miR-146a对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的:探讨微小RNA-146a(miR-146a)对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养HRMECs,采用含5.5 mmol/L D-葡萄糖或25 mmol/L D-葡萄糖的培养液培养48 h,分别记为正常对照组和高糖组。另取正常培养的HRMECs采用脂质体转染法...     

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。     

周细胞对缺氧诱导下视网膜微血管内皮细胞增生的影响

目的探讨视网膜微血管内皮细胞（RMECs）与共培养的周细胞（PCs）及PCs条件培养液（PCM）对常氧和缺氧条件下RMECs增生的影响。方法传代培养大鼠RMECs和PCs,采用兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体和小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体免疫组织化学法鉴定RMECs,PCs采用小鼠抗大鼠desmin多克隆抗体和兔抗鼠抗血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β）进行免疫荧光双标鉴定。Millicell小室建立PCs和RMECs共培养系统,PCs培养近融合期后制备PCM,向共培养系统或PCM中加入终浓度为200μmol/L的CoCl2诱导形成细胞化学缺氧模型,观察常氧和缺氧条件下PCs和PCM对RMECs增生的影响。使用MTT法、3H-TdR掺入法检测RMECs在不同培养条件下的增生数量,并用流式细胞仪检测RMECs在不同细胞周期的细胞率。结果近融合期的RMECs呈类纺锤状、单层生长,可见明显的接触抑制,Ⅷ因子和CD31均阳性表达。PCs形状不规则,细胞重叠生长无接触抑制,PDGFR-β和desmin抗体双标阳性。缺氧3～9d缺氧RMECs单独培养组较常氧RMECs单独培养组各时间点的RMECs均明显增生,缺氧6d时增生达高峰（P〈0.01）,细胞生长抑制率（GIR）为-24.9%。缺氧共培养组较缺氧RMECs单独培养组RMECs增生下降（P〈0.05）。缺氧3、6、9d时常氧共培养组较常氧RMECs单独培养组RMECs数目均明显下降（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）。缺氧6d时S期RMECs数量明显增加,占各期细胞总数的（43.9±0.8）%;常氧或缺氧共培养组,PCs均可抑制RMECs的增生,S期细胞分别占各期细胞总数的（3.6±0.1）%、（15.1±0.9）%（P〈0.05,P〈0.01）。常氧PCM组RMECs的吸光度（A）值和3H-TdR掺入量4～24h均低于对照组（P〈0.05）。结论缺氧和常氧条件下RMECs和PCs共培养时PCs均可抑制RMECs的增生,常氧条件下PCM可抑制RMECs的增生。     

15羟二十四碳四烯酸对缺氧视网膜微血管内皮细胞增生的抑制作用及其机制

背景 缺氧导致的视网膜新生血管性疾病已成为主要的致盲疾病,目前临床上缺乏有效的化学治疗方法,因此,研究其发病的分子机制从而指导临床用药十分关键. 目的 探讨15羟二十四碳四烯酸（15-HETE）对缺氧条件下培养的视网膜微血管内皮细胞（RMVECs）增生、凋亡的影响及其作用通路. 方法 分离C57BL/6J小鼠的RMVECs并用细胞除杂法进行培养,用间接免疫组织化学及免疫荧光检测法鉴定培养的细胞对内皮细胞的特征性标志物Ⅷ因子相关抗原的反应.将生长良好的细胞分为常氧组和缺氧组,后者以终浓度为125 μmol/L的CoCl2处理细胞建立缺氧模型.各组细胞换无血清含内皮细胞生长添加剂（ECGS）和高糖的DMEM培养基继续培养48 h,再按照培养基中加入15-HETE浓度的不同（终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0μmol/L）分别将常氧组和缺氧组细胞亚分为4个组.各组细胞分别用15-HETE处理48 h,然后用MTT法检测各组细胞的增生值（吸光度,A值）,并计算15-HETE的抑制率;分别采用逆转录PCR（RT-RCR）法及Western blot法检测各组RMVECs中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、bcl-2和caspase-3 mRNA及其蛋白的相对表达量. 结果 间接免疫组织化学法检测结果显示,培养的细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,细胞阳性率为（94.38±4.25）％.常氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值（A值）的差异无统计学意义（F=0.283,P=0.837）,但缺氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值的差异有统计学意义（F=702.582,P＜0.001）,其中缺氧＋1.0 μmol/L 15-HETE处理组、缺氧＋5.0 μmol/L 15-HETE处理组RMVECs增生值明显低于单纯缺氧培养组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.0.1、1.0、5.0μmol/L 15-HETE处理组对RMVECs的抑制率分别为（1.09±0.31）％、（21.09±3.53）％和（49.86±4.15）％,随着15-HETE浓度的增加,抑制率逐渐升高.常氧条件下各组bcl-2、c     

胰岛素样生长因子1对人视网膜血管内皮细胞生物学行为的促进作用及其机制

背景 抑制视网膜新生血管形成是目前相关眼病治疗的主要目标之一,而寻找视网膜新生血管形成过程中的干预靶点是研究的热点.研究表明,胰岛素样生长因子1(IGF-1)可促进血管内皮细胞增生及抑制血管内皮细胞凋亡,但其是否可以作为视网膜新生血管类眼病的治疗靶点尚不清楚. 目的 探讨IGF-1对体外培养的人视网膜血管内皮细胞(HRECs)的迁移、凋亡和管腔形成能力的作用及其机制.方法 对HRECs进行体外培养,取对数生长期的细胞进行实验.采用逆转录PCR法检测培养细胞中IGF-1受体(IGF-1R)mRNA的表达.按照检测指标的不同分别于培养液中添加不同质量浓度IGF-1溶液培养细胞,待细胞生长至约90％融合后用无菌移液枪头垂直于培养板底划痕,用Photoshop CS4软件检测、计算和比较0、10和200 ng/ml IGF-1组划痕后12 h和24 h与划痕前HRECs迁移的面积差(试验前面积-试验后面积,△S);采用流式细胞术测定并比较0 ng/ml IGF-1组与1 000 ng/ml IGF-1组细胞培养后24 h HRECs凋亡比例的差异;采用Matrigel体外三维成型法检测并比较0、10、100和200 ng/ml IGF-1组细胞培养后24 h完整管腔的形成数量;采用实时荧光定量PCR法检测并比较0、500及1 000 ng/ml IGF-1组细胞培养后6 h HRECs中血小板衍生因子(PDGF)-BB和caspase-3 mRNA的相对表达量. 结果 HRECs培养后2～3d达90％以上融合,细胞排列紧密,琼脂糖凝胶电泳结果显示IGF-1R mRNA呈阳性表达.划痕后12 h和24 h,各组HRECs的△S随着IGF-1质量浓度的增加而逐渐增加,划痕后24h,200 ng/ml IGF-1组HRECs的△S为(4.83±0.61) ×105 μm2,较0 ng/ml IGF-1组的(3.28±0.64) ×105 μm2明显增大,差异有统计学意义(t=-3.707,P=0.021).0 ng/mlIGF-1组与1 000 ng/ml IGF-1组凋亡细胞比例分别为(18.77±2.37)％和(12.05±0.88)％,差异有统计学意义(t=2.869,P=0.046).200 ng/ml IGF-1组HRECs完整管腔形成数量为(20.33±2.83)个/孔,数目高于0 ng/ml IGF-1组的(17.94±1.96)个/孔,差异有统计学意义(t=-2.940,P=0.042).与0 ng/ml IGF-1组比较,1 000 ng/ml IGF-1组细胞中PDGF-BB mRNA的相对表达量明显升高,而caspase-3 mRNA的相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(t=-3489,P=0.025;t=7.287,P=0.002).结论 IGF-1促进体外培养HRECs的迁移和血管管腔形成,抑制HRECs凋亡,其作用机制可能与上调HRECs中PDGF-BB的表达及下调caspase-3的表达有关.     

丝胶对糖尿病大鼠视网膜微血管的保护作用及其作用机制

背景 糖尿病视网膜病变(DR)是一种慢性炎症性疾病,并伴有微血管病变.研究证实丝胶具有抗炎和抗氧化功能,但其是否对DR早期的微血管结构和功能有保护作用目前仍不十分清楚. 目的 观察丝胶对糖尿病大鼠视网膜中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、Cx43表达的影响,探讨其对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的防护作用.方法 将48只SPF级健康雄性SD大鼠按计算机数字随机分配法分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组,每组12只.糖尿病模型组、丝胶治疗组、羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠均采用链脲佐菌素(STZ)连续腹腔内注射3d并给予高脂饲料饮食法制备糖尿病大鼠模型,成模后分别用生理盐水、2.4 g/(kg·d)丝胶溶液和0.2 g/(kg·d)羟苯磺酸钙灌胃3个月.采用过量麻醉法处死大鼠并制备视网膜标本,采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜组织的形态学变化.分别采用Western blot法和逆转录PCR技术检测大鼠视网膜中ICAM-1、VCAM-1和Cx43蛋白及其mRNA的相对表达量,并对各组检测结果进行比较. 结果 正常对照组大鼠视网膜组织结构正常,糖尿病模型组视网膜可见内界膜肿胀或断裂,偶见突出于内界膜的毛细血管内皮细胞,视网膜神经节细胞(RGCs)数量减少,丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠视网膜内界膜轻度增厚,内外核层细胞排列稍欠规则.糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙组阳性对照大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量较正常对照组大鼠均明显升高,而Cx43相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与糖尿病模型组比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量均明显降低(0.8343±0.032 l与0.918 9±0.042 4、0.7264±0.011 2与1.235 0±0.078 9),而Cx43相对表达量明显升高(0.133 1±0.015 3与0.039 2±0.002 0),差异均有统计学意义(均P＜0.05).与正常对照组比较,糖尿病组大鼠视网膜中ICAM-1mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显升高,而Cx43 mRNA表达明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与糖尿病模型组大鼠比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显下降(0.716 3±0.008 6与0.956 8±0.012 5;0.393 7±0.035 0与0.477 9±0.020 6),而Cx43 mRNA表达明显升高(0.676 8±0.064 8与0.4308±0.1113),差异均有统计学意义(均P＜0.05),各组ICAM-1 mRNA、VCAM-1mRNA和Cx43 mRNA相对表达量的变化趋势与其蛋白表达相同. 结论 丝胶能够减轻糖尿病大鼠早期视网膜的微血管病变,从而对DR的发生和发展发挥防护作用,其机制可能是下调视网膜中ICAM-1和VCAM-1的表达以及上调Cx43的表达.     

IGF-I对视网膜新生血管形成的调控及其信号转导机制

视网膜新生血管形成是多种眼病的共同病理过程.IGF-1及其相关因子和信号转导机制对视网膜新生血管的形成和发展起重要的调控作用.IGF-I是一种结构和功能都与胰岛素类似的多肽类神经营养因子,具有广泛的生物学活性,与其受体结合后,能激活酪氨酸蛋白激酶,磷酸化特异性底物,激活PI-3K/Akt和MAP-K依赖信号途径后导致HIF-1α、JNK/AP-1激活和VEGF mRNA表达,调控细胞的生长、增生、分化、迁移、抑制细胞凋亡,通过对IGF-I的干预,可能是预防视网膜新生血管的一个新途径.     

miR-30b对大鼠糖氧剥夺性视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 缺血缺氧损伤是引起大部分视觉系统损害的主要原因,目前尚无有效药物从根本上缓解缺血缺氧带来的损害.研究发现,微小RNA(miR)-30b有助于减轻缺血缺氧导致的心肌损伤,但其对糖氧剥夺的视网膜神经节细胞(RGCs)生存是否有类似的保护作用鲜有文献报道. 目的 研究重组腺相关病毒介导的miR-30b转染对糖氧剥夺RGCs的保护作用.方法 取出生后24 h的8只SD大鼠眼球,剥离出视网膜组织以进行RGCs的原代培养,将原代培养的细胞分为重组腺相关病毒(rAAV)-miR对照组、rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR-30b抑制物组和PBS组,分别在培养液中添加rAAV-miRNA、rAAV-miR-30b拟似物、rAAV-miR-30b抑制物或PBS培养细胞6d,RGCs∶AAV为1∶10 000.各组细胞分别进行低氧培养箱(37 ℃,体积分数5％ CO2、17％ N2、3％ O2)联合低糖(葡萄糖质量浓度为1.0 g/L)培养液进行培养以建立原代糖氧剥夺RGCs模型,并与正常培养(37℃、5％ CO2)的细胞进行对照.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞活力,采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物TubulinⅢ的表达,并计算存活RGCs数目.采用Hoechst/PI染色法检测各组细胞的凋亡和坏死情况. 结果 培养7d的正常成熟RGCs可见1-3条完整的细长神经元突起及其分支.糖氧剥夺后随着时间延长,培养的RGCs逐渐减少和破坏,突起的主干结构破碎.rAAV-miR-30b拟似物组细胞相对活性分别为3.310±0.162,明显高于rAAV-miR-30b抑制物组和rAAV-miR对照组的0.949±0.141和0.900±0.181,差异均有统计学意义(t=10.508、10.296,均P＜0.001).存活的RGCs可表达TubulinⅢ,呈红色荧光.rAAV-miR-30b拟似物组TubulinⅢ阳性细胞数量为(13.800±1.924)/视野,明显多于rAAV-miR-30b抑制物组的(0.600±0.548)/视野和rAAV-miR对照组的(0.800±1.304)/视野,差异均有统计学意义(￡=15.141、14.912,均P＜0.001).rAAV-miR-30b拟似物组、rAAV-miR对照组和PBS组细胞凋亡率和死亡率的总体比较差异均有统计学意义(F=10.851,P=0.002;F=6.378,P=0.013),rAAV-miR-30b拟似物组细胞凋亡率和死亡率均明显低于rAAV-miR对照组和PBS组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 低氧培养箱联合低糖培养液建立稳定的原代RGCs糖氧剥夺模型;rAAV介导的miR-30b转染可抵抗糖氧剥夺对RGCs的损伤.     

密蒙花提取物对高糖下人视网膜血管内皮细胞增生及VEGF表达的影响

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病严重的微血管并发症之一,其病理特征为视网膜新生血管形成,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）能特异性地作用于视网膜血管内皮细胞,是最直接的眼内新生血管形成因子之一。密蒙花是用于治疗眼部疾病的一种中药,具有维生素P样作用,能降低皮肤和小肠血管的通透性及脆性。     

血管内皮生长因子干扰RNA对鼠视网膜中血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）小片段干扰RNA（small interference RNA,siRNA）对鼠视网膜VEGF mRNA的抑制作用,探讨其对视网膜新生血管治疗的可行性.方法 体外培养人鼻咽癌细胞（CNE-2Z）,分成正常氧培养组（20% O2）和低氧培养组（1% O2）.采用脂质体（LF 2000）将VEGF siRNA转染两组细胞,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达,确立VEGF siRNA对VEGFmRNA的抑制效率.然后,建立高浓度氧（75%）诱导的C57BL./6J小鼠视网膜新生血管动物模型,以脂质体为载体,将VEGF siRNA重组质粒注射到鼠玻璃体腔内,RT-PCR检测视网膜组织中VEGF mRNA的表达水平.结果 正常氧培养的CNE-2Z细胞有VEGF mRNA表达,低氧状态下VEGFmRNA表达增多,两者之间差异有显著性（P＜0.01）;与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P＜0.01）;正常氧状态下VEGF siRNA的抑制效率比低氧状态高.高浓度氧诱导的C57BL/6J小鼠视网膜新生血管动物模型中,玻璃体腔注射VEGF siRNA组视网膜组织中VEGF mRNA表达明显下降（P＜0.01）.结论 VEGF特异的siRNA能有效地抑制人鼻咽癌细胞CNE-2Z和C57BL/6J 小鼠视网膜新生血管动物模型视网膜中VEGF mRNA的表达.     

视网膜微血管内皮细胞培养及血管二维模型的建立

目的 培养人视网膜微血管内皮细胞，建立人视网膜血管体外二维模型。 方法 人视网膜血管内皮细胞在纤维连接蛋白包被的细胞培养池内，以无血清人内皮细胞培养基培养，形成二维血管模型。用辣根过氧化酶检测其通透性。部分血管模型加入5 ng/ml的血管内皮生长因子培养，与无血管内皮生长因子培养形成的血管模型比较通透性的变化，观察血管内皮生长因子对血管通透性的影响。 结果2～4 d左右内皮细胞亚融合形成网状血管样结构，6 d左右形成较完整的二维血管模型。血管内皮生长因子可增大血管的通透性，促进血管生成。 结论 用人内皮细胞培养基可成功培养人视网膜血管内皮细胞；利用细胞培养池和无血清人内皮细胞培养基培养，可建立标准的体外视网膜二维血管模型。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 110-112)     

体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

目的 研究体外光动力疗法（PDT）诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡情况。 方法 将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度（1.0 μg/ml）相当的光敏剂verteporfin共同孵育，根据孵育时间的不同，每种细胞分成6组：0、5、15、30、60、120 min组。孵育至上述时间后，分别用光敏剂最大吸收波长光照（689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光），能量密度为2.4 J/cm2，光照时间为83 s。用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例，实验重复进行3次。 结果 PDT后3 h，血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为：0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02；RPE细胞各组的凋亡比例分别为：0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03；两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加；两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡，在相同的体外环境下，PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 253-255)     

二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制

背景 研究表明炎性过程参与糖尿病视网膜病变(DR)的发生和发展,而炎症作用的靶细胞为视网膜血管内皮细胞(RVECs).二甲双胍是临床上常用的降血糖药物,近年来表明其可发挥保护心血管、预防肿瘤和保护血-脑屏障等多重生物学效应,但其对炎症状态诱导的人视网膜血管系统异常是否具有防护作用尚不清楚. 目的 观察二甲双胍对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下人视网膜血管内皮细胞(RVECs)增生、移行以及分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-8(IL-8)的影响,探讨二甲双胍对炎症环境中人RVECs生物学行为的保护作用. 方法 对原代RVECs进行培养和传代并分为正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α(2.5 ng/ml)组、TNF-α+不同浓度(5、10、20、40 mmol/L)二甲双胍组,分别按照分组方法在培养液中添加相应药物处理24 h.分别于处理前及处理后24 h采用Image-Pro Plus Software 7.0软件计数各组细胞数目;采用MTS法检测各组RVECs的吸光度(A490)值以评价细胞的代谢活力;采用Transwell小室法检测各组迁移细胞数;采用ELISA法检测各组细胞上清液中MCP-1和IL-8质量浓度,并对各组间检测结果进行比较. 结果 正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α组、TNF-α+5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α +20 mmol/L二甲双胍组和TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目总体比较差异有统计学意义(F=189.31,P＜0.01);各组细胞代谢活力(A490值)分别为0.32+0.02、0.32±0.03、0.97±0.02、0.90土0.05、0.76±0.15、0.74±0.05和0.41±0.03;各组细胞移行数目分别为(1 214±49)、(1 200±45)、(1 648±43)、(1 309±48)、(1 279±73)、(961±60)和(942±106)/视野;各组细胞上清液中MCP-1质量浓度分别为(0.385±0.050)、(0.362±0.060)、(2.285±0.200)、(1.131±0.180)、(0.622±0.120)、(0.537±0.090)和(0.492±0.130) μg/ml,IL-8质量浓度分别为(0.385±0.080)、(0.390±0.120)、(1.123±0.130)、(0.899±0.180)、(0.680+0.060)、(0.417±0.090)和(0.335±0.100) μg/ml,组间A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度的总体比较差异均有统计学意义差异(F=73.31、103.89、150.92、268.32,均P＜0.01),TNF-α组细胞数目、4490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显高于正常对照组,TNF-α+ 10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+20 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目、A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显低于TNF-α组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 二甲双胍对TNF-α诱导的人RVECs增生、移行及分泌MCP-1、IL-8的能力均有抑制作用,从而可能对炎症环境中的RVECs发挥保护作用.     

二十碳五烯酸对体外培养的人血管内皮细胞增殖抑制效应的研究

目的探讨二十碳五烯酸（EPA）对体外培养的人血管内皮细胞增殖的抑制效应及其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法,应用酶联免疫检测仪,测定不同浓度EPA对体外培养的人血管内皮细胞吸光度（A）值的影响。采用重复测量的实验设计类型,观察EPA对体外培养的人血管内皮细胞抑制效应的剂量和时间依赖性。应用SPSS13．0软件对数据进行统计学处理。各组间A值和细胞增殖抑制率的比较,采用单因素和重复测量设计的方差分析。应用流式细胞仪检测EPA对体外培养的人血管内皮细胞周期、增殖指数及凋亡的影响,检测结果应用R×C列联表的x^2检验进行统计学分析。结果MTT比色法显示EPA浓度≥0．15g／L时,对体外培养的人血管内皮细胞A值降低的影响有统计学意义（0．15g／L EPA组与空白组比较P=0．014,0．20g／L EPA组与空白组比较P=0．001）,并随时间的延长而增强,与浓度无关;对其细胞增殖抑制率的影响亦有统计学意义（0．15g／L EPA组与空白组比较P=0．02,0．20g／LEPA组与空白组比较P=0．001）,且随时间的延长而增强。流式细胞仪分析结果显示,用药组细胞增殖指数为23．9％,低于未用药组（26．9％）,无凋亡峰出现,表明EPA仅通过影响细胞增殖周期的变化抑制细胞增殖,无直接促进凋亡的作用。结论EPA对体外培养的人血管内皮细胞增殖具有抑制效应,该效应是通过封闭flk-1受体和影响细胞增殖周期实现;EPA对体外培养的人血管内皮细胞无直接促进凋亡的作用,因此不会对体内正常的血管内皮细胞产生损害,具有良好的临床应用前景。     

腺病毒介导的重组Tum5基因对生理状态下脐静脉血管内皮细胞生物学行为的抑制作用

背景 肿瘤抑素是迄今发现活性最强的内源性血管生成抑制因子,对病理性新生血管形成有明显抑制作用.Tum5片段为肿瘤抑素的抗血管生成活性片断. 目的 研究腺病毒介导的Tum5重组基因过表达对生理状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、迁移及管腔形成的影响. 方法 构建表达绿色荧光蛋白的空载体腺病毒(rAd-GFP)和携带重组Tum5基因的腺病毒载体(rAd-Tum5).将HUVECs分为正常对照组、空载体组(rAd-GFP组)和Tum5基因组(rAd-GFP-Tum5组).将rAd-GFP和rAd-Tum5病毒颗粒(1×101o/ml)各20μl分别加入rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组培养液以感染培养的细胞48 h,倒置荧光显微镜下观察各组细胞中GFP的表达,并计算病毒的感染效率;采用细胞计数试剂盒(CCK)-8检测各组细胞在波长为450 nm处的吸光度(A)值并计算细胞增生率;采用Transwell小室实验测定各组的迁移细胞数目;采用基质胶(Matrigel)实验检测各组细胞的管腔形成数;采用人血管内皮生长因子(VEGF) ELISA试剂盒检测细胞感染后24、48和72 h各组细胞培养上清液中VEGF质量浓度. 结果 倒置荧光显微镜下可见rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组HUVECs中呈绿色荧光,rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组的感染效率分别为55.13％和50.31％.细胞感染后24 h和48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组细胞增生率比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);细胞感染后72 h,rAd-GFP-Tum5组细胞增生率明显低于正常对照组和rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数分别为(2 260.25±930.44)、(2 370.00±441.06)和(723.75±363.80)个,总体比较差异有统计学意义(F=8.524,P=0.008),rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数量较正常对照组和rAd-GFP组均明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组平均每张图片中管腔形成数目分别为(95.67±5.86)、(88.00±4.58)和(20.67±3.51)个,总体比较差异有统计学意义(F=226.498,P＜0.01),其中rAd-GFP-Tum5组细胞管腔形成数量较正常对照组和rAd-GFP组明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后24、48和72 h,各组细胞培养上清液中VEGF蛋白质量浓度总体比较差异均有统计学意义(F分组=73.260,P＜0.01;F时间码 =73.477,P＜0.01);其中感染后48 h和72 h,rAd-GFP-Tum5组VEGF质量浓度均明显低于rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 腺病毒介导的重组Tum5基因的过表达可抑制生理状态下HUVECs的增生、迁移及管腔形成,这可能与Tum5下调VEGF在细胞上清液中的含量有关.     

微囊化人内皮抑素/293细胞生物学性状及其对人脐静脉内皮细胞增生的抑制作用

目的 观察不同细胞密度的微囊化人内皮抑素/293(hES/293)细胞生物学性状及其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生的抑制作用.方法 采用聚电解质络合法制作不同密度微囊化hES/293细胞,分为1×104个/ml组(A组)、1×106个/ml组(B组)、1×108个/ml组(C组);同时将微囊内不包裹hES/293细胞者设为对照组(D组);每组6个样本.培养后1、3、7、14、35 d,锥虫蓝染色计数微囊囊内细胞总数、活细胞数和存活率;噻唑蓝(MTT)比色法检测各组微囊化hES/293细胞的生长情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测微囊化hES/293细胞囊外内皮抑素(ES)蛋白释放量.取生长状态良好的HUVEC分别与A、B、C、D组微囊化hES/293细胞共同培养.于共同培养后24、72、120 h,MTT比色法检测微囊化hES/293细胞对HUVEC增生的抑制作用.结果 A、B、C组微囊囊内hES/293细胞总数和活细胞数均随时间延长而增多,囊内细胞存活率于培养后3 d最高.A、B、C组微囊化hES/293细胞生长速率比较,培养后1 d时组间差异无统计学意义(P＞0.05);培养后3 d,A组较B、C组高,差异有统计学意义(P＜0.05);培养后7、14、35 d,B组较A、C组高,差异有统计学意义(P＜0.05).A、B、C组微囊化hES/293细胞囊外Es蛋白释放量比较,培养后1、14 d时组间差异无统计学意义(P＞0.05);培养后3 d,A组较B、C组高,差异有统计学意义(P＜0.05);培养后7、35 d,B组较A组高,差异有统计学意义(P＜0.05).共同培养后24 h,A、B、C组对HUVEC均未表现出抑制作用(P＞0.05);共同培养后72、120 h,A、B、C组均明显抑制HUVEC增生,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 细胞密度为1×106个/ml的微囊化hES/293细胞生长稳定、存活率较高,可持续稳定的释放ES蛋白.不同密度的微囊化hES/293细胞均可抑制HUVEC增生.

Abstract：

Objective To observe biological characteristics of microencapsulated human endostatin/293 (hES/293) cells at different density and their inhibitory effects on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods The microencapsulated hES/293 cells at different cellular density of 1 × 104 (group A) , 1 × 106 (group B) and 1 × 108 (group C) cells/ml were made by polyelectrolyte complexometry technology. The empty microcapsules were set as control group (group D). Each group has 6 samples. After 1, 3, 7, 14 and 35 days in culture, the number of total cells, viable cells was counted by trypan blue staining, and the survival fraction was measured. The grow status of hES/293 cells was measured by MTT assay, and the concentration of endostatin protein in supernatant was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). HUVECs were co-cultured with hES/293 cells of group A,B and C. The proliferation of HUVEC at the 24, 72 and 120 hours after co-culture was measured by MTT assay. Results The number of total cells and viable cells were increasing and the survival fraction reached its peak after 3 days in culture in group A, B and C. The growth rate in group A was higher than that in group B and C after 3 days in culture (P＜0.05), but the growth rate in group B was higher than that in group A and C after 7, 14 and 35 days in culture (P＜0.05). The concentration of endostatin protein in the supernatant was the same in group A, B and C after 1 and 14 days in culture (P＞0.05). However, group A had higher endostatin than group B and C after 3 days in culture, group B had higher endostatin higher than group A and C after 7 and 35 days in culture (P＜0.05). The hES/293 cells of group A, B and C had no effects on the proliferation of HUVEC (P＞0.05) after 24 hours co-culture, but can inhibit the proliferation of HUVEC after 72 or 120 hours co-culture (P＜0.05). Conclusions The microencapsulated hES/293 cells at a density of 1 X 106 cells/ml can grow and survive, and release endostatin protein stably.The microencapsulated hES/293 cells at different density all can inhibit the proliferation of HUVEC.     

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一,视网膜色素上皮(RPE)细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要. 目的 探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞(hRPECs)增生的影响.方法 将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA+高糖组,对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,干预组细胞先在DMEM/F12培养基中添加10 mmol/L的3-MA处理1h后,再添加30 mmol/L葡萄糖溶液进行培养.将培养的细胞以1×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞80％融合后用含体积分数0.5％胎牛血清的培养基继续孵育24 h,使细胞周期同步化.倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构;采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率;采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B(LC3B)蛋白的表达.结果 对照组细胞生长状态良好,细胞排列整齐;高糖组细胞体积稍增大,细胞数量明显多于对照组,而3-MA+高糖组细胞形态不规则,排列紊乱.透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形,亚细胞器形态均正常,未发现自噬小体;高糖组细胞中可见自噬溶酶体,而3-MA+高糖组可见自噬小体.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞的增生率分别为(100.0±2.0)％、(116.9±5.2)%和(103.7±4.7)％,总体比较差异有统计学意义(F=13.526,P=0.006),高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高糖组细胞中LC3B-Ⅰ蛋白表达减弱,LC3B-Ⅱ蛋白表达增强,而3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值分别为0.131±0.065、2.504±0.097和0.274±0.007,组间总体比较差异有统计学意义(F=1 694.676,P=0.000),高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生,而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞增生的作用.     

槲皮素对培养人视网膜色素上皮细胞增生及DNA合成的影响

目的研究槲皮素(quercetin, QUE)对培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞增生和DNA合成以及对表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)促RPE细胞增生和DNA合成作用的影响。方法用细胞计数和3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine, 3H-TdR)掺入方法,观察不同浓度(200、100、50、1μmol/L)的QUE和最大浓度的QUE(200μmol/L)在不同作用时间（24-168小时）,分别单独或与EGF共同作用时,对RPE细胞增生及DNA合成的影响,排除着色的死细胞,用活细胞计数法判断药物的细胞毒性作用。结果QUE 200μmol/L具有最强的抑制效应,48小时时抑制效应已明显出现,96小时时抑制达到高峰。与QUE单独作用相比,QUE对EGF的促RPE细胞增生效应能产生更强的抑制。QUE无细胞毒性作用,各实验组细胞活力均在85.00%以上。结论QUE以剂量依赖和时间依赖的方式抑制RPE细胞的增生,尤其是由EGF刺激的增生,并且对培养的RPE细胞无细胞毒作用。(中华眼底病杂志,1999,15:27-29)