角膜缘干细胞缺乏对角膜上皮损伤修复的影响

目的探讨角膜缘干细胞的功能。方法采用生物医学图像分析系统,计算切除角膜缘上皮组织的兔眼的角膜上皮愈合速率;用光学显微镜观察角膜上皮损伤修复过程的组织学变化。结果在角膜上皮损伤８～３２小时内,实验组与对照组角膜上皮愈合速率分别为１．２２±０．１９ｍｍ２／ｈ和１．４５±０．２０ｍｍ２／ｈ（ｔ＝３．８９,Ｐ＜０．０１）,实验组角膜上皮损伤愈合速度明显比对照组慢。实验组角膜可见大量的杯状细胞和新生血管,并随时间而逐渐向中央区发展。结论实验结果进一步证实了角膜上皮干细胞存在于角膜缘,角膜缘干细胞缺失,可使角膜上皮增殖能力丧失,角膜缘屏障功能下降,导致持续性角膜上皮糜烂、结膜组织长入和新生血管形成。     

兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中作用的实验研究

利用显微手术切除＋０．２５Ｎ氢氧化钠溶液碱烧伤的方法制备动物实验模型。观察兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中的作用。结果显示：全周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，角膜上皮愈合时间长（２５．８天）。愈合后含有大量新生血管和杯状细胞，呈现结膜上皮表型。半周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，上皮愈合时间缩短（６．３天），含有少量新生血管和杯状细胞。保留角膜缘上皮单纯角膜上皮缺损组，上皮愈合时间最短（３天），无新生血管及杯状细胞，呈角膜上皮表型。结果表明：角膜缘上皮干细胞在角膜上皮损伤愈合中起着极重要的作用，是损伤后角膜上皮再生的源泉。     

贝伐单抗对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎角膜新生血管和瘢痕形成的抑制作用

背景 单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)可诱导发生角膜新生血管和炎症反应,传统的治疗药物为阿昔洛韦(ACV),研究已证实贝伐单抗具有抑制新生血管的作用,但其是否对HSK发挥治疗作用值得研究. 目的 研究贝伐单抗对小鼠HSK角膜瘢痕和新生血管的抑制作用.方法 利用体外培养并感染的Vero细胞生产单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1),以无血清DMEM培养基于冰上对HSV-1进行10倍梯度稀释后制备成HSV-1液.选用SPF级雄性6～8周龄C57 BL/6小鼠200只,用0.6μl滴度为l×l0 7空斑形成单位(PUF)/ml的HSV-1行小鼠角膜基质注射以制备HSK模型,将模型眼分为单纯ACV注射组、ACV+贝伐单抗注射组和生理盐水注射组,按照分组分别于感染后5、8、11和14d选择角膜混浊评分为1分的模型眼结膜下注射50μg ACV、50 μg ACV+5 μl贝伐单抗和5μl生理盐水.此外采用紫外线照射均有轻度新生血管和瘢痕的6只模型小鼠双眼诱导HSK复发,于复发后0、2、4和6d行5μl贝伐单抗(25 mg/ml)右眼结膜下注射,左眼结膜下注射5 μl生理盐水.于造模后5、7、11、14和17d以及复发的0、2、4和6d行小鼠角膜裂隙灯显微镜检查并用角膜知觉测量仪行中央角膜敏感度检测;制备角膜铺片,采用免疫荧光检测法检测角膜中CD31和βⅢTubulin荧光表达以评估角膜新生血管和角膜神经纤维分布;采用Image J软件测定角膜新生血管面积和瘢痕面积. 结果 HSK成模率达80％以上,造模后7d和复发后2d角膜混浊最重,造模后15 d和复发后2d角膜新生血管面积最大.造模后模型眼中央角膜敏感度逐渐降低,于造模后9d下降到最低.ACV+贝伐单抗注射组角膜病变面积小于单纯ACV注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠中央角膜敏感度为5.50±0.71,明显高于生理盐水注射组的0.50±1.41,差异有统计学意义(Z=-2.397,P=0.029).ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜病变面积增长率为(167.10±52.53)％,低于生理盐水注射组的(312.30±74.18)％,差异有统计学意义(Z=-1.992,P=0.046).实时荧光定量PCR显示造模后7d,模型眼角膜及同侧三叉神经节(TG)中胸苷激酶(TK)和感染细胞蛋白-27(ICP-27) mRNA相对表达量均较高,造模后45 d明显下降,诱导复发后2d TKmRNA和ICP-27 mRNA均再次升高,复发后7d表达量降至最低.造模后45 d同侧TG中均可见LAT mRNA表达量达峰值,诱导复发后2d相对表达量下降,复发后7d相对表达量再次升高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).角膜铺片结果显示,造模后生理盐水注射组小鼠较正常对照小鼠角膜新生血管明显增加,角膜神经纤维明显减少,单纯ACV注射组和ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜新生血管少于生理盐水注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜神经纤维较生理盐水组注射组和单纯ACV注射组均增加.结论 贝伐单抗结膜下注射可抑制HSK模型小鼠角膜新生血管生成和瘢痕形成,与ACV联合应用时二者有协同作用.     

蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1000μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。     

Slit2对糖尿病模型小鼠角膜上皮和神经的保护作用及其机制

目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组,每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角...     

枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液冲洗对小鼠急性角膜化学伤眼表的保护作用

背景 角膜化学性烧伤后即刻进行眼部冲洗是防止化学性物质进一步损伤眼组织的关键步骤,而理想的冲洗液才能有效地中和化学物质,改善患眼的预后. 目的 评价自制的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠-氯化钾缓冲液对小鼠急性角膜酸、碱烧伤的治疗效果. 方法 配制pH值为7.4的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(缓冲液1)和枸橼酸-磷酸氢二钠-氯化钾缓冲液(缓冲液2).采用计算机取随机数方法将120只6～8周龄清洁级雄性C57小鼠随机分为酸烧伤模型组和碱烧伤模型组,分别用1 mol/L硫酸和0.15 mol/L氢氧化钠滤纸贴附于中央角膜制备急性角膜酸、碱烧伤模型,造模后即刻按照亚分组分别用40 ml缓冲液1、自来水、缓冲液2进行冲洗,未冲洗的模型鼠作为对照.分别于造模后和冲洗后3、7、14d在裂隙灯显微镜下按照角膜混浊程度进行评分,并观察各组小鼠角膜上皮荧光素染色阳性率、角膜新生血管和角膜溃疡发生率.结果 角膜酸烧伤后3、7和14 d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜混浊评分为1分的眼数均明显多于不冲洗组,差异均有统计学意义(均P＜0.01);角膜酸烧伤后3d,缓冲液1冲洗组角膜混浊度为1分的眼数明显多于自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组,差异均有统计学意义(x2=11.000,P=0.001;x2 =4.000,P=0.046);角膜酸烧伤后7d,缓冲液1冲洗组角膜混浊度为1分的眼数明显多于自来水冲洗组,差异具有统计学意义(X2 =6.000,P=0.014);角膜酸烧伤后14d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组不同角膜混浊评分的眼数差异均无统计学意义(均P＞0.05).碱烧伤后3、7、14 d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜混浊度评分为1分和2分的眼数均明显多于不冲洗组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).角膜酸烧伤后7d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜溃疡发生率分别为7％、27％和13％,均明显低于不冲洗组的73％,差异均有统计学意义(P=0.000、0.027、0.003);角膜碱烧伤后3、7、14 d角膜溃疡发生率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).角膜酸烧伤后14 d,不冲洗组角膜新生血管发生率为50％,而缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组小鼠未见角膜新生血管.角膜碱烧伤后各组小鼠在各时间点均未发现角膜新生血管. 结论 pH值为7.4的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液对急性角膜酸、碱烧伤进行即刻冲洗均有较好的治疗效果,冲洗液中是否添加氯化钾对预后无明显影响.     

内源性大麻素对缺氧缺糖视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 急性视网膜缺血缺氧性损伤在眼科较为常见,如青光眼急性发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等,可引起视网膜的缺血缺氧损伤,并可致视网膜神经节细胞(RGCs)的死亡.内源性大麻素(CB)及其受体(CBR)参与中枢神经系统外伤、缺血、炎症及中毒等多种生理病理过程. 目的 探讨视网膜神经节细胞(RGCs)在缺氧缺糖损伤中内源性CB的作用及意义.方法 取6周龄正常C57BL/6J小鼠眼球,制备小鼠视网膜垂直冰冻切片,采用免疫荧光染色法检测和验证CB1R和CB2R在RGCs中的表达.10只C57 BL/6J新生鼠浸入75％乙醇消毒后取眼球,在冰上预冷的DMEM培养基中分离视网膜进行RGCs原代培养,采用免疫荧光技术检测培养细胞中RGCs标志物Brn3a的阳性表达并确定培养细胞中CB1R和CB2R的表达.将原代培养14 d的RGCs分为正常对照组和氧糖剥夺(OGD)组,分别用完整培养基+体积分数95％空气+体积分数5％ CO2和无糖培养基+体积分数95％ N2+4％ CO24+体积分数1％ O2条件下培养20 h.采用JC-1染色法检测细胞中线粒体结构变化和RGCs的形态变化.各组细胞分别给予1μmol/L CB1R拮抗剂SR141716A、1μmol/L CB2R拮抗剂SR144528以及5μmol/L、10 μmol/L CB1R和CB2R激活剂WIN 55212-2,采用MTT法比较各组RGCs存活率.结果 正常C57BL/6J小鼠视网膜全层均可见CBR的表达.正常对照组培养的RGCs大小均匀,多呈多角形,细胞间轴突细长并形成网络,细胞中Brn-3a表达阳性;OGD组培养的细胞皱缩或形成碎片,多数细胞轴突消失,Brn-3a表达荧光强度明显减弱.正常对照组RGCs中JC-1染色显示,线粒体的黄色荧光明显强于OGD组,表明OGD组线粒体膜电位明显下降.MTT法检测显示,正常对照组RGCs存活率为(100.00±13.87)％,明显高于OGD组的(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=8.065,P=0.008);SR141716A和SR144528作用后OGD组细胞存活率分别为(116.63 ±22.21)％和(112.61±19.02)％均明显高于同组的无药物处理细胞的存活率(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=29.780、17.391,均P＜0.01),而SR141716A和SR144528作用后正常对照组细胞存活率的变化差异均无统计学意义(均P＞0.05). 结论 细胞缺氧缺糖时上调CB在细胞中的表达和激活CB活性.在缺氧缺糖条件下,抑制细胞中CBR的激活过程对RGCs有保护作用.     

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景 研究发现,Toll样受体(TLRs)在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚. 目的 探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)中新生血管生成的作用及其机制. 方法 将18只7日龄新生C57BL/6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及OIR+脂多糖(LPS)-EB组,常氧组小鼠在正常氧环境中饲养,OIR组及OIR+LPS-EB组小鼠于生后第7天(P7)与母鼠置于体积分数(75±2)％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型,于P12在正常氧环境中饲养,OIR+LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB,剂量为1 mg/kg,OIR组同法注射PBS.各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色,计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比.各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测,计数小鼠5 mm视网膜全长活化小胶质细胞数目;采用CD11b和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CD11b、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为(18.47±1.32)％,新生血管面积比为(3.29±0.85)％,分别大于OIR组的(15.78±1.44)％和(1.77±0.19)％,差异均有统计学意义(t=3.36,P=0.01;t=4.22,P=0.00).免疫荧光结果显示,常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强,活化小胶质细胞数量增加,其中OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组,差异有统计学意义[(95.50士4.77)/5 mm与(74.83±4.17)/5 mm,t=8.00,P＜0.01].常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强,TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组,差异有统计学意义[(49.50±6.38)/5 mm与(28.17±6.24)/5 mm,t=5.86,P＜0.01)].常氧组P17小鼠视网膜中CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α共表达的小胶质细胞数量分别为(1.17±0.75)/5 mm、0和0,而OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的小胶质细胞数量多于OIR组,差异有统计学意义[(44.50±8.78)/5mm与(28.50±5.61)/5 mm,F=44.07,P＜0.01;(24.10±6.49)/5 mm与(16.00±3.46)/5 mm,F=11.31,P＜0.01;(33.83±14.82)/5 mm与(23.00±2.83)/5 mm,t=19.92,P＜0.01]. 结论 TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路,促进血管生长因子及炎性因子的释放有关.     

盐酸奥洛他定滴眼液对过敏性结膜炎小鼠结膜M细胞增殖及白细胞介素4、JAK1、STAT6表达的影响

目的　探讨盐酸奥洛他定滴眼液对过敏性结膜炎小鼠结膜M细胞增殖及白细胞介素4（interleukin 4,IL-4）、JAK1、STAT6表达的影响。方法　选取SPF级Barb/c小鼠18只,随机分为空白对照组、模型组、治疗组,每组6只;用卵清蛋白和 Al（OH）₃ 对模型组和治疗组小鼠造模。造模后治疗组采用盐酸奥洛他定滴眼液治疗,每天滴眼2次,每次1滴;模型组滴加等量生理盐水,空白对照组不做处理。采用免疫荧光法检测各组小鼠眼睑结膜M细胞数;ELISA检测各组小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量;RT-PCR检测眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA相对表达量;Western blot法检测眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量。结果　眼睑结膜组织免疫荧光检测结果显示,模型组标本中M细胞阳性率远高于空白对照组（P<0.05）;治疗组M细胞阳性率有所下降,低于模型组（P<0.05）,但仍高于空白对照组（P<0.05）;推测过敏性结膜炎病程与M细胞阳性率升高有关。ELISA检测结果显示,模型组血清中IL-4、JAK1、STAT6含量远高于空白对照组（均为P<0.05）;治疗组IL-4、JAK1、STAT6含量均较模型组显著下降（均为P<0.05）;治疗组血清中IL-4、JAK1、STAT6含量均稍高于空白对照组（均为P<0.05）;推测过敏性结膜炎发病过程中伴随血清中IL-4、JAK1、STAT6含量变化。眼睑组织中,模型组JAK1、STAT6 mRNA以及蛋白相对表达量均远高于空白对照组（均为P<0.05）;治疗组JAK1、STAT6 mRNA以及蛋白相对表达量较模型组显著下降（均为P<0.05）,与空白对照组相比,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　M细胞增殖与过敏性结膜炎病程具有相关性,其增殖可能与IL-4-JAK1-STAT6 信号通路的激活相关。     

葡萄膜炎患者血清干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平的检测及意义

目的 观察急性葡萄膜炎患者治疗前后血清干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平变化，探讨其在急性葡萄膜炎发生发展过程中的作用。方法 连续收集各类急性葡萄膜炎患者75例，用酶联免疫吸附试验测定其急性期和治疗后恢复期血清IFN-γ、TNF-α和IL-6水平，并与同期收集的30例健康人血清IFN-γ、TNF-α和IL-6检测结果进行比较。结果 葡萄膜炎患者急性期血清IFN-γ、 TNF-α和IL-6水平明显高于治疗恢复期和对照者（F=65.805、50.418、155.381，P=0.000），并且与其初诊时视力呈明显负相关（r=-0.656、-0.592、-0.653，P=0.000），3种细胞因子之间呈正相关（r=0.340、0.467、0.338，P＜0.05）。结论 INF-γ、TNF-α和IL-6在急性葡萄膜炎患者血清中明显升高，治疗后均下降，表明这些细胞因子参与了葡萄膜炎的发生和发展过程。