S-2586的检测,重组PSA具有酶活性,0.3 μmol/L PSA与底物S-2586反应的饱和曲线分析显示Km(反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度)值是0.5 μmol,底物饱和浓度0.2 mmol/L,分别加入4中不同浓度的重组Eppin 0、0.56、1.16、2.32 μmol/L,随着Eppin浓度的增加,PSA水解其变色底物S-2586速度明显减慢,PSA活性越来越受到抑制.结论 附睾蛋白酶抑制剂(Eppin)是前列腺特异性抗原(PSA)一种新的特异性抑制剂.

Abstract：

Objective To investigate the inhibitory effects of the epididymal protease inhibitor (Eppin) on the activity of prostate specific antigen (PSA).Methods Recombinant Eppin and recombinant PSA were produced by molecular cloning technique in vitro.The enzymatical analysis of Eppin inhibiting PSA was done in the reaction buffer 0.1 mol/L Tris-HC1,pH 8.3,1.0 mol/L NaCl.The hydrolysis of velocity of PSA to the chromogenic substrate S-2586 was detected by spectrometer.Results Recombinant Eppin and PSA with high purity were produced by molecular cloning technique.The recombinant PSA had the enzymatical activity by hydrolyzing its substrate S-2586.0.3μmol/L PSA and the substate S-2586 reaction to the saturation curve analysis showed that Km( response rate of half the maximum reaction rate when the substrate concentration) value was 0.5μmol,and substrate saturated concentration was 0.2 mmol/L.With the increases of Eppin (0,0.56,1.16,2.32μmol/L),the hydrolysis velocity of PSA to S-2586 was slowed down.Conclusion Eppin,as a new inhibitor,specifically inhibits the activity of PSA.     

明胶法测定精子顶体酶活性的研究

目的:探讨明胶底物膜法测定精子顶体酶活性相关技术的改进和质量控制.方法:①采用传统方法100℃溶解明胶,56℃铺片和改良方法50C溶解,35℃铺片分别得100张明胶片,对比明胶片的质量.②比较不同密度精液在35张明胶片上涂片的试验结果,寻找合适的涂片密度.③比较新鲜胶片和储存2周的胶片在顶体酶释放阳性率和平均晕环直径两方面实验结果上的差异.结果:①改良方法和传统方法制得的胶片在合格率方面P<0.05,差异有统计学意义.②密度(7～13)×106//ml范围的精液涂片后试验结果疏密均匀.③新制和储存2周的明胶片在顶体酶释放阳性率、顶体酶释放平均晕环直径的比较中,均P>0.05,差异无统计学意义.结论:经过改进明胶片的制作方法和对精液密度方面进行质控后,明胶底物膜法在实验结果上更可靠;明胶片能够储存使实验操作简便化,更能适合临床的应用.     

新型基质金属蛋白酶抑制剂LY52对肝癌细胞株MMPs表达及体外侵袭能力的影响

目的探讨新型基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂LY52对人肝癌细胞HepG2中MMPs表达及细胞侵袭能力的影响。方法应用MTT比色法观察不同浓度的LY52作用不同时间对HepG2细胞增殖的影响;应用明胶酶谱分析方法观察不同浓度的LY52作用24h对HepG2细胞分泌MMPs的影响,并进一步应用Western blot法检测HepG2细胞中MMP-2蛋白的表达;应用侵袭小室检测不同浓度LY52作用后HepG2细胞侵袭能力的改变。结果在较低药物浓度(200μg/ml)下,LY52对HepG2细胞无明显抗增殖作用或毒性作用;明胶酶谱分析及Western blot检测结果提示LY52能够显著抑制人肝癌细胞HepG2中MMP-2的表达及活性,其抑制效果呈剂量依赖性逐渐增强;随LY52药物浓度的增加,其抑制肝癌细胞侵袭能力也逐渐增强。结论 LY52能够通过抑制MMP-2的活性及表达,抑制肝癌细胞HepG2的侵袭能力;LY52可作为一种有潜力的抗肿瘤侵袭药物值得进一步研究。     

NO通过人精子顶体酶对顶体反应的影响

目的探讨NO通过精子顶体酶(acrosin)对项体反应(acrosome reaction,AR)的影响。方法采用BAEE/ADH法测定精子顶体酶的活性,以及通过FITC-PSA法检测精子顶体反应。结果NO供体SNP可诱导人精子表达顶体酶活性,同时促进入精子顶体反应；顶体酶抑制剂TLCK能抑制顶体酶活性,并可抑制SNP诱导的人精子顶体反应。结论NO可能通过调节人精子顶体酶的活性而诱导精子的顶体反应。     

人精子tPA和PAI-1的测定及精子上tPA的定位研究

目的 :人精子上组织型纤溶酶原原激活因子 (tPA)的分布及精子中tPA、纤溶酶激活物抑制因子 (PAI 1)活性研究。　方法 :应用底物显色法测定 6 1例人精子中tPA及其PAI 1的活性 ,其中正常对照组 2 0例 (已婚生育男子 ,经 2次精液分析正常者 ) ,少弱畸精症组 41例 ;用免疫组化法进行精子表面膜上tPA定位分析。　结果 :正常对照组精子中tPA和PAI 1的活性分别为 (0 2 4± 0 0 4)IU/ 10 6精子和 (0 2 3± 0 0 3)AU/ 10 6精子 ,少弱畸精症组的tPA和PAI 1活性分别为 (0 12± 0 0 3)IU/ 10 6精子和 (0 35± 0 0 9)AU/ 10 6精子 ,经分析二者之间有极显著差异 (P <0 0 1) ;tPA主要分布在精子的顶体膜、赤道板、颈部和尾部。　结论 :正常健康人精子中的tPA和PAI 1活性有别于弱精症者 ,提示精子上的tPA和PAI 1活性可能与精子活力、精子形态以及精子数有关 ;精子的顶体膜、赤道板、颈部及尾部存在着tPA ,推测其与精子运行、获能等有关。     

蛋白激酶C对精子活力和顶体反应的影响

蛋白激酶C(PKC)位于精子头部赤道段和尾部主段。外源性PKC激动剂可增强精子鞭毛的活力 ,而PKC抑制剂如癌基因抑活药 (staurosporine)则能抑制这种作用。精子中PKC的含量与精子活力呈显著正相关 (r =0 .9,P <0 .0 0 1)。精子与透明带 (ZP)结合刺激顶体反应的发生 ,导致顶体释放多种水解酶以及精子暴露出新的膜区域。ZP与精子质膜上的受体结合后 ,可以调节腺苷酸环化酶 (AC)的活性 ,使cAMP浓度升高并激活蛋白激酶A(PKA)。PKA能激活位于顶体外膜的电压依赖性钙通道 ,后者使顶体内部的Ca2 + 释放至胞质中 ,磷脂酶C(PLC)因Ca2 + 浓度升高而激活并水解磷脂酰肌醇二磷酸 ,其水解产物激活PKC ,后者使精子质膜上电压依赖性钙通道 (L型 )开放 ,胞质中第二次较大幅度Ca2 + 浓度的上升导致质膜溶解及顶体反应发生。推测PKC参与调节精子的活力和顶体反应     

60KD的精子膜抗原对抗精子抗体阳性精子顶体酶活性的影响

目的观察60KD精子膜抗原对抗体阳性精子顶体酶活性的影响。方法用全胶电洗脱结合连续电洗脱的方法提取60KD精子膜抗原,使用60KD精子膜抗原体外处理抗精子抗体阳性精子。精子顶体酶活性的检测采用固定明胶底物薄膜法。结果抗精子抗体阳性精子经60KD抗原处理后,精子的凝集率由处理前的(35.115.1)%下降到了(13.03.3)%(P<0.001)。精子顶体酶阳性反应率由处理前的(30.37.3)%升高到(56.49.1)%(P<0.001)。结论60KD精子膜抗原可以有效去除精子结合的抗体,并提高精子的顶体酶活性。     

白藜芦醇对环磷酰胺诱导的人精子氧化损伤的保护作用乜照燕1,张亚楠2,花蕊2,陈丽君1,李亮1,吴海峰

目的 探讨白藜芦醇(RES)对环磷酰胺诱导的人精子氧化损伤的保护作用。方法 收集2018年1月至4月在河北医科大学第四医院生殖医学中心就诊男性患者的正常精液标本。将用密度梯度离心法处理后的正常精液标本用不同浓度(0、1.0、2.5、5.0、7.5μmol/L)环磷酰胺活性代谢产物4-过氧化氢环磷酰胺(4-HC)对精子进行体外毒性试验,继续培养24h,通过精子活力和精子存活率筛选4-HC作用半抑制浓度(IC50)。将处理后的正常精液用不同浓度RES(5、10、25、50、75μmol/L)预处理2h,再加入IC50浓度4-HC,测定精子活力和精子存活率选择RES最佳保护浓度。选择4-HC和RES浓度后,该实验分为四组:对照组(CON)、环磷酰胺组(4-HC)、环磷酰胺+白藜芦醇组(4-HC+RES)、白藜芦醇组(RES),检测各组精子活力、活率、氧化应激指标以及精子凋亡指标。结果 随4-HC浓度增加,精子活力和存活率降低,呈剂量依赖关系,依据IC50,2.5μmol/L4-HC为后续实验药物浓度。RES预处理后,精子活力和精子活率均得到改善,50μmol/L RES效果最佳,确定为后续实验药物浓度。结果显示:4-HC组较CON组,精子活力和存活率下降,氧化应激水平上升,精子凋亡增加,4-HC+RES组与4-HC组相比精子活力和存活率升高,氧化应激水平降低,精子凋亡降低。结论 RES可以减少化疗药物导致的精子氧化应激水平增加,能预防和缓解化疗药物对人精子造成的损伤。     

全身应用白介素-4并发急性胃粘膜损害

白细胞介素-4(IL-4)是由 CD~(3+),淋巴细胞分泌的一种多效性淋巴因子,它能抑制白细胞介素-2(IL-2)诱导的 T 细胞繁殖及其杀伤活性,促进已被抗原激活的 T 细胞的繁殖,并增加被 IL-2激活的大颗粒淋巴细胞非特异性溶解活性。人们用 IL-4这些特点治疗晚期肿瘤患者。作者曾报道,联合应用 IL-2和 IL-4有治疗晚期肿瘤的作用,但单独应用 IL-4无此作用。本文报道 IL-4诱发胃窦溃疡或糜烂。观察结果表明,免疫制剂如 IL-2和 IL-4能改变胃粘膜的完整性。     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞中蛋白激酶C活性和白细胞介素-15分泌、表达的影响及其临床意义

目的 通过研究三氧化二砷(As2O3)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中蛋白激酶C(PKC)活性和白细胞介素(IL)-15表达和分泌的影响,探讨内皮细胞在As2O3抑制白血病或肿瘤中的作用。方法用不同浓度的As2O3作用于培养的HUVEC细胞,测定其生长情况、胞膜和胞浆PKC活性以及对IL-15基因表达和分泌的影响。结果0.25 μmol／L~50 μmol／L的.As2O3均抑制HUVEC细胞的增殖(P<0.01),随着药物浓度或作用时间的增加,细胞逐渐死亡。在As2O3作用细胞4 h测定胞浆和胞膜的PKC活性,两者在不同浓度作用下活性水平均得到提升(P<0.01),但胞膜的活性上升幅度更大。在As2O3的测定浓度范围内,PKC的活性水平与As2O3的浓度呈正相关。1、5、16 μmol／L的As2O3导致IL-15基因表达和分泌水平的增加(P<0.01),并呈浓度依赖性关系。结论As2O3可能是通过激活内皮细胞的PKC活性,促进IL-15或其他细胞因子的分泌,来抑制白血病或肿瘤发展的。     

γ-氨基丁酸对抗精子抗体阳性患者精子顶体反应的影响及机制探讨

目的 研究γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)对正常人类精子及抗精子抗体(AsAb)阳性精子顶体反应的影响及其机制。方法 两组各18例采用三色染色法检测精子顶体反应率。结果 GABA增加正常及AsAb阳性患者精子顶体反应率,与对照组比较,差异显著(P<0.01);GABA可使精子的Na~ —K~ —ATPase,Ca~(2 )—ATPase的活性增加(P<0.01;P<0.05);并且显著减少精子中的MDA含量(P<0.01),抑制氧自由基的产生。结论 GABA可明显提高正常人及AsAb阳性患者精子顶体反应。     

活性钙改善不育者精子质量的临床观察

本研究应用活性钙治疗精子质量异常的男性不育者，治疗前后采用精液常规检查，多次曝光法测定精子前向运动速度，底物膜法测定精子顶体蛋白酶活性，以及血清钙，精浆钙浓度等，并按照随机分组及双盲的原则对精子质量进行对照观察研究。结果表明活性钙能明显增加血清钙和精浆钙浓度，全面改善和提高精子质量，并有促进生精功能作用，尤其对男性不育者中精子顶体酶活性异常，活性钙有明显增强酶活性的作用     

KF-950对人精子顶体素活性及顶体的影响

目的 :研究顶体素抑制剂 4 胍基苯甲酸盐 (KF 95 0 )对人精子顶体素的抑制作用和对顶体的影响。　方法 :醋酸抽提并纯化人精子顶体素 ,BAEE/ADH法测定不同剂量KF 95 0作用后残余酶的活性。以生物素标记的豌豆凝集素为探针 ,采用ABC染色法观察KF 95 0对完整精子顶体的影响。　结果 :①正常人精子顶体素活性为(37.6 5± 4 .4 7)U/L(pH 8.5 ,2 5℃ ) ;②残余酶活性与KF 95 0剂量呈负相关 (r =- 0 .998) ,并呈量 效依赖关系 ,回归方程 :Y =7.5 7- 1.895X ;③随药物浓度的增加和作用时间的延长 ,顶体完整着色率均明显下降 (P <0 .0 1)。结论 :KF 95 0能直接抑制顶体素活性 ,推测对精子顶体也有明显的破坏作用 ,是一种新型、高效的精子顶体素抑制剂。     

精子DNA冷冻损伤易感性与精子活动力相关性

目的研究不同活动力精子其核DNA对冷冻损伤的易感性。方法选取来本中心行精液常规分析,精子浓度5×106/ml、精子正常形态率4%者63例为研究对象。精子冷冻前后均采用染色质扩散(SCD)实验分析核DNA完整性,分别比较高活力组(d级30%,n=28)及低活力组(d级≥30%,n=35)精子在冷冻前后DNA完整性的差异。结果精液标本(n=63)经冷冻后,精子DNA碎片指数(SDF)较冷冻前显著升高[(23.1±12.5)%vs.(19.9±11.6)%,P0.05],其中代表精子DNA完整性较好的大晕轮精子比例显著降低[(71.9±13.3)%vs.(75.8±12.2)%,P0.05],而小晕轮精子比例则显著升高[(10.2±5.7)%vs.(8.2±3.9)%,P0.05]。在低活力组,精子SDF及大晕轮、小晕轮精子比例在冷冻前后亦差异显著(P0.05);而在高活力组,冷冻后仅小晕轮精子比例较冷冻前显著升高[(8.3±3.4)%vs.(6.8±3.0)%,P0.05],SDF及大晕轮、中晕轮、无晕轮的精子比例在冷冻前后均无显著差异(P0.05)。结论相比高活力组精子,低活力组精子核DNA冷冻耐受力较差,更易受损。     

γ-氨基丁酸对胆管癌细胞株QBC_(939)增殖和侵袭转移的影响

目的 观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞株QBC_(939)增殖、凋亡和侵袭转移的影响.方法 取GABA母液,用含10%胎牛血清的1640培养液稀释,配成浓度为1、10、100、1000μmol/L为实验组;对照组仅加入与实验组相同体积的完全培养液.采用MTT比色法观察GABA对人胆管癌细胞株QBC_(939)增殖的作用,流式细胞仪检测GABA对胆管癌细胞株QBC_(939)凋亡的影响,Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,明胶酶谱法分析GABA对胆管癌细胞株QBC_(939)分泌的基质金属蛋白酶(MMP)活性的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量.采用单因素方差分析.结果 GABA浓度由1 μmol/L增至1000 μmol/L,GABA对胆管癌细胞的抑制率由2.6%增至26.8%;细胞凋亡率由4.80%±0.04%增至28.03%±0.01%;穿透Matrigel胶的能力由(60±10)个减至(43±4)个,均呈剂量依赖性(F=7.833,83.765,7.598,P<0.05).同时胆管癌细胞分泌的MMP-2和MMP-9活性下降,cAMP含量增加,与对照组比较差异有统计学意义(F=9.507,9.148,27.418,P<0.05).结论 GABA可能通过受体后信息介导途径,诱导细胞凋亡,并减弱胆管癌细胞株QBC_(939)的侵袭转移能力,可能与其抑制基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性有关.     

血小板活性因子对人精子的体外获能作用

本文应用浊度分析法,放射免疫法和Lectin染色法研究了血小板活性因子对人精液中快速运动相精子的平均运动速度(VRM)。精子内cAMP含量和顶体反应的影响。结果表明,经血小板活性因子作用后,精液中快速运动相精子的平均运动速度,精子内cAMP含量及顶体反应率均增加。因此,本文认为,血小板活性因子具有使人类精子体外获能的作用。