野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Rb基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法：通过逆转录病毒载体介导，将野生型Rb基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Rb蛋白表达水平。结果：成功地构建和包装了人野生型Rb基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型Rb蛋白，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了49％。结论：人野生型Rb基因治疗时血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Ｒｂ基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用，方法；通过逆转录病毒载体介导，将野生型Ｒｂ基因的转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Ｒｂ蛋白表达水平，结果：成功地构建和包装了人野生型Ｒｂ基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；     

P53、Rb、IGF-I、AT1B基因转移对血管新生内膜增殖的影响

目的观察和比较人野生型ｐ５３基因、Ｒｂ基因、反义ＩＣＦ－Ｉ基因与大鼠反义ＡＴ１Ｎ基因对大鼠颈动脉损伤后新生 内膜增殖的影响。方法通过病毒载体介导,将上述４种基因分别转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中,２１ｄ后 观察并比较其对新生内膜形成的影响。结果与对照组相比,ｐ５３基因、Ｒｂ基因治疗组及反义ＩＧＦ－Ｉ基因治疗组的动脉 血管新生内膜／中层面积比均显著降低（ｐ＜０．０１）;与ＡｄＶβ ｇａｌ组相比,反义ＡｄＶＡＴ１Ｂ基因组的动脉血管新生内膜／中 层面积比显著降低（Ｐ＜０．０１）．而ｐ５３基因治疗组、Ｒｂ基因治疗组、反义ＩＧＦ－Ｉ基因组及反义ＡｄＶＡＴ１Ｂ基因组之间无显 著性差异（Ｐ＜０．０５）。结论上述４种基因对血管成形术后再狭窄可能均有一定的预防作用。     

腺病毒载体介导的大鼠反义血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ_B基因转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜增殖的影响

目的探讨腺病毒载体介导的大鼠反义血管紧张素Ⅱ受体ⅠＢ（ＡＴ１Ｂ）ＲＮＡ转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法利用重组腺病毒载体将大鼠反义ＡＴ１ＢＲＮＡ转移至大鼠颈动脉球囊损伤模型中，２１天后观察其对新生内膜形成的影响。结果用腺病毒载体转导大鼠反义ＡＴ１ＢＲＮＡ至大鼠球囊损伤的颈动脉，２１天后，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４７％（Ｐ＜０．００１）。结论反义ＡＴ１ＢＲＮＡ对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用     

整合素β1对大肠癌细胞与血管内皮细胞间细胞通讯的影响

目的观察和比较人野生型p53基因、Rb基因、反义IGF-I基因与大鼠反义AT1B基因对大鼠颈动脉损伤后新生内膜增殖的影响.方法通过病毒载体介导,将上述4种基因分别转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中,21d后观察并比较其对新生内膜形成的影响.结果与对照组相比,p53基因、Rb基因治疗组及反义IGF-I基因治疗组的动脉血管新生内膜/中层面积比均显著降低(P<0.01);与AdVβgal组相比,反义AdVAT1B基因组的动脉血管新生内膜/中层面积比显著降低(P<0.01).而p53基因治疗组、Rb基因治疗组、反义IGF-I基因组及反义AdVAT1B基因组之间无显著性差异(P>0.05).结论上述4种基因对血管成形术后再狭窄可能均有一定的预防作用.     

反义人IGF-Ⅰ基因转移预防血管损伤后新生内膜增殖的实验研究

目的：观察人反义IGF－Ⅰ基因转移对抑制血管平滑肌细胞增殖的效果。方法：将反义IGF-Ⅰ基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响。结果：与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了41％（P＜0．001）。结论：反义人IGF-Ⅰ基因治疗可能对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

反义人IGF—I基因转移预防血管损伤后新生内膜增殖的实验研究

目的：观察人反应ＩＧＦ－Ｉ基因转移对抑制血管平滑肌细胞增殖的效果。方法：将反义ＩＧＦ－Ｉ基因转录导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１天后观察其对新生内膜形成的影响。结果；与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４１％。结论：反义人ＩＧＦ－Ｉ基因治疗可能对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

逆转录病毒介导的人卵巢癌p53基因治疗体外及小鼠 …

目的：评价人卵巢癌的ｐ５３基因治疗效果。方法：用携带人野生型ｐ５３的逆转灵病毒转导ｐ５３蛋白表达缺如的人卵巢癌细胞系ＳＫ－ＯＶ－３，通过体外及小鼠体内实验研究转基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果：逆转录病毒介导的ｐ５３基因能够在体外及小鼠体内人卵巢癌细胞ＳＫ－ＯＶ－３中表达，并对人卵巢癌生长有抑制作用。体外抑制率为５７％￣８８％；对体内肿瘤抑制率为４０％。结论：逆转录病毒介导的外源野生型ｐ５３能够     

人肝癌细胞肿瘤抑制基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的为了解肿瘤抑制基因ｐ５３和Ｒｂ基因与肝癌对药物敏感性之间的关系，本实验用逆转录病毒介导将野生型ｐ５３或Ｒｂ基因导入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１并观察其药物敏感性的改变。方法将野生型ｐ５３ｃＤＮＡ或ＲｂｃＤＮＡ克隆在逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，转染人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１，筛选阳性克隆，同时以空载体ｐＬＸＳＮ和反义ｐ５３基因作为对照，免疫组化检测ｐ５３或Ｒｂ基因的表达。加入化疗药物４８ｈ后掺入３Ｈ－ＴｄＲ，１８ｈ后检测ＣＰＭ值。结果成功地构建了分别含野生型ｐ５３、Ｒｂ或反义ｐ５３的逆转录病毒载体，转染ＳＭＭＣ７７２１细胞系后获得了ｐ５３或Ｒｂ的表达；与亲代７７２１细胞相比，ｐ５３或Ｒｂ的表达阳性的７７２１细胞的生长速度均明显减慢，ｐ５３表达阳性的７７２１细胞对阿霉素的敏感性明显增强，同样条件下，Ｒｂ在７７２１细胞系内的表达则对阿霉素敏感性无影响。结论野生型ｐ５３基因转染能提高人肝癌７７２１细胞对阿霉素的敏感性     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转移预防再狭窄的实验研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(vEGF)基因转移对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜增生的影响。方法 将颈总动脉球囊损伤的大鼠分为3组，用局部灌注法将50μl溶液注射至颈总动脉。20min后恢复血流。分别于14d和28d处死大鼠。观察vEGF基因转移对再内皮化及内膜增厚的影响。结果 与两对照组比较，动脉损伤后14d和28d时，VEGF基因转移加速血管再内皮化，减少内皮缺失区域(P＜0．05)；且显著抑制动脉损伤后新生内膜增厚(P＜0．01)。结论 重组腺病毒介导VEGF基因转移对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

P53病毒增强型质粒-脂质体复合物对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的p53基因对血管平滑肌细胞（VSMC）的作用,探讨其用于防治冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄等心血管内外科疾病的可能性。方法：构建了野生型p53基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体,通过阳离子脂质体Dosper介导,体外转染杂VSMC。聚合酶链技术检测的基因表达。应用细胞计数及DNA合成分析技术,测定p53基因对VSMC增殖的抑制效应。结果：外源性p53基因可有效导入VSMC并表达;p53基因导入可显著抑制细胞生长,DNA合成减少。结论：野生型p53基因腺相关病毒增强型质粒载体转染VSMC可有效地抑制细胞增殖。     

Experimental Study of Adenovirus Vector Mediated-hVEGF165 Gene on Prevention of Restenosis after Angioplasty

This study evaluated the effects of adenovirus vector mediated human vascular endotheli-al growth factor-165 (hVEGF165) gene on prevention of restenosis after angioplasty. Rabbit models of bilateral carotid artery injury were established by balloon denudation. The recombinant adenovi-ruses containing hVEGF165 cDNA was directly injected into left side of the injured carotid arteries.On day 3 and week 3 after transfection the expression of VEGF was observed by RT-PCR and im-munohistochemistry. The thrombokinesis, reendothelialization (rET) and intimal hyperplasia in ca-rotid arteries were evaluated by computerized image analysis system 3 weeks after gene transfer,The changes in the VEGF gene-treated side were compared with the control side. Our results showed that 3 days and 3 weeks after hVEGF165 gene transfer the VEGF mRNA and antigen ex-pression were detected in vivo. 3 weeks after the transfer, the carotid artery rET was markedly better in the VEGF gene-treated group compared with the control. The thrombokinesis, intima are-a/media area (I/M), maximal intimal and medial thicknesses (ITmax and MTmax) demonstrated a statistically significant decrease in arteries treated with VEGF gene as compared with the control group. It is concluded that VEGF gene transfer could be achieved by intra-arterial injection of re-combinant adenoviruses. It might accelerate the restoration of endothelial integrity, inhibit throm-bokinesis and attenuate intimal hyperplasia in the injured arteries after VEGF gene transfer. This procedure could be useful in preventing restenosis after angioplasty.     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

抑制人喉癌细胞生长的p53基因反转录病毒重组体的构建

野生型ｐ５３基因在细胞增殖与分化的调控过程中起着重要作用。已有研究表明，人喉癌中存在ｐ５３基因的结构异常或表达异常。本实验根据这一特点，设计出能整合在人喉癌细胞染色体上并适宜表达的野生型ｐ５３基因反转录病毒重组体Ｐｃ５３Ｎ２Ａ。通过体外实验证明，这一重组体能够以基因替代的方式，恢复ｐ５３基因的功能，抑制人喉癌细胞的生长。     

卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建

目的 :本实验构建了人野生型 p53基因与真核表达载体 pc DNA3的重组体 ,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础。方法 :利用分子生物学基因克隆技术从质粒 p GEX-p53中用双酶切下目的片段 ,挤压法回收与 pc DNA3构成重组体。结果 :成功的构建了人野生型 p53基因真核细胞表达质粒。结论 :带有两个不同的酶切位点的目的片段定向克隆的方法使重组体的构建高效简便 ,挤压法回收目的片段经济有效。     

Experimental study of adenovirus vector mediated-h VEGF<Subscript>165</Subscript> gene on prevention of restenosis after angioplasty

Summary This study evaluated the effects of adenovirus vector mediated human vascular endothelial growth factor-165 (hVEGF₁₆₅) gene on prevention of restenosis after angioplasty. Rabbit models of bilateral carotid artery injury were established by balloon denudation. The recombinant adenoviruses containing hVEGF₁₆₅ cDNA was directly injected into left side of the injured carotid arteries. On day 3 and week 3 after transfection the expression of VEGF was observed by RT-PCR and immunohistochemistry. The thrombokinesis, reendothelialization (rET) and intimal hyperplasia in carotid arteries were evaluated by computerized image analysis system 3 weeks after gene transfer. The changes in the VEGF gene-treated side were compared with the control side. Our results showed that 3 days and 3 weeks after hVEGF₁₆₅ gene transfer the VEGF mRNA and antigen expression were detectedin vivo. 3 weeks after the transfer, the carotid artery rET was markedly better in the VEGF gene-treated group compared with the control. The thrombokinesis, intima area/media area (I/M), maximal intimal and medial thicknesses (IT_max and MT_max) demonstrated a statistically significant decrease in arteries treated with VEGF gene as compared with the control group. It is concluded that VEGF gene transfer could be achieved by intra-arterial injection of recombinant adenoviruses. It might accelerate the restoration of endothelial integrity, inhibit thrombokinesis and attenuate intimal hyperplasia in the injured arteries after VEGF gene transfer. This procedure could be useful in preventing restenosis after angioplasty. Liu Qigong, male, born in 1968, Associate Professor This project was supported by a grant from Wuhan Chenguang Program (No. 20015005048)     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

野生型p53基因调控膀胱移行细胞癌中心体异常的实验研究

 目的研究野生型p53基因抑制膀胱癌细胞中心体异常的作用。方法将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞T24,应用免疫荧光化学法检测膀胱癌细胞中心体异常变化情况。结果野生型p53基因可抑制膀胱移行细胞癌T24细胞中心体异常。结论p53基因可能是膀胱移行细胞癌中心体异常的一个重要调控因子,p53基因失活可能引起肿瘤细胞染色体不稳,从而促进肿瘤的发生和发展。     

腺病毒介导的TIMP-4基因转染抑制血管损伤后新生内膜形成

目的 :应用腺病毒介导的转基因方式转染人组织型金属蛋白酶抑制剂 4 (TIMP 4 )基因 ,以观察TIMP 4对球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 :体外培养血管平滑肌细胞 (VSMC)并转染含有TIMP 4基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdTIMP 4 ) ,采用单层培养细胞刮片法 ,观察TIMP 4对细胞迁移的影响 ;以大鼠颈总动脉球囊损伤模型为研究对象 ,损伤后即刻经血管外膜分别转入盐水、空载腺病毒载体和含有TIMP 4基因的腺病毒载体 ,观察细胞迁移和新生内膜形成情况。结果 :培养的VSMC转染AdTIMP 4后 ,细胞迁移明显受到抑制 ,与对照组相比抑制率为 6 3.9% (P <0 .0 1) ;在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中 ,转基因后 4d时生理盐水组、空载腺病毒组和转染AdTIMP 4组内弹力板内的细胞数依次为 (32 .5± 4 .8)个细胞、(33.8± 7.0 )个细胞和 (8.2± 2 .4 )个细胞 ,转染TIMP 4可以显著抑制血管损伤后细胞向内膜的迁移 ;血管损伤后 2 8d时 ,转染TIMP 4组新生内膜面积与中膜面积比值与对照组相比降低了 6 6 .5 % (P <0 .0 1) ,空载腺病毒组与生理盐水组之间差异无显著性。结论 :TIMP 4可以抑制培养的VSMC的迁移 ,局部干预可以明显抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后细胞的迁移和血管新生内膜的形成。