亚硒酸钠调控AMPK/mTOR信号通路对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制

目的探讨亚硒酸钠调控AMPK/mTOR信号通路对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法培养人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116,用1.25、2.5、5、10、20μmol/L的亚硒酸钠处理细胞48 h,CCK8试验检测不同浓度亚硒酸钠对细胞增殖的影响;10、20μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 12、24、48、72 h后,CCK8试验检测亚硒酸钠作用不同时间对细胞增殖的影响;10、20μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 48 h,流式细胞仪检测细胞凋亡率并用Western印迹检测蛋白表达。结果随着亚硒酸钠浓度的增加,人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116的抑制率增大,具有浓度依赖性,亚硒酸钠对人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116的IC50分别为(5.060±1.01)、(6.701±1.21)、(7.471±1.47)μmol/L,后期选择人结直肠癌细胞株HT-29为研究对象;10和20μmol/L的亚硒酸钠对细胞的抑制率在各个时间点都显著高于0 h抑制率(P<0.01),且随着时间的延长抑制率增加;10、20μmol/L的亚硒酸钠处理后细胞的凋亡率均显著高于0μmol/L,具有浓度依赖性(P<0.01),细胞中p-AMPK和Bax的蛋白表达显著高于0μmol/L组,p-mTOR和Bcl-2的蛋白表达显著低于0μmol/L组且具有浓度依赖性(P<0.01)。结论亚硒酸钠能抑制人结直肠癌细胞株HT-29的增殖,促进细胞的凋亡,使Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升,可能与AMPK/mTOR信号通路调控有关。     

二甲双胍通过AMPK/SIRT3通路促进脂肪酸培养的肌细胞自噬

目的探讨二甲双胍对高脂培养肌细胞自噬的作用及可能机制。方法用不同浓度棕榈酸(0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L)及二甲双胍(0.5、1、2、5、10 mmol/L)分别干预L6肌细胞24 h,CCK 8法检测肌细胞的存活率。棕榈酸和二甲双胍干预肌细胞24 h后,Western印迹检测微管相关轻链蛋白3(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白Beclin 1、泛素结合蛋白p62、沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)蛋白表达及腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平,RT-PCR技术检测上述基因的mRNA表达水平。结果棕榈酸剂量依赖性地降低肌细胞活力,2 mmol/L二甲双胍显示最佳的对抗作用。0.4 mmol/L棕榈酸和2 mmol/L二甲双胍干预肌细胞24 h后,棕榈酸显著减少LC3Ⅱ/LC3I、Beclin 1、SIRT3的蛋白及mRNA表达水平,降低AMPK磷酸化水平,显著增加p62的蛋白及mRNA表达水平(均P<0.05),棕榈酸的这些作用可被二甲双胍所对抗(均P<0.05)。结论二甲双胍可能通过刺激AMPK的磷酸化增加SIRT3的表达而增强脂肪酸培养的肌细胞自噬。     

亚硒酸钠对结直肠癌HT-29细胞AMPK/mTOR通路活化及凋亡的影响

目的研究亚硒酸钠对结直肠癌HT-29细胞中AMPK及其下游靶蛋白mTOR的作用,以及其对HT-29细胞凋亡的影响。方法分别用亚硒酸钠、AMPKα亚基特异激活剂AICAR和AMPK特异siRNAs处理HT-29细胞。采用Western印迹检测HT-29细胞中AMPK和mTOR的磷酸化水平、流式细胞术检测HT-29细胞凋亡率。结果与对照相比,亚硒酸钠可上调HT-29细胞中AMPK的磷酸化水平,下调mTOR的磷酸化水平,并促进HT-29细胞凋亡(P<0.01);亚硒酸钠单独处理HT-29细胞与AMPKα亚基特异激活剂单独处理HT-29细胞作用类似;敲低HT-29细胞中AMPK蛋白表达后,mTOR磷酸化水平升高,同时,亚硒酸钠对HT-29细胞的促凋亡作用降低(P<0.01)。结论亚硒酸钠通过激活AMPK通路进而抑制mTOR通路,从而促进HT-29细胞凋亡。     

汉防己甲素诱导人胃癌BGC-823细胞自噬和凋亡的作用及机制

目的 观察汉防己甲素诱导人胃癌BGC-823细胞自噬与凋亡的作用,并探讨两者发生以及相互关联的分子机制.方法 用不同浓度的汉防己甲素作用于人胃癌BGC-823细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western-blot法检测各组细胞Bcl-2和自噬标记蛋白LC3、Beclin1的表达,MDC自噬特异性染料荧光染色观察自噬泡的聚集.结果 TET对BGC-823细胞的生长有显著抑制作用,呈明显的时间、剂量依赖性;TET可诱导BGC-823细胞发生凋亡;TET可诱导BGC-823细胞发生自噬,自噬作用在8、10 μg/mL TET给药组达到高峰,后随着浓度的增加逐渐下降;在TET给药前用3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬后,低浓度(8 μg/mL) TET诱导的凋亡率明显升高;高浓度(20 μg/mL) TET诱导的凋亡率差别无统计学意义.结论 TET能明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长,并诱导其发生凋亡和自噬.TET诱导的自噬作为保护性机制,可发挥拮抗凋亡的作用.     

雷公藤甲素抑制细胞增殖和诱导凋亡对大鼠肺动脉高压的影响

目的:观察雷公藤甲素对大鼠左肺切除加野百合碱诱导肺血管重构模型的影响并探讨是否与影响细胞增殖和凋亡有关。方法:60只SD大鼠随机分为6组(各组10只):正常组、模型组、连续治疗组、延迟治疗组及(两治疗组)安慰剂对照组。术后5周通过导管插入术测得血液动力学指标,并通过弹力纤维和免疫组织化学染色α-actin、增殖细胞核抗原及caspase-3在光学显微镜下观察肺小动脉的病理学变化。结果:①平均肺动脉压和肌化程度结果显示,模型组与正常组比较,均有极显著性差异(P＜0.01);连续治疗组与连续对照组、延迟治疗组与延迟对照组比较,均有显著性差异(P＜0.05);连续治疗组与延迟治疗组比较,有显著性差异(P＜0.05)。②血管壁细胞增殖度和新生内膜增殖度变化:模型组与正常组比较表达增高,有极显著性差异(P＜0.01);连续治疗组与连续对照组、延迟治疗组与延迟对照组比较表达下降,有显著性差异(P＜0.05)。Caspase-3染色阳性率结果显示:模型组较正常组表达增高(P＜0.05);连续治疗组与连续对照组、延迟治疗组与延迟对照组、延迟治疗组与连续治疗组比较表达增高,有显著性差异(P＜0.05～0.01)。结论:雷公藤甲素能延缓大鼠左肺切除加野百合碱注射诱导的肺血管重构,连续和延迟两种治疗方案均有显著的疗效(连续治疗可能更好)。其机制可能与雷公藤甲素的抗增殖效应及增加细胞凋亡作用有关。     

草果知母汤介导mTOR信号通路对脑卒中大鼠神经元自噬与凋亡的影响

目的 探究草果知母汤对脑卒中大鼠神经元自噬与凋亡的影响.方法 SD大鼠适应1 w后进行脑缺血再灌注造模,根据神经功能评分进行随机分组,分为假手术组、脑缺血组、草果知母汤组、草果知母汤加雷帕霉素组,每组10只.给药7 d后进行神经功能评分和水迷宫测试,取脑用于2,3,5-三苯基氯化四氯唑(TTC)染色,免疫组化、电镜染色...     

雷公藤甲素诱导胶原诱导的关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的初步观察

目的 以胶原诱导的关节炎(CIA)为动物模型,探讨雷公藤甲素(triptolide)能否诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡。方法 选用雄性Wistar大鼠造模,将造模成功的大鼠随机分为模型组和雷公藤组。雷公藤甲素按4滋g/100g体重,肌肉注射给药,每3d1次。凋亡检测:给药31d后处死,取膝关节滑膜。作苏木素-伊红染色(HE)、电镜、缺口末端标记法(TUNEL)标记及流式细胞仪检测。结果 电镜下可见早期阶段的滑膜凋亡细胞。流式细胞仪检测结果显示正常组、模型组、雷公藤组的凋亡细胞分别为(0.87±0.24)%、(1.83±0.82)%和(3.98±1.16)%。正常组、模型组、雷公藤组的S期细胞分别为(3.4±0.7)%、(8.0±1.4)%和(3.3±1.2)%。雷公藤组与模型组比较差异均具有显著性(P<0.01)。TUNEL标记结果显示正常组、模型组、雷公藤组的凋亡细胞分别为(1.0±0.4)%、(2.2±1.0)%和(4.5±0.9)%。雷公藤组与模型组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论 本次实验首次阐明雷公藤甲素可诱导CIA大鼠滑膜细胞的凋亡。     

脊髓损伤治疗干预对细胞自噬及凋亡影响的相关研究进展

脊髓损伤是脊柱外科常见的严重疾患之一,其治疗一直是世界性难题。脊髓损伤后继发性损伤所引起的后果更严重,细胞自噬与凋亡在其调控过程中起重要作用。该文对近年来脊髓损伤治疗干预对细胞自噬及凋亡影响的相关研究进展作一综述。     

缺氧活化AMPK/mTOR通路对脑血管内皮细胞增殖及代谢的影响

目的研究缺氧活化脑血管内皮细胞中AMPK及下游mTOR通路对脑血管内皮细胞增殖和代谢的调控作用。方法分别用正常氧对照组、低氧(15%、10%、5%、1%)处理脑血管内皮细胞。用CCK8方法检测脑血管内皮细胞增殖情况;流式细胞术检测脑血管内皮细胞活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率;Western印迹检测细胞AMPK、mTOR的磷酸化水平及敲低AMPK和抑制mTOR后AMPK、mTOR的磷酸化水平。结果缺氧可抑制脑血管内皮细胞的增殖和代谢,并促进脑血管内皮细胞的凋亡;缺氧可上调脑血管内皮细胞中AMPK的磷酸化水平,下调mTOR的磷酸化水平;敲低AMPK后,mTOR的磷酸化水平升高,而抑制mTOR通路对AMPK的磷酸化水平无显著影响。结论缺氧可通过激活AMPK通路,进而抑制mTOR通路的活化,从而抑制脑血管内皮细胞的增殖和代谢,并促进脑血管内皮细胞凋亡。mTOR蛋白为AMPK通路下游的靶蛋白。     

红景天苷对高海拔缺氧条件下大鼠心肌自噬相关通路AMPK的影响

目的 探讨红景天苷保护高海拔缺氧损伤大鼠心脏的可能分子机制。方法 将40只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组（1 500 m）、缺氧生理盐水组（6 500 m+NS）、缺氧Compound C组（6 500 m+comC）、缺氧红景天苷组（6 500 m+Sal）、缺氧红景天苷+Compound C组（6 500 m+comC+Sal）。造模完成后进行血气分析、HE染色、荧光TUNEL检测及Western blot检测。结果 (1)缺氧后大鼠心肌结构发生变化,心肌凋亡加重（P<0.05）,红景天苷治疗可改善心肌细胞病理性损伤,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）;(2)缺氧后磷酸化AMPK水平上升,磷酸化mTOR水平降低（P<0.05）。而Compound C组AMPK及mTOR表现呈相反趋势,红景天苷治疗后AMPK及mTOR的表达水平介于Compound C组与红景天苷组之间,但是自噬蛋白Beclin-1的表达较Compound C组增加（P<0.05）。结论 红景天苷可以正向调节AMPK信号通路激活自噬,对缺氧损伤的大鼠心脏起保护作用。     

mTOR信号介导的自噬在褪黑素减轻心脏缺血/再灌注损伤中的作用

目的 探讨mTOR信号介导的自噬在褪黑素（melatonin,Mel）减轻心脏缺血/再灌注损伤中的作用。方法 将60只8周龄C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组、单纯褪黑素10 mg/(kg·d)处理(Mel)组、缺血/再灌注（ischemia reperfusion,I/R）组和褪黑素10 mg/(kg·d)干预I/R（Mel+I/R）组。采用冠状动脉左前降支结扎术制备心肌I/R模型,HE染色观察心肌组织形态学变化,试剂盒检测各组血清中LDH的含量,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况,蛋白印迹法（Western blot）检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）I和II、Beclin1和mTOR磷酸化的表达,免疫荧光染色法检测LC3B的表达。结果 与Sham组相比,Mel组各项指标均无明显变化;I/R组心肌纤维断裂明显排列紊乱,血清中LDH含量明显增加（P<0.01）,TUNEL阳性细胞明显增多（P<0.01）,LC3II和Beclin1表达显著升高（P<0.01）,而磷酸化mTOR的表达降低（P<0.01）,免疫荧光结果显示LC3B表达增加（P<0.01）; Mel+I/R组可明显减轻心肌纤维的断裂,降低血清中LDH含量（P<0.01）,减少TUNEL阳性细胞数（P<0.01）,减少LC3II和Beclin1的表达（P<0.01）,降低免疫荧光染色中LC3B的表达（P<0.01）。结论 褪黑素通过调节mTOR信号介导的自噬减轻心脏I/R损伤。     

重复异丙酚麻醉通过mTOR通路诱导大鼠海马细胞凋亡及自噬

目的 探究重复异丙酚麻醉对大鼠海马神经细胞凋亡和自噬的影响及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的影响。方法 将72只SPF级7 d龄大鼠随机分为4组,每组18只：对照组(A组)腹腔注射脂肪乳剂7.5 ml/kg, 1次/d,连续7 d;单次注射异丙酚组(B组)腹腔注射脂肪乳剂7.5 ml/kg, 1次/d,连续6 d,第7天注射异丙酚75 mg/kg;重复注射异丙酚组(C组)腹腔注射异丙酚75 mg/kg, 1次/d,连续7 d;异丙酚+雷帕霉素组(D组,雷帕霉素为mTOR抑制剂)腹腔注射雷帕霉素2.0 mg/kg和异丙酚75 mg/kg, 1次/d,连续7 d。第7天麻醉后每组随机选取12只大鼠于苏醒后抽取动脉血进行血气分析;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠海马组织病理学变化;原位末端标记技术(Tunel)检测海马组织神经细胞凋亡;Western印迹法检测海马组织mTOR、自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白轻链(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的表达。结果...     

内质网应激调节细胞自噬及其干预动脉粥样硬化的信号通路研究进展

综述内质网应激与细胞自噬之间的关系,以及通过其对细胞自噬的调节机制来探讨其在动脉粥样硬化进程中的作用机制,以期为动脉粥样硬化的预防、诊断和治疗提供新思路。     

Pyr1-apelin-13对大鼠心肌成纤维细胞AMPK/mTOR自噬信号和氧化应激损伤的影响

目的探讨Pyr¹-apelin-13对于大鼠心肌成纤维细胞自噬和氧化应激的影响及其作用机制。方法提取新生大鼠心肌成纤维细胞(CFs),给与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),Pyr¹-apelin-13,雷帕霉素干预,使用Western blot法和免疫荧光技术检测自噬信号分子,使用DHE法检测氧自由基生成,观察Pyr¹-apelin-13在AMPK/mTOR通路中的作用。结果在体外培养的CFs细胞中,AngⅡ刺激通过上调P62和磷酸化mTOR抑制自噬水平,伴有LC3II、Beclin-1和磷酸化AMPK降低及氧化应激水平增高;而Pyr¹-apelin-13或雷帕霉素干预后逆转AngⅡ介导的自噬下调,表现为LC3II/I、Beclin-1和磷酸化AMPK水平上升,P62表达和磷酸化mTOR下降,细胞氧化应激损伤减轻。结论Pyr¹-apelin-13可通过调控大鼠心肌成纤维细胞AMPK/mTOR自噬信号发挥其抗氧化和促自噬的细胞保护功效。     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的 研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制.方法 传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型.实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组.CCK8筛选α-LA的有效作用浓...     

二甲双胍对肝癌细胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的观察二甲双胍对肝癌细胞凋亡的影响,并探讨该作用与PI3K/AKT/m TOR信号通路的关系。方法体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,分别加入5、10、20、40、80 mmol/L二甲双胍,另设对照组,加入同体积的培养基培养24、48 h,MTT法检测各组细胞增殖情况,计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50),筛选出适合的药物浓度(5、10、20 mmol/L)和作用时间(48 h)进行后续实验。将SMMC-7721细胞分为二甲双胍组和对照组,二甲双胍组分别加入5、10、20 mmol/L二甲双胍处理48 h,对照组加入同体积的培养基。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白p-AKT、p-mTOR表达。结果 5、10、20、40、80 mmol/L二甲双胍组处理24 h和48 h后,细胞存活率均低于对照组(P <0.05或P <0.01);二甲双胍能够抑制细胞增殖,24 h和48 h的IC50分别为36.05、25.76 mmol/L,后续选择5、10、2...     

Beclin 1与mTOR对心肌缺血/再灌注损伤中自噬的交互调控机制

自噬是一个进化上高度保守的受损或功能障碍的蛋白质聚集体或细胞器降解的过程。在心肌缺血/再灌注(I/R)过程中,可以通过多种因素诱导细胞的自噬活动,而且越来越多的证据表明,自噬在心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)中可能起“双刃剑”的作用,适度自噬可促进细胞存活;而不适当的激活自噬可能会加速细胞死亡。Beclin 1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的自噬与mTOR的互反馈信号通路,是两条经典的自噬激活信号途径,也可能是调控自噬“双刃剑”转向促进细胞存活的重要调控机制。本文将重点综述上述两条信号通路对自噬的交互式调控作用。速发挥作用。因此,Z盘部位实质上成为心肌细胞中的信号转导中心。     

细胞自噬对衰老的调节

细胞内损伤物质的积累是所有衰老细胞的普遍特征,能导致生命有机体生存能力降低.细胞自噬能够降解受损蛋白质和衰老或损伤细胞器等细胞结构,是细胞内主要的异化途径,参与衰老以及与衰老相关的各种病理过程.近年来研究发现,衰老进程中,细胞自噬活动下调,而对各种长寿突变体的研究表明自噬活动是寿命延长所必需的,多种自噬相关基因或蛋白直接受长寿途径的调节[1~5],这些发现都支持细胞自噬是各种真核生物衰老非常重要的调节机制.     

雷公藤甲素干预足细胞病变的体外观察

目的：雷公藤甲素对Heymann肾炎和嘌呤霉素肾病大鼠的疗效及其对足细胞病变的影响提示，雷公藤甲素有可能直接作用于足细胞，从而改善其病变状况。本研究借助小鼠足细胞系，体外观察了雷公藤甲素对足细胞损伤的保护和修复作用，并对其作用机制进行了研究。方法：体外采用氨基核苷嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）致足细胞损伤模型。观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中，雷公藤甲素与足细胞预孵育30min后，再加入含PAN的培养基，继续作用24h；观察雷公藤甲素对足细胞损伤的修复作用研究中，PAN作用足细胞24h，造成足细胞明显损伤后，再加入含或不含雷公藤甲素的培养基，继续培养3天。免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和Synaptopodin的变化，并进一步观察了细胞内调节骨架装配的Rho／ROCK信号通路的活性，即采用Western Blot检测ROCK-Ⅰ底物——肌球蛋白磷酸酶结合亚单位（MBS）磷酸化水平，以及Rho／ROCK信号通路选择性阻断剂Y-27632对雷公藤甲素作用的影响。同时采用免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞裂孔膜相关分子Nephrin和Podocin在足细胞的分布及表达量的变化。结果：正常分化足细胞F—actin呈丝状结构，密度大，丝强劲有力，沿细胞极性分布；Synaptopodin呈颗粒状沿细胞骨架分布。裂孔膜蛋白Nephrin沿足细胞膜和细胞骨架分布，Podocin呈线状均匀分布于胞浆内，PAN作用24h后，细胞足突回缩，F—actin几乎完全解聚，Synaptopodin表达消失。Nephrin和Podocin表达减弱，正常丝状结构消失。而经过雷公藤甲素的预处理，PAN诱导的足细胞损伤明显减弱，足细胞未表现出上述骨架结构的改变，Synaptopodin表达没有明显减弱。同时我们的结果显示，在PAN造成足细胞明显损伤后再加入雷公藤甲素，足细胞损伤能够得到一定修复，细胞内重新出现极性分布的微丝，同时，Synaptopodin的表达也得以修复。Rho／ROCK信号通路研究显示，100μg／ml PAN明显降低Rho／ROCK通路活性。雷公藤甲素能有效遏制MBS磷酸化水平的降低，维持足细胞Rho／ROCK通路的活性状态。Rho／ROCK信号通路选择性抑制剂Y-27632可阻断雷公藤对足细胞骨架结构的保护作用。此外，对裂孔膜蛋白Nephrin，Podocin的研究表明，不论是在预防组和治疗组，PAN对Nephrin和Podocin的损伤可在一定程度上被雷公藤甲素预防和修复。结论：雷公藤甲素可稳定足细胞的细胞骨架，拮抗PAN对足细胞的损伤。在足细胞损伤已经发生后，雷公藤甲素可逆转足细胞的损伤，修复足细胞骨架结构和相关分子的表达。雷公藤甲素的上述作用与细胞内Rho／ROCK信号通路密切相关。雷公藤甲素对足细胞的影响可能是其降低肾小球肾炎患者尿蛋白的重要机制之一。