角膜缘干细胞缺乏对角膜上皮损伤修复的影响

目的探讨角膜缘干细胞的功能。方法采用生物医学图像分析系统,计算切除角膜缘上皮组织的兔眼的角膜上皮愈合速率;用光学显微镜观察角膜上皮损伤修复过程的组织学变化。结果在角膜上皮损伤８～３２小时内,实验组与对照组角膜上皮愈合速率分别为１．２２±０．１９ｍｍ２／ｈ和１．４５±０．２０ｍｍ２／ｈ（ｔ＝３．８９,Ｐ＜０．０１）,实验组角膜上皮损伤愈合速度明显比对照组慢。实验组角膜可见大量的杯状细胞和新生血管,并随时间而逐渐向中央区发展。结论实验结果进一步证实了角膜上皮干细胞存在于角膜缘,角膜缘干细胞缺失,可使角膜上皮增殖能力丧失,角膜缘屏障功能下降,导致持续性角膜上皮糜烂、结膜组织长入和新生血管形成。     

兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中作用的实验研究

利用显微手术切除＋０．２５Ｎ氢氧化钠溶液碱烧伤的方法制备动物实验模型。观察兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中的作用。结果显示：全周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，角膜上皮愈合时间长（２５．８天）。愈合后含有大量新生血管和杯状细胞，呈现结膜上皮表型。半周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，上皮愈合时间缩短（６．３天），含有少量新生血管和杯状细胞。保留角膜缘上皮单纯角膜上皮缺损组，上皮愈合时间最短（３天），无新生血管及杯状细胞，呈角膜上皮表型。结果表明：角膜缘上皮干细胞在角膜上皮损伤愈合中起着极重要的作用，是损伤后角膜上皮再生的源泉。     

不同剂量链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠角膜病变模型的对比研究

目的 比较研究单次高剂量和多次低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔内注射诱导糖尿病小鼠角膜病变的成模情况及其病理表现的异同。 方法 正常6～8周龄雄性C57BL/6小鼠80只,随机分为正常对照组、多次低剂量1个月组、多次低剂量3个月组(60 mg/kg STZ连续腹腔内注射5次)和单次高剂量1个月组(150 mg/kg STZ腹腔内注射1次),每组20只。比较各模型组小鼠成活率、糖尿病成模率、平均体质量、糖化血红蛋白(HbA1c)水平。各组小鼠均行角膜上皮刮除术,采用荧光素钠染色法检测角膜上皮的缺损面积百分比。采用免疫荧光染色法检测角膜上皮p-Akt、Sirt1和Ki67的表达情况。采用Cochet-Bonnet触觉测量器检测角膜上皮刮除前、刮除后3、7、10和14 d角膜敏感度,采用免疫荧光染色检测角膜上皮刮除前、刮除后14 d角膜神经密度。 结果 多次低剂量1个月组、多次低剂量3个月组和单次低剂量1个月组小鼠糖尿病成模率分别为90%、80%和70%。各糖尿病模型组小鼠血液HbA1c水平较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义(均 P<0.05);各糖尿病模型组间小鼠血液HbA1c水平比较,差异均无统计学意义(均 P>0.05)。角膜上皮刮除后24 h和48 h,多次低剂量3个月组和单次高剂量1个月组小鼠角膜上皮缺损面积百分比均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。多次低剂量3个月组和单次高剂量1个月组小鼠角膜上皮p-Akt、Sirt1和Ki67的荧光强度均低于正常对照组。角膜上皮刮除前和刮除后14 d,多次低剂量1个月组小鼠角膜敏感度、角膜神经密度与正常小鼠相比,差异均无统计学意义(均 P>0.05);但多次低剂量3个月组和单次高剂量1个月组小鼠角膜神经敏感度、角膜神经密度明显下降,与正常对照组相比差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论 低剂量STZ注射1个月不能诱导糖尿病小鼠出现角膜病变特征,而高剂量STZ注射后1个月和低剂量STZ注射后3个月的糖尿病小鼠出现典型的角膜上皮和神经病变,可作为研究1型糖尿病性角膜病变的理想动物模型。     

贝伐单抗对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎角膜新生血管和瘢痕形成的抑制作用

背景 单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)可诱导发生角膜新生血管和炎症反应,传统的治疗药物为阿昔洛韦(ACV),研究已证实贝伐单抗具有抑制新生血管的作用,但其是否对HSK发挥治疗作用值得研究. 目的 研究贝伐单抗对小鼠HSK角膜瘢痕和新生血管的抑制作用.方法 利用体外培养并感染的Vero细胞生产单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1),以无血清DMEM培养基于冰上对HSV-1进行10倍梯度稀释后制备成HSV-1液.选用SPF级雄性6～8周龄C57 BL/6小鼠200只,用0.6μl滴度为l×l0 7空斑形成单位(PUF)/ml的HSV-1行小鼠角膜基质注射以制备HSK模型,将模型眼分为单纯ACV注射组、ACV+贝伐单抗注射组和生理盐水注射组,按照分组分别于感染后5、8、11和14d选择角膜混浊评分为1分的模型眼结膜下注射50μg ACV、50 μg ACV+5 μl贝伐单抗和5μl生理盐水.此外采用紫外线照射均有轻度新生血管和瘢痕的6只模型小鼠双眼诱导HSK复发,于复发后0、2、4和6d行5μl贝伐单抗(25 mg/ml)右眼结膜下注射,左眼结膜下注射5 μl生理盐水.于造模后5、7、11、14和17d以及复发的0、2、4和6d行小鼠角膜裂隙灯显微镜检查并用角膜知觉测量仪行中央角膜敏感度检测;制备角膜铺片,采用免疫荧光检测法检测角膜中CD31和βⅢTubulin荧光表达以评估角膜新生血管和角膜神经纤维分布;采用Image J软件测定角膜新生血管面积和瘢痕面积. 结果 HSK成模率达80％以上,造模后7d和复发后2d角膜混浊最重,造模后15 d和复发后2d角膜新生血管面积最大.造模后模型眼中央角膜敏感度逐渐降低,于造模后9d下降到最低.ACV+贝伐单抗注射组角膜病变面积小于单纯ACV注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠中央角膜敏感度为5.50±0.71,明显高于生理盐水注射组的0.50±1.41,差异有统计学意义(Z=-2.397,P=0.029).ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜病变面积增长率为(167.10±52.53)％,低于生理盐水注射组的(312.30±74.18)％,差异有统计学意义(Z=-1.992,P=0.046).实时荧光定量PCR显示造模后7d,模型眼角膜及同侧三叉神经节(TG)中胸苷激酶(TK)和感染细胞蛋白-27(ICP-27) mRNA相对表达量均较高,造模后45 d明显下降,诱导复发后2d TKmRNA和ICP-27 mRNA均再次升高,复发后7d表达量降至最低.造模后45 d同侧TG中均可见LAT mRNA表达量达峰值,诱导复发后2d相对表达量下降,复发后7d相对表达量再次升高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).角膜铺片结果显示,造模后生理盐水注射组小鼠较正常对照小鼠角膜新生血管明显增加,角膜神经纤维明显减少,单纯ACV注射组和ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜新生血管少于生理盐水注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜神经纤维较生理盐水组注射组和单纯ACV注射组均增加.结论 贝伐单抗结膜下注射可抑制HSK模型小鼠角膜新生血管生成和瘢痕形成,与ACV联合应用时二者有协同作用.     

蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1000μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。     

蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的 通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法 采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10 000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果 蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1 000 μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论 蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。     

Slit2对糖尿病模型小鼠角膜上皮和神经的保护作用及其机制

目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组,每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角...     

Slit2对糖尿病模型小鼠角膜上皮和神经的保护作用及其机制

目的 探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。 方法 选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组,每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角膜上皮损伤修复模型,Slit2注射组于造模后即刻结膜下注射Slit2重组蛋白,糖尿病模型组小鼠结膜下注射等容量PBS,正常对照组不做处理。采用角膜荧光素染色法观察小鼠角膜上皮缺损后24、48和72 h愈合情况;采用实时荧光定量PCR法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2及其相关受体mRNA的表达;采用角膜铺片β-tubulin Ⅲ荧光染色法观察小鼠角膜神经形态变化;采用免疫荧光法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2的表达分布及修复的角膜上皮中Slit2、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、β-连环蛋白(β-catenin)和Ki67的表达。将小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)分为正常对照组、高糖组和Slit2干预组。采用Western blot法检测各组细胞中p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和β-catenin的表达;取高糖培养的TKE2,采用Western blot法检测0.01、0.1和0.5 μg/ml Slit2处理10 min及0.5 μg/ml的Slit2处理前和处理后10、20、30、60、120 min时p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的表达。原代培养各组小鼠三叉神经节(TGs)细胞,采用β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色法观察Slit2对于TGs细胞轴突再生的影响。 结果 角膜上皮刮除后48 h和72 h,与正常对照组和Slit2注射组比较,糖尿病模型组小鼠角膜上皮修复速度明显减慢。糖尿病模型组小鼠正常角膜上皮中Slit2及其Robo1、Robo2、Robo4受体mRNA相对表达量明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。糖尿病模型组损伤修复的角膜上皮中Slit2免疫荧光强度明显弱于正常对照组。角膜铺片神经荧光染色显示,与糖尿病模型组比较,角膜上皮损伤后7 d Slit2注射组角膜神经丛致密,神经纤维数量增多且分布均匀,神经末梢可见较多分支。正常对照组和Slit2注射组修复的角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、β-catenin和Ki67荧光明显强于糖尿病模型组。高糖组TKE2细胞内p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相对表达量均明显低于正常对照组和Slit2干预组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Slit2处理高糖培养TKE2细胞后10 min,p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相对表达量较处理前均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),随着Slit2质量浓度的增加,TKE2细胞中p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相对表达量逐渐升高,Slit2质量浓度为0.5 μg/ml时对EGFR和AKT信号通路的活化作用最明显。高糖组体外培养的TGs突触长度为(40.52±5.44)μm,明显短于正常对照组的(72.14±9.48)μm和Slit2注射组的(73.04±4.66)μm,差异均有统计学意义(均P<0.05)。 结论 Slit2通过激活EGFR信号通路对糖尿病模型小鼠角膜上皮发挥保护作用,并通过增加角膜上皮下神经丛密度和促进TGs细胞轴突生长,发挥神经保护能力。     

Cx3cr1抗体玻璃体腔注射对视网膜缺血—再灌注损伤模型小鼠视网膜微循环的保护作用及其机制

目的 探讨小胶质细胞活化抑制剂C-X3-C基序趋化因子受体1(cx3cr1)抗体玻璃体腔注射对视网膜缺血—再灌注损伤(RIR)过程中视网膜微循环的保护作用及其可能机制。 方法 采用随机数字表法将150只成年健康C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型组和cx3cr1抗体注射组,每组各50只。空白对照组小鼠仅玻璃体腔注射无菌注射用水2 μl,模型组小鼠采用前房灌注升高眼压法建立RIR模型,cx3cr1抗体注射组小鼠玻璃体腔注射0.2 μg/μl cx3cr1抗体2 μl,注射后4 h建立RIR模型。于造模后3 d采用免疫荧光染色法检查各组小鼠实验眼冰冻切片中各层视网膜结构Iba-1阳性表达以评估小胶质细胞活化情况;采用视网膜铺片血管染色法观察视网膜深层和浅层血管密度变化及活化小胶质细胞数以评估视网膜微循环改变;采用FITC-dextran造影法测定视网膜血管渗漏面积;采用实时荧光定量PCR法测定视网膜中缺氧相关因子及炎性因子mRNA表达变化。 结果 眼球冰冻切片免疫荧光染色结果显示,空白对照组中Iba-1阳性小胶质细胞稀疏分布于视网膜神经节细胞层和内丛状层,呈分支形态;模型组Iba-1阳性细胞数量明显增多,呈阿米巴样或球形,并明显向外丛状层、外核层等视网膜外层移动;cx3cr1抗体注射组球形或阿米巴样的Iba-1阳性细胞数较模型组明显减少;模型组小鼠视网膜各层活化小胶质细胞数明显多于空白对照组和cx3cr1抗体注射组,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与模型组比较,cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜血管周围活化小胶质细胞数量明显减少。视网膜铺片血管与活化小胶质细胞共染色结果显示,空白对照组和cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜深层血管密度均明显高于模型组,cx3cr1抗体注射组浅层及深层视网膜血管周围小胶质细胞数量较模型组明显减少,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。空白对照组、模型组和cx3cr1抗体注射组血管相对渗漏率分别为(100.0±4.7)%、(162.1±10.6)%和(130.5±9.5)%,总体比较差异有统计学意义( F＝128.66, P<0.01),cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜血管相对渗漏率明显低于模型组,差异有统计学意义( P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与模型组比较,cx3cr1抗体注射组和空白对照组小鼠视网膜中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论 Cx3cr1抗体玻璃体腔注射可对RIR模型小鼠的视网膜微循环系统血管完整性发挥保护作用。     

枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液冲洗对小鼠急性角膜化学伤眼表的保护作用

背景 角膜化学性烧伤后即刻进行眼部冲洗是防止化学性物质进一步损伤眼组织的关键步骤,而理想的冲洗液才能有效地中和化学物质,改善患眼的预后. 目的 评价自制的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠-氯化钾缓冲液对小鼠急性角膜酸、碱烧伤的治疗效果. 方法 配制pH值为7.4的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(缓冲液1)和枸橼酸-磷酸氢二钠-氯化钾缓冲液(缓冲液2).采用计算机取随机数方法将120只6～8周龄清洁级雄性C57小鼠随机分为酸烧伤模型组和碱烧伤模型组,分别用1 mol/L硫酸和0.15 mol/L氢氧化钠滤纸贴附于中央角膜制备急性角膜酸、碱烧伤模型,造模后即刻按照亚分组分别用40 ml缓冲液1、自来水、缓冲液2进行冲洗,未冲洗的模型鼠作为对照.分别于造模后和冲洗后3、7、14d在裂隙灯显微镜下按照角膜混浊程度进行评分,并观察各组小鼠角膜上皮荧光素染色阳性率、角膜新生血管和角膜溃疡发生率.结果 角膜酸烧伤后3、7和14 d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜混浊评分为1分的眼数均明显多于不冲洗组,差异均有统计学意义(均P＜0.01);角膜酸烧伤后3d,缓冲液1冲洗组角膜混浊度为1分的眼数明显多于自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组,差异均有统计学意义(x2=11.000,P=0.001;x2 =4.000,P=0.046);角膜酸烧伤后7d,缓冲液1冲洗组角膜混浊度为1分的眼数明显多于自来水冲洗组,差异具有统计学意义(X2 =6.000,P=0.014);角膜酸烧伤后14d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组不同角膜混浊评分的眼数差异均无统计学意义(均P＞0.05).碱烧伤后3、7、14 d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜混浊度评分为1分和2分的眼数均明显多于不冲洗组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).角膜酸烧伤后7d,缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组角膜溃疡发生率分别为7％、27％和13％,均明显低于不冲洗组的73％,差异均有统计学意义(P=0.000、0.027、0.003);角膜碱烧伤后3、7、14 d角膜溃疡发生率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).角膜酸烧伤后14 d,不冲洗组角膜新生血管发生率为50％,而缓冲液1冲洗组、自来水冲洗组和缓冲液2冲洗组小鼠未见角膜新生血管.角膜碱烧伤后各组小鼠在各时间点均未发现角膜新生血管. 结论 pH值为7.4的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液对急性角膜酸、碱烧伤进行即刻冲洗均有较好的治疗效果,冲洗液中是否添加氯化钾对预后无明显影响.