中国一先天性无虹膜家系PAX6基因新致病突变位点的筛查及验证

背景 先天性无虹膜是临床上罕见的先天性遗传性眼病.研究显示,配对盒转录因子6基因(PAX6)与先天性无虹膜症密切相关,但不同患者中PAX6基因的突变位点不同. 目的 对中国一常染色体显性遗传先天性无虹膜家系进行PAX6基因突变位点分析. 方法 于2014年8月在郑州大学第一附属医院收集一汉族先天性无虹膜家系,采集该家系9名成员及同期100名健康体检者的外周静脉血10 ml,采用标准酚-氯仿提取法提取基因组DNA,对PCR扩增产物进行测序、对比及突变分析.采用实时荧光定量PCR法验证和比较该家系中患病者与该家系表型正常者和健康对照者淋巴细胞中PAX6 mRNA的相对含量. 结果 该家系共3代9名成员,遗传方式符合常染色体显性遗传.家系中共5例患病者,成年患病者均表现为虹膜缺失和白内障,儿童患病者表现为无虹膜;其他4名家系成员表型正常.测序结果显示,家系患病者均存在11号染色体PAX6基因10号外显子的移码突变,第796位核糖核苷酸G缺失(c.796 del G),产生提前终止密码子,而家系正常成员及100名对照者均无此突变.实时荧光定量PCR结果显示,家系中患病者淋巴细胞中PAX6 mRNA表达水平比家系中正常成员约低50％,差异有统计学意义(Z=-2.449,P=0.016). 结论 PAX6基因c.796 del G为此先天性无虹膜家系的致病突变位点,扩增了PAX6基因突变谱.     

三个先天性无虹膜症家系中PAX6基因的突变分析

背景 人类配对盒基因(PAX6)编码一个转录调节子,对眼和大脑形态的形成起关键作用.PAX6突变可导致许多先天性眼部发育异常,如先天性无虹膜症,通常为常染色体显性遗传方式. 目的 对三个先天性无虹膜症家系成员进行PAX6基因分析,探索这些家系发病的遗传基础. 方法 收集三个先天性无虹膜症家系的5例患病者和正常成员13名的外周血标本提取DNA,根据PAX6基因的序列设计4～ 13外显子序列,通过聚合酶链反应(PCR)扩增引物并测序,将目标序列与已发表的PAX6基因序列进行对比分析.结果 三个家系中共有5例患病者,在家系A中2例患者发现一个杂合突变(c.718 C＞T),导致第240位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子(p.A rg240X),而其他正常表型者未发现此突变.家系B中的患病者和正常成员均未检测到PAX6基因的突变.家系C中1例患病者发现c.331 delG(p.Val111SerfsX13)的缺失突变,此单个碱基的缺失造成了移码突变,使PAX6蛋白羧基端的299个氨基酸缺失,而此家系的其他正常表型成员未发现此突变. 结论 家系A和家系C先天性无虹膜症的致病与PAX6基因的突变有关.     

先天性无虹膜合并先天性白内障家系致病基因突变分析

目的：对先天性无虹膜合并先天性白内障家系进行PAX6基因突变位点筛查,丰富该致病基因的突变谱。

方法：选取就诊于北京同仁医院眼科门诊的1个先天性无虹膜合并先天性白内障家系和100名健康志愿者,采集外周静脉血,提取基因组DNA,采用直接测序法进行PAX6基因突变位点的筛查。

结果：该家系中先证者和其他患者均表现为无虹膜合并白内障,PAX6基因测序结果显示,该致病基因第11外显子无义突变c.991 C>T,造成PAX6基因编码的蛋白截短(R331X),从而使该蛋白失去功能,且该突变在家系内与疾病表型共分离,不存在于家系内及家系外健康样本的基因中。

结论：PAX6 R331X突变与先天性无虹膜合并先天性白内障的发生有关。     

先天性无虹膜家系中发现PAX6基因新的致病突变

目的对中国一先天性无虹膜家系进行PAX6基因突变检测,以确定其突变位点。方法实验研究。收集一先天性无虹膜家系,采集该家系患者及健康成员的外周静脉血,收集100名健康人外周血作为正常对照,采用Sanger测序的方法对PAX6基因的11个外显子（外显子4-14）以及外显子-内含子连接区域进行测序,随后进行家系共分离分析以及正常样本的对照分析。结果该家系8名成员经全面眼科检查,3名确诊为先天性无虹膜,且合并有复杂的眼部表型,包括不同程度的角膜病变、不同类型的白内障、黄斑发育不良、轻度上睑下垂和轻度眼球水平震颤等。在该家系患者中发现一个新杂合突变[c.569_570delinsACGG（p.Ile190Asnfs*18）],该突变可致PAX6基因编码的蛋白截短,该突变符合共分离且在100名正常对照者中未检测到。结论PAX6基因第8外显子上一个新的杂合突变[c.569_570delinsACGG（p.Ile190Asnfs*18）]为本研究中先天性无虹膜家系的致病突变,该突变与先天性无虹膜有关,本研究扩大了PAX6基因的突变频谱。     

先天性无虹膜症家系的基因突变位点研究

目的探讨先天性无虹膜症家系的基因突变位点。方法抽取家系成员的外周血2~5ml,提取DNA;先合成2个多态性微卫星遗传标记(D11S904和D11S935)的引物进行聚合酶链反应(PCR),PCR产物变性后用变性聚丙烯酰胺(PAGE)胶分离,根据带型和家系成员间的关系进行单体型连锁分析,判断家系无虹膜表型是否与PAX6基因相关;PCR扩增PAX6基因的所有外显子,所有PCR产物分别进行单链构象多态性(SSCP)分析,通过患者与正常人带型的差异确定突变发生的外显子,对有差异SSCP带型的PCR产物进行直接DNA测序,找到突变位点。结果该家系先天性无虹膜表型明显与PAX6基因连锁;SSCP分析PAX6基因第9外显子PCR产物,显示患者均有异常带型出现,而家系正常人均无此异常带;测序结果显示突变位点为PAX6基因第9外显子c1080核苷酸C突变为T,使编码精氨酸的密码子突变为终止密码子。结论PAX6基因突变可导致先天性无虹膜。     

一先天性无虹膜家系PAX6基因遗传筛查及临床表型

目的探讨我国常染色体显性遗传先天性无虹膜一家系患者的致病基因突变位点及其临床表型。方法实验研究。于南京医科大学第一附属医院眼科收集一先天性无虹膜家系,共8名家庭成员,其中3名患者,2名正常同胞,3名配偶。完善该家系内所有参与者的眼科检查,采集该家系成员的外周静脉血,提取基因组DNA,扩增PAX6基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列,直接测序法确定该家系的致病突变。结果遗传学筛查结果证实该家系的致病突变为位于PAX6基因第7号外显子与第7号内含子交接处的杂合突变（c.357+5G>A）。生物信息学分析结果表明该突变可导致正常剪切位点的缺失,产生移码突变,形成截短蛋白p.Ser121Asnfs*30。该家系中3例患者均表现出典型的先天性无虹膜症的临床表型,表现为虹膜发育不全,与此同时,该家系内患者还具有上睑下垂、白内障、眼球震颤、青光眼及玻璃体混浊等眼部异常。结论PAX6 c.357+5G>A杂合突变为该家系的致病突变,是该家系发生先天性无虹膜及上睑下垂、白内障、眼球震颤、青光眼及玻璃体混浊等一系列临床表型的主要致病原因。     

第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序(NGS)技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者(Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4)和3名表型正常者(Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2)的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C(p.S228P)杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿(Ⅳ1)CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.     

土家族中一个先天性无虹膜家系的临床特点和PAX6基因突变位点分析

目的：确认土家族中一个先天性无虹膜家系的PAX6基因致病突变并分析其临床特点。方法：实验研究。详细询问家族病史并对该家系中所有7 例成员（4 例患者,3 例正常人）进行详细的眼部检查,采集家系成员及100例（50例土家族人和50例汉族人）正常对照者的外周静脉血,提取DNA;对先证者PAX6基因的全部外显子进行PCR扩增及测序;对家系中所有成员和正常对照者进行PAX6基因突变位点的验证检测。结果：该家系中患者主要以虹膜缺损、白内障、眼球震颤、黄斑中心凹发育不良和角膜病变为主要临床表现,虹膜缺损轻重不一,角膜病变和白内障情况随年龄增加而加重。该家系的4 例患者均在第3 外显子与内含子3 交界处出现一个杂合突变（c.357+1G > A）,正常家系成员及正常对照者均无此突变。结论：该先天性无虹膜家系患者虹膜缺损程度不一。PAX6是该家系的致病基因,该家系患者PAX6基因的突变位点是杂合突变(c.357+1G > A）。     

PAX6基因在一先天性无虹膜家系中的突变筛查

目的研究PAX6基因突变是否是导致一先天性无虹膜家系致病的原因。方法收集一先天性无虹膜家系,制备外周血基因组DNA,PCR扩增PAX6基因的外显子及其邻近的内含子,应用单链构象多态性（SSCP）法检测,如果发现变异条带,将相应的扩增产物回收并纯化后进行PAX6基因测序。测序结果与GenBank公布的PAX6基因正常序列比对,寻找有无突变。结果本家系43名成员中有8例患病,遗传方式符合常染色体显性遗传特点,40岁以上的4例患者眼压高于35mmHg。所有患者中未发现全身并发症。在家系所有患者中均未发现异常条带。结论 PAX6基因与该先天性无虹膜家系无关。该家系的致病基因有待进一步通过全基因组扫描的方法来确定。     

全外显子组测序法对一中国常染色体显性遗传先天性白内障家系GJA3基因突变位点的分析

背景 先天性白内障是儿童致盲的重要原因,多数先天性白内障与遗传有关.目前已知的与常染色体显性遗传先天性白内障(ADCC)有关的基因有39个. 目的 采用全外显子组测序法对一ADCC家系的致病突变基因进行筛查和分析.方法 纳入2014年8月-9月在郑州大学第一附属医院就诊的一ADCC家系,分别采集家系中14例患者和14名表型正常成员外周静脉血各10 ml,同期同法采集100名健康体检者10 ml的外周静脉血作为对照.用标准酚-氯仿提取法提取所有受检者基因组DNA,并采用全外显子组测序法将先证者的DNA进行全外显子组测序,与数据库对比后筛选出候选基因突变位点,设计突变基因位点引物后采用PCR技术对家系中受检者及100名健康对照者的该基因位点进行扩增并测序,以验证候选基因的致病性并分析其致病机制.结果 该家系共5代68名成员,患病者20例,遗传方式符合常染色体显性遗传方式.患者均双眼发病,晶状体混浊以皮质性为主.先证者全外显子组测序后分析发现,13号染色体GJA3基因的2号外显子第143位核糖核苷酸A突变为G(c.143A＞G),导致其编码的第48位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸(p.E48G).PCR扩增产物测序结果显示该家系中患病受检者DNA均有此突变,但该家系中表型正常的受检者及100名健康对照者该候选基因均不存在此突变.结论 GJA3基因c.143A＞G为该ADCC家系的致病基因突变位点,增补了GJA3基因的突变谱.     

A novel deletion downstream of the PAX6 gene identified in a Chinese family with congenital aniridia

Purpose: Congenital aniridia, a severe bilateral panocular visual disorder, is an autosomal dominantly inherited eye anomaly. Mutations in the paired box 6 gene (PAX6) have been shown to be responsible for congenital aniridia in most patients. The purpose of the present study was to report clinical features of a Chinese family with congenital aniridia and to screen novel genetic mutations for congenital aniridia.

Methods: All members of a three-generation family underwent comprehensive ophthalmic examination, and 8 of its 25 members were diagnosed with congenital aniridia. The proband was analyzed by exome sequencing and whole genome sequencing, and linkage analysis was performed for the family. The mutation was confirmed by direct DNA sequencing.

Results: Using Illumina’s Human Linkage-12 beadchip microarray (including 6090 SNPs) whole genome scan, the LOD score value showed that the interval on chromosome 11 between rs1389423 to rs910090 exhibited a strong linkage. A novel heterozygous 469 kb deletion mutation within the downstream region of PAX6 (chr11:31189937–31659379) was identified in all affected family members, but not in unaffected family members or 2000 ethnically matched controls.

Conclusion: A novel deletion mutation was identified within the PAX6 downstream region that results in congenital aniridia.     

全外显子组测序法对中国先天性白内障一家系致病基因的研究

背景 基因突变是导致遗传性先天性白内障的主要原因,全外显子组测序技术是目前研究致病基因突变较为理想的检测手段. 目的 应用高通量测序技术对中国汉族常染色体显性遗传先天性白内障(ADCC)一家系的3例患者进行全外显子组测序,筛选该ADCC家系的致病基因. 方法 采用横断面研究方法,收集中国汉族先天性白内障一家系,共有4代48人家系成员,其中Ⅰ1和Ⅰ2已去世.在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代中各取1例患者的静脉血8 ～ 10 ml,采用全外显子捕获和新一代测序技术进行高通量测序,测序结果与人类HA PMAP8、dbSNP130和1000 Genome Project数据库进行比对,过滤已报道的常见变异后,再过滤掉同义突变,最后通过Sanger法测序排除外显子测序的假阳性结果,筛选出候选基因,并对其进行突变筛查.结果 该家系的所有成员中共11例患病者,且各代均有患病者,男女发病比例相当,符合ADCC的遗传规律,所有患者均为核性白内障.全外显子组测序发现,在各候选基因中,主要内源性蛋白(MIP)基因是ADCC的已知基因,故采用Sanger法首先对MIP基因进行验证并确定杂合突变(chr12:56845250 C＞T)为该家系的致病突变.该突变位于剪切位点上,造成由第4外显子编码的61个氨基酸被亮氨酸-组氨酸-丝氨酸所替代,导致异常截短蛋白的产生.结论 MIP基因剪切位点的杂合突变是导致该ADCC家系致病的分子发病机制.     

PAX6基因突变的鉴定与中国家系无虹膜症合并妊娠期糖尿病的产前诊断

目的：探讨1个中国无虹膜症合并妊娠期糖尿病家系的基因缺陷及产前诊断。

方法：收集1个患有无虹膜症合并妊娠期糖尿病的中国家系,从外周血中提取整个家系成员的基因组DNA,通过聚合酶链式反应结合直接测序法,分析人类配对盒基因(PAX6)的编码序列。妊娠18wk时对孕妇进行羊膜穿刺术,并根据突变筛查结果进行遗传学分析。

结果：无虹膜患者在PAX6的第5外显子中存在杂合缺失突变(c.113_129del GGCCGTGCGACATTTCC, p.Arg38ProfsTer12),该患者同时合并妊娠期糖尿病,产前诊断结果提示胎儿具有相同的突变,易患先天性无虹膜症,经产后随访证实。

结论：在中国先天性无虹膜患者中发现了PAX6基因缺失突变,为人类PAX6等位基因变异数据库提供了更多的文献资料,为产前诊断提供了分析依据。     

先天性无虹膜症一家系PAX6基因Q310X突变的致病研究

目的 探讨先天性无虹膜症一家系的致病基因突变情况与发病机制.方法 采用病例对照研究方法.对该家系所有成员21人进行全面的眼科检查,同时进行家系调查并采集外周血样本,分离单个核细胞;用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA,以先证者DNA为模板聚合酶链反应法扩增转录因子PAX6基因全部14个外显子,用双脱氧末端终止法进行测序分析.结果 测序结果发现先证者Ⅲ2的PAX6基因在第11外显子上有Q310X(c.1378C>T)无义突变.它导致了第301位氨基酸密码子由CAA改变为TAX(Q301X),编码的谷氨酰胺突变为强终止密码子.对该家系中所有21名成员PAX6基因测序,结果发现所有10例患者都携带这一突变,而11名正常人则未检测到这一改变.结论 PAX6基因Q310X的无义突变所致PAX6蛋白翻译提前终止是此先天性无虹膜症家系的致病原因.     

A Novel PAX6 Mutation in Chinese Patients with Severe Congenital Aniridia

Purpose: We identified a novel mutation in Paired Box gene 6 (PAX6) and characterized its associated clinical features of severe ocular malformation in a Chinese family with congenital aniridia. Methods: We studied two patients with aniridia from a Chinese family. All patients and noncarriers in this family underwent full ophthalmologic, general and urinary examinations. Total genomic DNA was isolated from peripheral blood of two aniridia patients. PAX6 levels were determined by PCR and its mutational status was determined by sequencing. Direct sequencing detected variations in PAX6. Results: Patients had bilateral congenital nystagmus, anterior polar cataract, absence of iris tissue, and foveal hypoplasia with severely reduced visual acuity. A novel heterozygous PAX6 mutation in exon 6 c.662G>A (p.W100X) was identified which created a premature termination codon. This observed sequence alteration was not found in 100 normal controls and has not been previously reported. Conclusions: We identified a novel PAX6 mutation in a family with severe ocular malformation. Our study expands the mutational spectrum of PAX6 and enriches our knowledge of the relationship between genotype and phenotype due to these mutations.