大鼠视神经损伤后Toll样受体4在视网膜中的表达

背景Toll样受体4（TLR4）是一种重要的免疫相关受体,在多种疾病的发生中起致炎作用。研究发现,视神经损伤后继发的炎症反应可进一步引起视网膜损伤,因此视神经损伤后TLR4的表达及其效应值得研究。目的研究大鼠视神经损伤后视网膜TLR4的表达情况。方法选取成年健康SPF级SD大鼠24只,按随机数字表法随机分为视神经损伤3d组和视神经损伤7d组。取大鼠右眼用视神经钳夹法制备视神经损伤模型,左眼不予处理为对照组。分别于视神经损伤后3d和7d用过量麻醉法处死大鼠并分离视网膜,采用免疫荧光法检测各组大鼠视网膜中TLR4的表达;分别采用逆转录PCR法（RT—PCR）和Westernblot法检测大鼠视网膜中TLR4mRNA及其蛋白的表达;采用TUNEL染色法观察各组大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡情况。结果视网膜免疫荧光法检测结果显示,TLR4在大鼠视网膜中呈绿色荧光,视神经损伤3d组和视神经损伤7d组造模眼视网膜中的荧光强度较对照组左眼均明显增强,绿色荧光主要分布在视网膜内层。RT—PCR法检测表明,模型眼视网膜损伤后3d和7d视网膜中TLR4mRNA相对表达量分别为2．92±0．06和3．92±0．12,对照眼TLR4mRNA的相对表达量分别为2．87±0．12和3．44±0．17,大鼠模型眼TLR4mRNA表达的灰度值较对照眼明显增加,差异均有统计学意义（t3d=-12．888,P〈0．001;t7d=-4．669,P=0．010）。Westernblot法检测显示,大鼠模型眼视网膜损伤3d和7d视网膜中TLR4蛋白的相对表达量分别为1．14±0．05和1．49±0．03,对照眼TLR4蛋白的相对表达量分别为0．99±0．09和1．38±0．07,模型眼视网膜中TLR4蛋白表达量明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t3d=-11．324,P〈0．001;t7d=-5．638,P=0．005）。TUNEL染色显示,模型眼RGCs凋亡数较对照眼增多。结论TLR4在视神经损伤大鼠视网膜内层的表达明显上调,提示TLR4通路可能参与RGCs的损伤。     

Toll样受体4及相关炎性细胞因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 观察糖尿病大鼠视网膜中Toll受体4（TLR4）、炎性细胞因子的表达水平以及视网膜中白细胞聚集与视网膜通透性改变。方法 Brown Norway大鼠120只,剔除自然死亡14只,随机分为实验组和对照组,每组均为53只大鼠。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型;对照组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。建模后4周行定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测,观察大鼠视网膜中TLR4的基因及蛋白表达,酶联免疫吸附试验测定大鼠视网膜匀浆上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性细胞水平;吖啶橙眼底血管造影观察视网膜中白细胞密度;伊凡思蓝（EB）检测视网膜通透性。结果 对照组、实验组大鼠视网膜TLR4 mRNA、蛋白表达量比较,差异均有统计学意义（F=1.606、0.789,P＜0.05）;视网膜匀浆上清液中MCP-1、IL-1β、TNF-α表达量比较,差异均有统计学意义（F=24.622、5.758、4.829,P＜0.05）。实验组、对照组大鼠视网膜中白细胞密度分别为（6.2±0.5）×10^-5、(2.2 ±0.3）×10^-5个细胞 /像素2,实验组大鼠视网膜中白细胞密度较对照组显著增加,差异有统计学意义（F=2.025,P＜0.05）。实验组、对照组大鼠视网膜EB渗漏量分别为（23.41±4.47）、（13.22±3.59） ng/mg,实验组大鼠视网膜EB渗漏量较对照组增加,差异有统计学意义（F=21.08,P＜0.05）。结论 糖尿病大鼠视网膜中TLR4及炎性细胞因子表达均显著提高;视网膜中白细胞密度和视网膜渗漏量增加。     

Toll样受体4对2型糖尿病小鼠视网膜病变的影响

目的　探讨Ｔｏｌｌ样受体４（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４,ＴＬＲ４）对２型糖尿病小鼠模型糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的影响。方法　取１６周龄的健康雄性ＴＬＲ４基因缺陷小鼠Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（ｍｕｔａｔｉｏｎ,Ｍｕｔ）及相应野生型小鼠Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（ｗｉｌｄｔｙｐｅ,ＷＴ）各１２只,用链脲佐菌素（ＳＴＺ）腹腔注射建立２型糖尿病动物模型,另取４只未处理小鼠做对照,分为Ｍｕｔ组、ＷＴ组与对照组。于模型建成后１个月、２个月、４个月分别取材,每个时间点模型组分别取材４只,对照组分别取１６周龄的两种小鼠各２只眼球。通过电镜观察小鼠视网膜组织超微结构的变化,并应用ＲＴ-ｑＰＣＲ检测视网膜ＴＬＲ４及巨噬细胞炎性蛋白２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ-２,ＭＩＰ-２）的ｍＲＮＡ表达。结果　糖尿病模型造模后１个月的超微电镜显示,小鼠视网膜组织即有神经节细胞及神经纤维水肿,核周间隙增宽,核固缩,胞浆颜色变淡;模型造模后２个月时毛细血管内皮细胞胞浆线粒体水肿,嵴变短,周细胞水肿;模型造模后４个月时基底膜节段性增厚,微绒毛突起,管腔狭窄,各时间点的病变ＷＴ组均重于Ｍｕｔ组。视网膜组织ＲＴ-ｑＰＣＲ结果显示,ＷＴ组和Ｍｕｔ组ＴＬＲ４及ＭＩＰ-２的ｍＲＮＡ的表达在糖尿病模型造模后１个月、２个月、４个月时依次上调（均为Ｐ＜０．００１）,各时间点ＴＬＲ４及ＭＩＰ-２的ｍＲＮＡ的表达以ＷＴ组强于Ｍｕｔ组（均为Ｐ＜０．０５）。结论　２型糖尿病小鼠模型中,随病程发展出现视网膜病变并不断恶化,此过程中视网膜中ＴＬＲ４与ＭＩＰ-２的ｍＲＮＡ表达呈显著性上调趋势;ＴＬＲ４基因突变小鼠的视网膜ＴＬＲ４及ＭＩＰ-２的表达比野生型小鼠减弱,同时视网膜病变减轻。     

高血糖对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 通过观察大鼠视网膜病理改变,从组织病理学角度揭示高血糖对大鼠视网膜神经节细胞的影响。方法 将100只大鼠分为对照组10只和糖尿病组90只。糖尿病组用链脲佐菌素造模,9个月后通过组织化学法观察高血糖对观察组大鼠视网膜内层神经节细胞的影响。结果 糖尿病组大鼠视网膜内层厚度降低、视网膜神经节细胞数目明显减少、视网膜神经节细胞肿胀平均周长、面积升高,视网膜神经节细胞黑度值降低,与对照组比较差别有显著意义(P＜0．01)。结论 高血糖能使糖尿病大鼠视网膜变薄,神经节细胞肿胀、数目减少,从而对糖尿病大鼠视网膜内层造成损害。     

TLR-4在大鼠慢性高眼压模型视网膜中的表达

】背景TLR-4是一种天然免疫受体,在免疫性中枢神经系统损伤的修复中发挥重要作用,但在青光眼视神经损伤中的具体作用机制不详。目的从基因和蛋白质水平研究正常大鼠及慢性高眼压模型大鼠视网膜组织中TLR4的表达情况,探讨高眼压视网膜神经节细胞（RGCs）损伤的免疫机制及TLR-4在RGCs修复中的可能作用。方法选择d～5周龄的雄性清洁级纯种SD大鼠150只,用烧烙3条巩膜静脉联合术中应用丝裂霉素的方法建立大鼠慢性高眼压模型。Tono—penⅡ型笔式眼压计测量造模前、造模后2h,1、3、7、14、28、56d大鼠眼压。上述各时间点分别取5只高眼压组及空白对照组大鼠视网膜行免疫组织化学染色,观察视网膜TLR4蛋白的表达情况。应用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）法及Westernblot法检测各组视网膜组织中TLR-4mRNA及蛋白质的表达。结果实验组手术后眼压明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。免疫组织化学检测结果显示造模后早期TLR--4在视网膜组织中的表达开始增加,表达量均高于空白对照组（P〈O．05～0．01）;RT—PCR检测表明,大鼠慢性高眼压模型眼造模后各时间点TLR-4mRNA在视网膜的表达量明显高于空白对照组（P〈0．05～0．01）;WesternNot检测显示TLR4在造模后早期视网膜组织中即有表达,结果显示组间差异有统计学意义（P〈0．05～0．01）。结论TLR-4在大鼠慢性高眼压模型眼视网膜中的表达明显上调,提示其在大鼠慢性高眼压视神经退行性病变中发挥免疫调节作用。     

Toll样受体信号通路和糖尿病视网膜病变的关系

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是导致失明的主要疾病之一,其发病机制尚未完全阐明.Toll样受体(Toll-like recetors,TLRs)是机体免疫系统识别、感知细菌、病毒等病原体入侵的重要分子,在机体免疫防御功能中发挥着重要作用.众多的研究提示糖尿病发病与免疫系统的激活密切相关,TLRs的激活在DR的发生发展中起着重要的作用.现就Toll样受体信号通路与糖尿病视网膜病变的关系作一综述,为DR的防治提供新的治疗手段和思路.     

Exenatide对高糖培养的视网膜神经节细胞的保护作用

目的:评价Exenatide对视神经保护作用,并初步探索其对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护机制。方法:体外培养RGCs,免疫荧光检测RGCs是否表达胰升糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1receptor,GLP-1R),采用高糖作为细胞凋亡诱导剂建立RGCs凋亡模型,并用不同浓度Exenatide加入细胞培养基中进行干预,用CCK-8检测细胞存活率。结果:免疫荧光结果显示,RGCs存在GLP-1R的表达。CCK-8检测结果显示终浓度为0.5～1μg/L时Exenatide均可促进RGCs存活,其中0.5μg/L浓度较低且已有明显保护作用(P<0.05)。结论:Exenatide注射液对高糖引起的RGCs生存抑制有一定保护作用,这种保护作用很可能通过GLP-1R介导的细胞内保护机制产生。     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞中Toll样受体4的表达

目的:了解缺氧对人视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium,RPE)细胞Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)表达的影响。方法:采用200μmol/L CoCl2处理RPE细胞建立化学缺氧模型,以未处理细胞作对照,在缺氧处理后2,4,8,12和24h用免疫荧光法观察TLR4在细胞中的定位,用RT-PCR和Western blot检测细胞中TLR4表达水平。结果:共聚焦显微镜观察到正常对照组RPE细胞胞质内有微弱的TLR4荧光表达,缺氧后胞质内荧光表达明显增强,缺氧12h荧光强度达最强。RT-PCR和Western blot结果分别提示随缺氧时间延长,RPE细胞中TLR4mRNA和蛋白表达增强水平升高,缺氧至12h表达高峰最强(P<0.05),24h表达开始下降,各组差异有统计学意义。结论:缺氧可诱导RPE细胞中TLR4表达增强。     

糖基化终产物对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

糖尿病性视网膜病变是糖尿病患者严重的眼部并发症，其病因和发病机制尚未阐明。近年来人们认为慢性高血糖引起体内糖基化蛋白的过量沉积，形成糖基化终产物，从而导致各系统的慢性疾病和功能丧失。传统上人们多认为糖尿病性视网膜病变主要是微血管病变，包括：内皮细胞增殖、基底膜增厚、周细胞丧失等。但目前许多临床研究表明：在糖尿病性视网膜病变微血管病变发生以前，糖尿病患者已有视功能改变。动物实验发现在糖尿病早期，     

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景 研究发现,Toll样受体(TLRs)在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚. 目的 探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)中新生血管生成的作用及其机制. 方法 将18只7日龄新生C57BL/6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及OIR+脂多糖(LPS)-EB组,常氧组小鼠在正常氧环境中饲养,OIR组及OIR+LPS-EB组小鼠于生后第7天(P7)与母鼠置于体积分数(75±2)％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型,于P12在正常氧环境中饲养,OIR+LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB,剂量为1 mg/kg,OIR组同法注射PBS.各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色,计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比.各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测,计数小鼠5 mm视网膜全长活化小胶质细胞数目;采用CD11b和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CD11b、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为(18.47±1.32)％,新生血管面积比为(3.29±0.85)％,分别大于OIR组的(15.78±1.44)％和(1.77±0.19)％,差异均有统计学意义(t=3.36,P=0.01;t=4.22,P=0.00).免疫荧光结果显示,常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强,活化小胶质细胞数量增加,其中OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组,差异有统计学意义[(95.50士4.77)/5 mm与(74.83±4.17)/5 mm,t=8.00,P＜0.01].常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强,TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组,差异有统计学意义[(49.50±6.38)/5 mm与(28.17±6.24)/5 mm,t=5.86,P＜0.01)].常氧组P17小鼠视网膜中CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α共表达的小胶质细胞数量分别为(1.17±0.75)/5 mm、0和0,而OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的小胶质细胞数量多于OIR组,差异有统计学意义[(44.50±8.78)/5mm与(28.50±5.61)/5 mm,F=44.07,P＜0.01;(24.10±6.49)/5 mm与(16.00±3.46)/5 mm,F=11.31,P＜0.01;(33.83±14.82)/5 mm与(23.00±2.83)/5 mm,t=19.92,P＜0.01]. 结论 TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路,促进血管生长因子及炎性因子的释放有关.     

早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞树突形态异常的研究

目的观察早期糖尿病大鼠视网膜上存留的视网膜神经节细胞(RGC) 树突和胞体形态改变。方法用基因枪技术标记病程3个月的糖尿病大鼠和正常同龄大鼠的RGC，用带Z轴的Leica显微镜和CCD照相机采集RGC照片，按树突和胞体大小及形态分类后比较各组细胞树突野、胞体直径变化及其结构特征变异。Thy-1抗体免疫标记RGC，荧光显微镜下拍照，计数比较早期糖尿病大鼠RGC密度变化。结果病程3个月时，糖尿病大鼠RGC密度明显下降，被基因枪标记的RGC出现明显的树突野变化。各类细胞树突主干没有很大的变异，部分RGC表现出局部树突的短缩破坏，部分RGC细胞表现为树突小分支稀疏或扭曲变形。糖尿病大鼠A类RGC的树突野直径均值为(401±86) μm,对照组大鼠A类RGC的树突野直径均值为（315±72） μm,二者比较，差异有统计学意义（t=21.249，P<0.001)；糖尿病大鼠A类RGC的胞体直径均值为(24±6) μm, 对照组大鼠A类RGC的胞体直径均值为（22±5） μm,二者比较，差异无统计学意义（t=0.927，P>0.05)。B类RGC树突野与胞体直径均值在糖尿病大鼠分别为（170±36）、（14±2） μm，在对照组大鼠分别为（165±36）、（16±2） μm； C类 RGC树突野与胞体直径均值在糖尿病大鼠分别为（265±78）、（17±5） μm，在对照组大鼠分别为（251±57）、（17±4） μm，两两比较，其差异均无统计学意义（t= 1.357，0.798，0.835，1.104，P>0.05）。结论糖尿病早期大鼠RGC树突具有相当的可塑性，尤其是A类细胞。树突形态变化比胞体更敏感，可作为早期RGC形态变化的重要指标。糖尿病成年动物RGC表现出良好的可塑性及从树突变化到细胞真正死亡之间存在的时间窗为我们研究及临床开展神经保护提供了依据。 （中华眼底病杂志，2008，24：249-254）     

移植含嗅鞘细胞和体外溃变的周围神经对成年大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的比较

目的比较含嗅鞘细胞（OEC）或（和）体外溃变的周围神经移植对成年大鼠视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生的影响。方法将24只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组，每组各6只大鼠：A组（周围神经对照组）：将取出的一段自体坐骨神经与眶内切断的左侧视神经近侧断端吻合；B组（OEC注入周围神经组）：自取出的坐骨神经两端注入10 μl OEC悬液后移植于视神经断端。C组（周围神经体外溃变组）：将取出的坐骨神经在体外单独培养5 d后植于视神经断端；D组（OEC-周围神经共培养组）：将取出的坐骨神经与OEC共培养5d后植于视神经断端。移植术后4周处死动物，计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGC数量。结果B、C、D三组RGC均数1481±268、1235±266和1464±285显著高于A组799±109（P值分别为0.0002、0.0010和0.0003）；B、C、D三组间差异无统计学意义（P值分别为0.3644、0.9167和0.4344）。结论OEC具有促进RGC轴突在新鲜周围神经移植物中再生的作用，但这种作用与体外溃变的周围神经相比无明显差异，二者亦无协同作用。（中华眼底病杂志，2007，23：130-132）     

兔眼玻璃体内注射足叶乙苷对视网膜神经节细胞的毒性作用

目的 观察兔眼玻璃体内注射足叶乙苷对视网膜神经节细胞(RGC)的毒性作用.方法 采用随机数字法将24只健康新两兰大白兔随机分为正常组和0.0、1.5、15.0、150.0、375.0、750.0、1500.0μg 足叶乙苷组,每组3只兔,每只兔双眼用于实验.正常组不作任何处理,其余各组兔眼玻璃体内分别注射0.0、1.5、15.0、150.0、375.0、750.0、1500.0 μg足叶乙苷.注射后12 d,空气栓塞法处死所有兔.取眼球作常规病理检查,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜观察视网膜形态变化、计数视网膜颞侧距视盘颞侧缘1 mm处400倍视野的RGC数量.取距视盘1 mm处颞上方1 mmX 1 mm大小视网膜行常规透射电子显微镜检查,观察视网膜超微结构变化情况.结果 光学显微镜和透射电子显微镜观察发现,正常组兔眼视网膜结构清晰规整,RGC呈球形或类球形;0.0、1.5、15.0、150.0μg足叶乙苷组兔眼视网膜各层结构与正常组相似;375.0、750.0、1500.0μg足叶乙苷组兔眼视网膜明显变薄,层次结构紊乱.正常组、0.0、1.5、15.0、150.0、375.0、750.0、1500.0μg足叶乙苷组兔眼RGC计数分别为(61.66±3.72)、(61.83±4.59)、(60.00±7.07)、(62.00±4.43)、(62.67±3.98)、(7.33±1.37)、0.00、0.00个,8组间差异有统计学意义(F=145.04,P=0.00).0.0、1.5、15.0、150.0μg足叶乙苷组兔眼RGC计数较正常组无明显变化,差异无统计学意义(F=0.244,P＞0.05);375.0μg足叶乙昔组兔眼RGC计数较正常组、0.0、1.5、15.0、150-0 μg 足叶乙昔组明显降低,差异有统计学意义(F=145.04,P＜0.05).结论 足叶乙苷对兔眼RGC有一定毒性作用,且该作用呈剂量依赖性.

Abstract：

Objective To observe the toxic effects of intravitreal injection of etoposide on retinal ganglion cells (RGC) in rabbit eyes. Methods Twenty-four healthy rabbits were divided into 8 groups randomly, including one normal group without any treatment, and 7 experimental groups with intravitreal injection of different dosages of etoposide (0.0, 1.5, 15.0, 150.0, 375.0, 750.0, 1500.0 μg). Twelve days after the injection, the animals were killed by air embolism, and the eyeballs were prepared for routine pathological examination with hematoxylin-eosin staining and transmission electron microscopy. Results Four experimental groups (0.0, 1.5, 15.0, 150.0 μg etoposide) had normal retinal structure and normal shape of ganglion cells while other 3 experimental groups with higher dosage of etoposide (375.0, 750.0 and 1500.0 μg) showed thinner and disorganized retina. The number of RGC of the normal group and 0.0, 1.5,15.0, 150.0, 375.0, 750.0, 1500.0 μg groups were 61.6±63.72, 61.83±4.59, 60.00±7.07, 62.00±4.43, 62.67±3.98, 7.33±1.37, 0.00 and 0.00 per 400 X visual field, with statistical difference among groups (F=145.04, P = 0.00). There was no statistical difference between the normal group and 0.0,1.5, 15.0, 150.0 μg groups (F=0.244,P＞0.05). The number of RGC of 375.0 μg group was decreased obviously compared with normal group and 0.0, 1.5, 15.0, 150.0 μg groups with statistical difference (F=145.04, P＜0.05). Conclusion Etoposide has a dosage-dependent toxicity on rabbit RGCs.     

高功率微波对视网膜神经节细胞脂质过氧化作用的实验研究

目的 观察微波对体外培养的兔视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用。 方法 体外培养兔神经节细胞,以平均功率为80　mW/cm²的微波进行辐照,辐照时间分别为15、30、45min。辐照后立即于倒置显微镜和电镜下观察细胞形态变化,羟胺法和改良硫代巴比妥酸荧光法分别测定细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。 结果 微波辐照后,细胞轴突消失,电镜可见线粒体及内质网肿胀。随辐照时间延长,细胞逐渐趋向于坏死,细胞MDA含量增高,45min辐照组MDA含量为对照组的5.11倍。SOD则逐渐降低。 结论 微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤,脂质过氧化反应可能是微波视网膜损伤的作用机制之一。 (中华眼底病杂志,2000,16：32-34)     

小干扰RNA-TLR9对高糖下大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的探讨Toll样受体9(TLR9)对高糖下大鼠视网膜神经节细胞(RGC)-5凋亡的影响及小干扰RNA-TLR9(si-TLR9)对凋亡的抑制作用。方法将体外培养的RGC-5细胞分为正常对照组、高糖组、高糖+阴性对照组和高糖+si-TLR9组,分别行正常培养、高糖培养、高糖下空质粒转染和高糖下siRNA-TLR9质粒转染细胞。采用实时PCR法检测各组细胞中TLR9 mRNA表达;采用MTT法检测各组细胞存活率;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞中含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)活性;采用Western blot法检测TLR9及B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和磷酸化(p)-p38MAPK蛋白的表达。结果与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中TLR9 mRNA和蛋白的相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞存活率分别为(78.36±5.13)%和(75.12±4.25)%,较正常对照组的(95.48±7.25)%明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞存活率为(86.58±5.32)%,明显高于高糖+阴性对照组的(75.12±4.25)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞凋亡率分别为(13.23±1.22)%和(12.52±1.38)%,较正常对照组的(2.26±0.15)%明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞凋亡率为(7.15±0.24)%,明显低于高糖+阴性对照组的(12.52±1.38)%,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中bax蛋白表达量明显下降,bcl-2蛋白相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖+si-TLR9组细胞中caspase-3活性明显低于高糖+阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中p-p38MAPK蛋白相对表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调TLR9表达可抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活化有关。     

大鼠急性视网膜缺血节细胞死亡时脑红蛋白的表达

目的 研究大鼠视网膜急性缺血中视网膜节细胞(RGCs)死亡时脑红蛋白(Nsb)的表达.方法 实验研究.采用特异性结扎大鼠视网膜动脉的方法造成视网膜急性缺血模型,按照结扎时间不同(0、15、30、60 min)分为A、B、C、D组,每组10只大鼠,均以左眼为实验眼.每组随机选取3只大鼠视网膜用于免疫印迹法检测,4只大鼠视网膜做HE染色节细胞计数及免疫组化染色荧光强度分析,3只大鼠做免疫电子显微镜观察.采用单因素方差分析对不同结扎时间Ngb蛋白定量及RGCs数目进行统计学分析,采用KSD-t检验进行两两比较.结果 视网膜完全结扎后,A、B、c、D组Ngb蛋白表达量分别为1.439±0.014、2.023±0.134、1.416±0.030及1.073±0.064;RGCs计数结果分别为4368±124、4296 ±96、4132±104、3973±115,组间比较差异有统计学意义(F=79.548,10.191,P<0.05).B组表达最高,之后逐渐降低,C组接近正常,此时与A组比较RGCs数量开始减少,D组Ngb的表达已明显低于A组,与A组比较RGCs数量进一步减少.在视网膜各层中,Ngb的表达以RGCs层为最高,其次为内丛状层与外丛状层.RGCs中Ngb主要分布在胞质,C组线粒体外室和线粒体嵴也发现有Ngb表达,而内核层及外核层细胞的胞质内始终未见Ngb的表达.结论 Ngb在大鼠RGCs急性缺血死亡时表达快速升高,主要表达于RGCs的胞质内,与RGCs的生存状态关系密切.     

miR-30b对大鼠糖氧剥夺性视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 缺血缺氧损伤是引起大部分视觉系统损害的主要原因,目前尚无有效药物从根本上缓解缺血缺氧带来的损害.研究发现,微小RNA(miR)-30b有助于减轻缺血缺氧导致的心肌损伤,但其对糖氧剥夺的视网膜神经节细胞(RGCs)生存是否有类似的保护作用鲜有文献报道. 目的 研究重组腺相关病毒介导的miR-30b转染对糖氧剥夺RGCs的保护作用.方法 取出生后24 h的8只SD大鼠眼球,剥离出视网膜组织以进行RGCs的原代培养,将原代培养的细胞分为重组腺相关病毒(rAAV)-miR对照组、rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR-30b抑制物组和PBS组,分别在培养液中添加rAAV-miRNA、rAAV-miR-30b拟似物、rAAV-miR-30b抑制物或PBS培养细胞6d,RGCs∶AAV为1∶10 000.各组细胞分别进行低氧培养箱(37 ℃,体积分数5％ CO2、17％ N2、3％ O2)联合低糖(葡萄糖质量浓度为1.0 g/L)培养液进行培养以建立原代糖氧剥夺RGCs模型,并与正常培养(37℃、5％ CO2)的细胞进行对照.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞活力,采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物TubulinⅢ的表达,并计算存活RGCs数目.采用Hoechst/PI染色法检测各组细胞的凋亡和坏死情况. 结果 培养7d的正常成熟RGCs可见1-3条完整的细长神经元突起及其分支.糖氧剥夺后随着时间延长,培养的RGCs逐渐减少和破坏,突起的主干结构破碎.rAAV-miR-30b拟似物组细胞相对活性分别为3.310±0.162,明显高于rAAV-miR-30b抑制物组和rAAV-miR对照组的0.949±0.141和0.900±0.181,差异均有统计学意义(t=10.508、10.296,均P＜0.001).存活的RGCs可表达TubulinⅢ,呈红色荧光.rAAV-miR-30b拟似物组TubulinⅢ阳性细胞数量为(13.800±1.924)/视野,明显多于rAAV-miR-30b抑制物组的(0.600±0.548)/视野和rAAV-miR对照组的(0.800±1.304)/视野,差异均有统计学意义(￡=15.141、14.912,均P＜0.001).rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR对照组和PBS组细胞凋亡率和死亡率的总体比较差异均有统计学意义(F=10.851,P=0.002;F=6.378,P=0.013),rAAV-miR-30b拟似物组细胞凋亡率和死亡率均明显低于rAAV-miR对照组和PBS组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 低氧培养箱联合低糖培养液建立稳定的原代RGCs糖氧剥夺模型;rAAV介导的miR-30b转染可抵抗糖氧剥夺对RGCs的损伤.     

糖尿病大鼠早期视网膜小胶质细胞活化与神经节细胞损害的关系

目的　观察糖尿病早期视网膜小胶质细胞的活化特征与视网膜神经节细胞（RGC）损害的关系。方法　20只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,采用链脲佐菌霉素腹腔注射方法制作糖尿病动物模型,分为糖尿病1、3个月组及相应正常对照组,每组5只大鼠。对所有大鼠行上丘定位注射逆行标记RGC,分别用免疫组织化学法标记视网膜铺片、冰冻切片小胶质细胞和RGC,共聚焦显微镜下观察小胶质细胞细胞形态及分布特征。结果　糖尿病组视网膜铺片小胶质细胞胞体增粗,形态不规则。与对照组相比,糖尿病3个月组RGC层发生吞噬的小胶质细胞密度显著增加（t=3.83,P＜0.01）。与对照组相比,糖尿病大鼠1、3月个组RGC层小胶质细胞平均密度均显著增加（t=2.71,4.22;P＜0.05）;糖尿病大鼠3个月组RGC层小胶质细胞平均密度较糖尿病1个月组显著增加（t=7.45,P＜0.0001）。糖尿病早期小胶质细胞与RGC数量之间存在相关关系（r=0.9,P＜0.05）。结论　糖尿病早期小胶质细胞活化与RGC损伤关系密切。     

胰岛素对正常糖和高糖浓度下牛视网膜微血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨胰岛素、糖浓度及其两者的联合作用对牛视网膜微血管内皮(BRE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 对照实验研究.采用选择性培养方法,培养BRE细胞,传代后分别在正常糖(5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)浓度下培养3 d,甘露醇平衡渗透压,血清饥饿12 h,给予或不给予100 nmol/L胰岛素作用24 h.实时荧光定量检测VEGF mRNA表达水平;人脐静脉血管内皮细胞增殖法、免疫荧光检测法、免疫印迹法检测VEGF蛋白表达水平.采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析,胰岛素、糖浓度及其交互作用对BRE细胞的VEGF mRNA和VEGF蛋白表达水平的影响,采用2×2析因设计定量资料方差分析,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 胰岛素或高糖浓度可以显著提高BRE细胞的VEGFmRNA(F=5.67,9.04;均P<0.05)和VEGF蛋白(F=5.50,5.57;均P<0.05)表达水平,但胰岛素联合高糖浓度的作用较其单独作用减弱.结论 高糖浓度下可以降低胰岛素诱导的VEGF表达水平,因此,VEGF可能不是胰岛素治疗导致的糖尿病视网膜病变短期恶化的主要因素.