人肿瘤坏死因子α联合溴隐亭对人肝癌裸鼠耐药模型耐药性逆转的研究

目的探讨人肿瘤坏死因子α(TNFα)联合溴隐亭(BCT)对人肝癌裸鼠耐药模型耐药性的逆转作用。方法将人肝癌细胞系HepG2及其经阿霉素(ADM)诱导建立的耐药细胞系HepG2ADM和转染TNFα基因后的耐药细胞系HepG2ADMTNFα分别原位种植BALB/C裸鼠肝脏,建立裸鼠原位肝移植瘤模型。64只裸鼠分为4组:HepG2组(HepG2细胞系种植瘤裸鼠),ADM组(HepG2ADM细胞系种植瘤裸鼠),TNFα组(HepG2ADMTNFα细胞系种植瘤裸鼠)和BCT组(HepG2ADMTNFα细胞系种植瘤裸鼠同时口服BCT),成瘤后均给以每天腹腔内注射0.15g/kg的氟脲嘧啶+1.5mg/kg的丝裂霉素+10mg/kg的ADM,连续3d;BCT组化疗的同时另行BCT灌胃治疗(6.25mg·kg-1·d-1)。B超观察种植瘤的大小变化,病理观察组织学结构及裸鼠生长状况和对化疗药物的敏感性。采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测各组种植瘤的多药耐药相关基因(MDR1)和肺耐药相关蛋白(LRP)在mRNA水平、蛋白水平的变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测化疗后肿瘤组织凋亡指数情况。结果细胞系原位种植裸鼠肝脏成功率100%,种植瘤组织学特点符合人肝癌特征;TNFα组和BCT组种植瘤生长速度慢,与HepG2和ADM两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。化疗14d后,BCT组重量抑瘤率(67%)最明显,与HepG2、TNFα和ADM3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4组均有MDR1和LRPmRNA表达,组间差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化显示TNFα和BCT组肿瘤组织MDR1蛋白表达比ADM组低,差异具有统计学意义(P<0.01),与HepG2组比较差异无统计学意义(P>0.05);BCT、TNFα组凋亡指数比ADM组高(P<0.05),且TNFα和BCT两组之间差异亦有统计学意义(P<0.05),但与HepG2组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论TNFα基因能下调MDR1和LRPmRNA及蛋白表达,联合BCT能加强对化疗药物的敏感性。     

缺氧诱导因子-1αsiRNA增强耐药肝癌细胞的化疗敏感性

目的 观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）特异性小分子干扰RNA（siRNA）对肝癌化疗的增敏作用。方法 构建HIF-1αsiRNA真核表达质粒，经脂质体稳定转染于耐药的C28肝癌细胞。研究分为实验组、阴性对照组和空白对照组。荧光定量PCR和Western blot技术分别检测3组细胞中多药耐药相关基因MDR1、LRP、MRP1在mRNA和蛋白水平的表达，PI法流式细胞术分析3组细胞在受到5-Fu作用后的凋亡指数。每组细胞分别随机注入10只裸鼠皮下，比较3组细胞成瘤后对ADM治疗的反应性。结果 HIF-1αsiRNA能有效抑制HIF-1α基因的表达，并能使C28耐药肝癌细胞内MDR1、MRP1、LRP基因在mRNA和蛋白水平表达明显下降。在5-Fu作用后第24、48、72小时，实验组细胞的凋亡指数分别是阴性对照组的2．88、3．56和3．87倍，实验组对化疗药物5-Fu的敏感性显著增强（P〈0．01）。注射阿霉素后，实验组裸鼠皮下的耐药肝癌瘤体明显缩小，肿瘤抑制率为41．35％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 成功构建了HIF-1α—siRNA的真核表达质粒。HIF—1α靶序列特异性的siRNA可增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性，它与传统化疗药物的联合应用可望实现对肝癌的有效治疗。     

肿瘤坏死因子α逆转人肝癌多药耐药性的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子α（TNFα）作为多药耐药（MDR）逆转剂,特别是作为多重MDR逆转剂的作用及其机制。方法用本单位建立的肝癌SMMC7721MDR亚系作为MDR模型,用MTT法观察TNFα对MDR的逆转作用,用RT－PCR、流式细胞术观察TNFα对MDR基因表达的影响。结果TNFα对mdr1、LRP、GSTP1和TopoⅡα基因介导的耐药性逆转率为87．52％～100％,对MRP基因介导的耐药性无逆转作用,对多重MDR细胞耐药性的逆转率为76．28％～100％。TNFα对mdr1、LRP、和GSTP1基因的表达有下调作用,对TopoⅡα基因的表达有上调作用,对MRP基因的表达无影响。结论体外细胞实验证实TNFα为多重MDR逆转剂。     

肿瘤坏死因子α对人肝癌多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对体外培养的人肝癌耐阿霉素细胞系（HepG2／ADM）多药耐药现象的逆转作用。方法不同浓度（100、500及2500U／ml）TNF-α作用于HepG2／ADM细胞72h后进行以下试验：用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测各组多药耐药相关基因（MDR1）及脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）基因的mRNA表达情况;用罗丹明外排法检测各组P-糖蛋白活性;用Annexin V检测0．5mg／L阿霉素诱导的各组细胞凋亡情况;利用MTF法检测各组耐药性的改变。结果TNF-α能诱导HepG2／ADM细胞的MDR1基因表达下调,PPAR-α基因表达上调,且能增加阿霉素诱导的凋亡细胞的比例及细胞毒作用。结论TNF-α可能分别通过抑制MDR1表达及促进PPAR-α表达而逆转HepG2／ADM细胞的耐药性。     

肿瘤坏死因子α逆转入肝癌多药耐药性的实验研究

目的 探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）作为多药耐药（ＭＤＲ）逆转剂,特别是作为多重ＭＤＲ逆转剂的作用及其机制,方法 用本单位建立的肝癌ＳＭＭＣ７２２１ＭＤＲ亚系列作为ＭＤＲ模型,用ＭＴＴ法观察了ＴＮＦα对ＭＤＲ的逆转作用,用ＲＴ－ＰＣＲ,流式细胞术观察ＴＮＦα对ＭＤＲ基因表达的影响,结果ＴＮＦα对ｍｄｒ１,ＬＲＰ,ＧＳＴＦ１和ＴｏｐｏⅡα基因介导的耐药性逆转率为８７．５２％－１００％,对ＭＲＰ基因介     

肿瘤坏死因子-α基因抑制耐药性人乳腺癌细胞的研究

目的 观察肿瘤坏死因子－α（TNF-α)基因对耐药细胞生长的抑制作用及机制。方法 以重组逆转录病毒为载体将TNF－α基因导入耐药性人乳腺癌细胞系MCF7／ADR，获阳性克隆MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2。体外观察并比较野生型和转基因癌细胞的生长速度，流式细胞仪分析细胞周期的变化。端粒酶重复扩增实验（TRAP）综合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银梁法测定端粒酶活性的变化。结果 MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2细胞中有TNF－α基因的整合和表达，病毒上清中TNF－α含量分别为1737μg/L（10^6个细胞／48h）、2875μg/L。与阴性对照细胞相比，MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2细胞的生长速度明显减慢，生长抑制率分别为32.4%、54.8%，细胞周期阻滞于S＋G2／M期，端粒酶活性降低。结论 外源性TNF－α基因的导入能有效抑制耐药细胞，阻滞细胞周期、抑制端粒酶活性可能为其主要机制。     

槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合中药槐耳清膏对肝癌细胞株HepG2及肝癌耐阿霉素（ADM）细胞株（HepG,．ADM）的作用。方法通过培养液中ADM的浓度梯度递增法筛选培养,建立肝癌细胞HepG2-ADM耐药细胞株;TRAIL,TRAIL＋ADM,TRAIL＋槐耳清膏分别处理肝癌细胞株HepG2、HepG,-ADM及正常肝细胞株L02,噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果联合用TRAIL（100ng／L）和槐耳清膏（1．0g／L）处理肝癌细胞株HepG2-ADM及肝细胞株L02,MTT显示对前者增殖有明显抑制作用,而对后者无明显作用;流式细胞仪检测TRAIL联合槐耳清膏处理HepG2、HepG2-ADM,可诱导细胞凋亡,与其他组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论槐耳清膏可显著增强TRAIL对HepG2及HepG2-ADM的杀伤作用,而对正常胎肝细胞株L02杀伤作用轻微,TRAIL和槐耳清膏联合应用可望克服肿瘤细胞中存在的化学治疗药物耐药和TRAIL耐受问题。     

肿瘤坏死因子α对膀胱肿瘤细胞作用的影响因素探讨

目的 探讨肿瘤坏死因子抗膀胱癌细胞作用的影响因素。方法 将肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）和不同浓度的丝裂霉素（ＭＣ），顺铂（ＣＤＤＰ）以及干扰素α（ＩＦＮ－α）作用于体外培养的膀胱癌细胞系ＢＩＵ－８７，用噻唑蓝（ＭＴＴ）法测定细胞毒效果。结果 ＴＮＦ－α对ＢＩＵ－８７细胞有明显的浓度依赖性抑制作用，ＭＣ（２．５～５．０ｍｇ／Ｌ）或ＩＦＮ－α（２５００Ｕ－５０００Ｕ／ｍｌ）与ＴＮＦ－α（１００００Ｕ／     

肝脏肿瘤动脉灌注化疗栓塞术联合重组人肿瘤坏死因子治疗肝脏肿瘤

目的 观察肿瘤坏死因子(TNF)联合肝脏肿瘤动脉灌注化疗栓塞术(TACE)治疗肝脏肿瘤的疗效以及对外周TNF-β的mRNA的表达影响.方法 将肝细胞癌(HCC)患者分为2组,单纯TACE治疗者48例为对照组,联合重组人TNF治疗者30例为实验组.通过肝脏增强CT测量比较肿瘤体积大小.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测血液中TNF-β的mRNA的表达,半定量比较两组之间TNF-β表达水平的高低.结果 术前两组之间肿瘤体积大小和TNF-β的mRNA表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05),术后30 d实验组肿瘤体积(18.44±3.46)明显小于对照组(23.36±4.11),差异有统计学意义(P＜0.05)实验组血液中TNF-β的mRNA的表达(0.58±0.18)明显高于对照组(0.47±0.14),差异均有统计学意义(P＜0.05).60 d时两组间TNF-β的mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TNF联合TACE对HCC疗效好于单一TACE治疗,其同时可以刺激外周TNF-β的表达发挥更好的抗肿瘤作用.     

溴隐亭逆转临床肝癌患者多药耐药性研究

目的利用溴隐亭逆转人肝癌化疗耐药性。方法78例未经任何治疗的原发性肝癌患者先后行2次^99m Tc-甲氧基异丁基异腈(MIBI)单光子发射计算机断层显像(SPECT)检测，经外周静脉注射20mCi ^99m Tc—MIBI后15和120min行平面显像半定量分析肿物部位的摄取比值(UR)第1次SPECT检测后口服溴隐亭2．5mg／次，3次／d，连续3d后进行第2次SPECT检测，两次检测结果进行对照比较。结果68例肝癌患者^99m Tc—MIBI SPECT肿瘤无MIBI摄取。10例患者^99m Tc—MIBI SPECT肿瘤部位有MIBI摄取。经溴隐亭治疗后所有肿瘤MIBI排空者均出现99^m Tc—MIBI浓聚。结论溴隐亭作为一种新型逆转剂可有效逆转临床肝癌患者的多药耐药性。     

裸鼠原位肝细胞癌多药耐药模型的建立

目的建立裸鼠原位肝癌多药耐药模型。方法分别在开腹直视下将人肝癌细胞系 HepG2和多药耐药细胞系HepG2／ADM两种细胞种植于裸鼠的肝包膜下建立原位肝细胞癌多药耐药动物模型。用B超、剖腹探查检测两组肝脏肿瘤生长情况。利用长链PCR技术对耐药细胞系 HepG2／ADM和相应种植瘤组织MDR1基因全长进行扩增并测序,再分别用RT—PCR、免疫组化、 Western blotting方法检测两组肿瘤耐药基因MDR1mRNA和P—gp蛋白的表达。结果原位肝脏种植肿瘤成瘤率均为100％(30／30),耐药诱导成功率为95％(19／20);用长链PCR技术对耐药细胞系 HepG2／ADM和相应种植瘤组织进行MDR1基因扩增,均能扩增出全长为3．8 Kb的基因条带,双向 DNA测序结果均与Genebank报道一致。耐药组MDR1mRNA和P-gp蛋白的表达均明显高于对照组 (t1=3．72,t2=2．98,P<0．01)。耐药组P-gp蛋白表达为(42．6±1．7)％远高于对照组(2．6± 0．1)％,差异有统计学意义(t=6．43,P<0．01)。结论成功建立肝癌多药耐药动物模型并且为研究肝癌多药耐药逆转提供基础。     

反义寡脱氧核苷酸逆转人肝癌多药耐药性的实验研究

目的：探讨坂义寡脱氧核苷酸（ASPODNs)对人肝癌多药耐药基因（MDR）的逆转作用,方法：ASPONs作用于肝癌MDR细胞模型后,用MTT法检测其逆转作用,用逆转录PCR和流式细胞术检测其对4种MDR基因表达的影响,结果：ASPODNs抑制DR基因的表达存在时间－效应和剂量－效应关系,对单基因MDR细胞药性的逆转率为90．26％－100％,对多重MDR细胞耐药性逆转率70．09％－100％,结论：多种ASPODNs联合逆转多重MDR具有可行性并取得明显效果。     

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的 检测小干扰RNA(siRNA)对肝癌耐药细胞株HepG2/阿霉素(ADM)多药耐药相关蛋白基因2(MRP2)及其蛋白产物的抑制作用,观察对多药耐药性的影响.方法 使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株(HepG2/ADM),ADM浓度从0.1～2.0 m/L:设计合成针对MRP2的siRNA小片段,转染HepG2/ADM耐药细胞,24 h后通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果;噻唑蓝(MTT)比色法观察抑制MRP2基因表达后,HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性变化,并计算各药物的半数抑制浓度(IC50).结果 HepG2/ADM对ADM、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0.3204、3.8002、0.2014和0.1221;siRNA明显抑制了HepG2/ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);转染MRP2-siRNA后,HepG2/ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小,分别为0.1023、1.4417、0.0452和0.0268.结论 用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2/ADM细胞对化疗药物的耐药性,MRP2基因与HepG2/ADM肝癌细胞的多药耐药性相关,可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性.     

TRAIL联合顺铂诱导肝癌细胞HepG2凋亡的研究

目的 探讨顺铂增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制，提供TRAIL应用肝癌临床治疗的一种新的用药模式。方法 以肝癌细胞HepG2为研究对象，应用流式细胞仪分析顺铂联合应用TRAIL对细胞周期的影响，Western blot检测顺铂作用前后HepG2细胞在TRAIL诱导凋亡过程中Caspase-8、Caspase-3、DR4、DR、DcR，c—FLIP及RIP的表达变化。结果 顺铂能够增强TRAIL诱导HepG2细胞凋亡的能力，两者联合应用具有明显的协同作用，顺铂预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加DR的表达。结论 TRAIL联合顺铂可以诱导肝癌细胞HepG2凋亡，其机制是通过下调c-FLIP及RIP的表达，解除Caspase-8受抑，恢复凋亡信号的传导来实现的。死亡受体D＆的表达上调也可能参与了这一变化过程。     

单基因人肝癌耐药细胞株(HepG2/MRP1)的构建及其生物学意义

目的 对抗肿瘤药的天然耐药和化疗过程中产生的继发性耐药是肝癌化疗敏感性差的重要原因之一,为探讨体外逆转肝癌多药耐药(muhidrug resistance,MDR)的新方法,笔者建立了单因素人肝癌细胞多药耐药模型HepG2/mrp1,并研究其牛物学特性.方法 双酶切克隆质粒pGEMmrp1获得人全长多药耐药相关蛋白基因(mrp1),并将其插入哺乳动物表达载体pCI-neo的多克隆位点,构建重组载体,利用质脂体法将重组载体转入人肝癌细胞HepG2,建立单基因耐药细胞株HepG2/mrp1.观察细胞的生长规律;MTT法检测其多药耐药性;流式细胞仪检测细胞表面多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)的表达;RT-PCR检测MRP1 mRNA表达量.结果 与HepG2细胞相比较,HepG2/mrp1细胞的倍增时间延长30.86 h.该细胞对多种抗肿瘤药耐药,HepG2/mrp1对阿霉素和柔红霉素的耐药指数比亲本细胞增加了11.4倍和8倍,细胞表面MRPl的表达明显增加,mrp1 mRNA明显增加.结论 HepG2/mrp1细胞稳定高表达MRP1,具有多药耐药性,为进一步研究肝癌的多药耐药构建了一个技术平台.     

手术切除及经门静脉免疫化疗治疗肝细胞癌合并门静脉癌栓

目的 评估对肝癌合并门静脉癌栓患者实施手术切除联合术后门静脉化疗加免疫治疗的临床效果.方法 采用随机化前瞻性临床试验方案,选取术后确诊为肝癌合并门静脉主干及第一级分支癌栓患者随机纳入研究组和对照组,行肿瘤切除＋癌栓取出术,研究组术后经门静脉途径行PIAF（5-FU、阿霉素、顺铂,α-IFN）方案化疗,对照组术后仅行常规治疗.随访观察复发或转移情况,进行统计分析.结果 研究组与对照组比较,研究组中位生存时间较对照组明显延长（12.5个月vs.7.0个月,P=0.0073）;Cox多因素分析显示治疗方法选择（是否化疗）是影响患者生存率的独立预后因素.研究组肿瘤中位复发时间较对照组延长（7.0个月vs.3.0个月,P=0.0089）;Cox多因素分析表明仅治疗方案的不同（手术后化疗与否）和AFP值对患者的复发有显著影响（P＜0.05）.结论 HCC合并PVTT患者,行肿瘤切除＋癌栓取出术,手术后辅以经门静脉＋皮下的PIAF免疫化疗是有效治疗HCC合并PVTT患者的综合疗法.     

多药耐药基因转染对肝癌小鼠大剂量化疗支持作用

目的观察多药耐药（MDR1）基因保护骨髓进行大剂量化疗杀伤肿瘤及在体内表达情况。方法BALB／C小鼠H22肝癌模型，^60Co-γ照射，移植转染MDR1的骨髓造血细胞后化疗，计数白细胞，测定瘤体大小；外周血、骨髓、脾、肿瘤等行P-糖蛋白免疫组织化学，流式细胞术以及MDR1RT-PCR。PCR检测。结果MDR1转染小鼠白细胞明显较高（P〈0．01），单纯骨髓移植小鼠白细胞前3周高于BC组，第4周后差异无统计学意义；化疗剂量较大抑瘤率高。MDR1转染后肿瘤组织无P-糖蛋白表达；外周血，肾PCR检测有特异条带而RT-PCR检测未发现。结论MDR1保护骨髓支持大剂量化疗可抑制肿瘤生长。外源MDR1仅在骨髓有效表达。     

卡铂碳包铁纳米笼壳聚糖微球对人肝癌细胞株HepG2的影响

目的探讨卡铂碳包铁纳米笼壳聚糖微球（C-Fe@CN-CN）对人肝癌细胞株HepG2增殖和细胞周期的影响。方法应用反相微乳法制备C-Fe@CN-CN，采用噻唑蓝（MTT）法检测不同药物浓度（20、40、80、160mg／L）的C-Fe@CN-CN对HepG2细胞作用24、48、72h的生长抑制效应；流式细胞仪分析药物浓度为8、16mg／L，作用48h时细胞周期的改变。结果C-Fe@CN—CN对人肝癌细胞增殖有明显抑制作用，并呈剂量和时间依赖性。随剂量增加，24h抑制率由18．8％增至53．2％，随时间延长，抑制率由53．2％增至98．7％。微球作用24h时抑制效应低于原药。作用48h和72h时抑制效应等同于原药。C-Fe@CN-CN或原药作用48h后，肝癌细胞周期阻滞于S期（47．2％），随药物浓度增加，S期阻滞（59．3％）更加明显。空白微球对肝癌细胞增殖和细胞周期分布无影响。结论C-Fe@CN—CN在体外能有效地抑制肝癌细胞增殖，机制与原药相同。均为诱导S期阻滞。     

人肝癌HepG2多药耐药细胞系的部分生物学性状研究

目的　研究人肝癌多药耐药 (MDR)的机制 ,建立HepG2多药耐药细胞系并研究其部分生物学性状。方法　应用HepG2细胞系 ,通过培养液中阿霉素 (ADM )的浓度梯度增加法 ,得到肝癌多药耐药株HepG2 /ADM。Westernblot增强化学发光法 (ECL)检测细胞株表面多药耐药基因(MDR1)的表达产物P 糖蛋白 (P 170 )、多药耐药相关蛋白 (MRP)及肺耐药蛋白 (LRP)的表达水平。结果　耐药细胞的倍增时间延长 2 .0 5倍。该耐药模型的P 170表达水平较亲本细胞升高3 .90倍 (P <0 .0 1) ,但MRP及LRP无明显变化。结论　HepG2 /ADM同其亲本细胞相比 ,其耐药性、倍增时间有明显改变 ;多药耐药性主要与MDR1的高表达有关。