关节软骨钙化层界线结构特异性染色方法建立

目的 建立关节软骨钙化层界线结构特异性染色方法.方法 从组织库获取成人股骨髁标本10例,修剪、固定后常规方法制备石蜡切片,联合应用HE、天狼猩红、番红O/固绿和冯库萨等染色方法,对关节软骨钙化层界线结构进行观察.结果 HE染色仅能依据各层组织的结构、形态区分3层结构,两界线显示不清;天狼猩红染色和番红O/固绿染色可以清晰区分粘合线结构,但潮线界面显示不清;冯库萨染色可以清晰显示钙化软骨层两界线结构,但软骨下骨的形态结构显示不清.结论 通过对不同方法染色结果进行比较,番红O/固绿染色和冯库萨染色联合应用可以清晰显示钙化层界线结构.     

应用高浓度Ⅱ型胶原蛋白构建组织工程软骨支架

目的构建有利于种子细胞黏附、增殖和分化的软骨组织工程海绵支架。方法依据天然软骨主要成分,提取透明软骨Ⅱ型胶原蛋白,将提取的胶原蛋白通过高速离心进行浓缩,真空冷冻干燥制得海绵支架材料,应用化学交联剂EDC/NHS进行化学交联,对支架采用组织化学染色、体外降解实验、扫描电镜和接种细胞静态培养的方法进行相关检测。结果支架具有良好的孔隙结构,孔径40～130μm,孔隙率在90%以上,细胞在支架上增殖、分化良好。结论构建的高浓度Ⅱ型胶原蛋白海绵支架具有良好的生物相容性,有较好的应用前景。     

猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

目的：从猪关节软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定。方法：选择猪关节软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析、DE22纤维树脂处理等步骤,提取纯化Ⅱ型胶原蛋白。采用SDS-PAGE、吸收光谱分析、氨基酸成分分析等方法对Ⅱ型胶原蛋白进行鉴定。结果：4mol／L盐酸胍能有效去除蛋白多糖;分步加入胃蛋白酶的限制性酶解结果满意;氯化钠盐析浓度为2．4mol／L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的Ⅱ型胶原蛋白与Sigma公司的产品一致。Ⅱ型胶原最大吸收峰为230nm,氨基酸成分分析显示甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高。结论：实验结果提示从猪关节软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,符合Ⅱ型胶原的特征。提取材料广泛、实验条件简便。结果可靠。     

含天然钙化层的骨软骨材料修复猪膝关节软骨缺损

目的 构建含和不含天然钙化层的修复材料,比较两者在猪膝关节软骨缺损修复中的效果,探讨钙化层在骨软骨组织工程中的重要性.方法 选取普通实验猪膝关节骨,软骨通过Ⅱ型胶原水凝胶冻干技术和天然骨软骨脱细胞技术构建含有钙化层和无钙化层的骨软骨支架,以贵州小香猪自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为种子细胞,构建移植修复材料.30只小香猪按随机数字表法分为空白对照组、无钙化层组、含钙化层组(n=10).双膝关节滑车骨软骨缺损造模,直径8 mm,深至软骨下骨,植入对应的修复材料.分别于12、24周取材,采用大体、体式显微镜观察,以及MRI检测缺损填充情况,HE染色、番红0-固绿染色,以及Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色观察新生修复物的组织类别,O'Driscoll组织学评分评价修复效果.结果 各组术后24周修复效果较12周均有改善.大体和体式显微镜观察,24周空白对照组新生组织部分填充缺损,为纤维组织,软骨表面凹陷深大;无钙化层组移植物填充缺损,软骨表面凹陷;含钙化层组缺损填充较好,表面微凹陷,三层结构可见,与宿主组织整合佳.组织学观察提示空白对照组为纤维组织填充修复;无钙化层组为骨和纤维软骨修复,三层结构不明显;含钙化层组钙化层结构清晰,移植物与宿主整合,软骨表面微凹陷,透明软骨修复.O'Driscoll组织学评分,12、24周空白对照组分别为(3.80±0.83)、(5.50 ±0.52)分,无钙化层组分别为(10.30±0.63)、(14.20±0.68)分,含钙化层组分别为(15.10±0.58)、(18.80±0.87)分,各组评分差异均有统计学意义(P＜0.01),含钙化层组评分最高.结论 含有天然钙化层的骨软骨支架,在猪骨软骨缺损修复中取得了很好的修复效果,明显优于无钙化层支架和空白对照,是今后软骨组织工程支架设计的重要参考.     

折叠式骨膜-骨复合组织游离移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的 观察游离折叠式骨-骨膜复合组织移植修复全层软骨缺损的效果及再生软骨的特性. 方法 新西兰大白兔实验动物48只,建立全层软骨缺损模型,设计折叠骨-骨膜复合组织游离移植为实验组,单纯骨膜游离移植为对照组,未作任何修复处理为空白组,每组16只.术后2、4、8、12周进行大体标本观察、HE染色、甲苯胺蓝染色组织学观察、免疫组化观察、扫描电镜观测和关节软骨组织学半定量分析. 结果 术后实验组修复组织为透明软骨,且与周围正常软骨融合良好,甲苯胺蓝染色深;细胞质和细胞外基质中Ⅱ型胶原的表达呈强阳性;电镜显示包埋在软骨细胞囊中的软骨细胞排列整齐,胶原纤维呈多孔结构,孔隙均匀;软骨组织学半定量评分实验组各时间点明显优于对照组和空白组(P<0.05). 结论 折叠式骨-骨膜复合组织游离移植是对以往单纯游离骨膜移植的改进,为修复全层软骨缺损的提供更有效的方法.     

冷冻同种异体骨软骨移植修复大面积关节软骨缺损的可行性研究

目的观察冷冻同种异体骨软骨移植修复大面积关节软骨缺损的可行性，为临床应用提供实验依据。方法共选取36只新西兰兔，随机数字表法分成供体组、实验组和对照组，每组12只。供体组制备冷冻同种异体胫骨内侧髁骨软骨移植物后处死；实验组将经程序深低温冷冻保存的同种异体胫骨内侧髁移植；对照组将取下的胫骨内侧髁原位植入。所有实验动物在术后12周处死。应用苏木精-伊红染色观察关节软骨组织的病理学变化，软骨缺损的组织学评分以半定量的改良Wakitani score法评估，内容包括：细胞种类、髓质染色、表面完整性、软骨的厚度、移植软骨在受体周围组织的完整性5个方面，采用0、1、2、3、4评分，最高总分14分。观察两组动物的大体标本、X线片、组织学检查、Waki-tani score评分及免疫组织化学检查结果。结果①移植软骨的大体观察：两组动物关节活动度正常，关节腔无粘连、无积液，实验组移植软骨颜色及高度与周围关节软骨大致相同，关节面较平整，基底部界限模糊。对照组关节软骨面平整、无塌陷，厚度不变。②两组动物关节X线片均见骨折线已模糊，对位、对线良好。③组织学检查：两组动物关节软骨均已被透明软骨覆盖，细胞排列有序，软骨基质大量分泌，未见淋巴细胞和浆细胞浸润。④两组动物关节软骨Wakitani score评分结果无显著性差异，总评分相近（P〉0.05）。⑤两组修复软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色强阳性。结论冻存同种异体骨软骨移植后可完全修复大面积关节软骨缺损，并与自体骨软骨块修复兔的关节软骨缺损在组织学上相近，未见免疫排斥反应。     

Ⅰ型胶原在丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料修复兔股骨缺损中的表达

目的 通过检测Ⅰ型胶原蛋白的表达,评价丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料的体内成骨性能. 方法 将丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料(实验组)和羟基磷灰石(对照组)分别植入新西兰大白兔股骨髓腔内,分别在4周、8周、12周时取出标本,采用免疫组织化学染色方法进行Ⅰ型胶原染色,应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行Ⅰ型胶原蛋白积分光密度测量,评价其成骨特性. 结果 显微镜观察及Ⅰ型胶原蛋白积分光密度测量结果显示,在同一时间点,丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料成骨性能均高于对照组(P＜0.05). 结论 丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料可以增强成骨细胞基质分泌,有效促进新骨形成,具有良好的体内成骨性能.     

转化生长因子β1促进关节软骨缺损修复的量效关系比较

目的比较不同剂量的转化生长因子β1(TGF-β1)关节内注射对关节软骨全层缺损修复在细胞形态学、细胞基质化学方面的不同影响。方法将兔膝关节造成关节软骨全层缺损,分别注入1ng、10ng1、00ng TGF-β1,2、4、8周后行组织学、组织化学、免疫组化研究,分析比较修复组织中透明软骨细胞数和胶原含量的差异。结果各剂量组均有一定的修复效果,100ng组最佳,但出现了骨软骨赘和正常关节软骨的退变。结论实验各剂量TGF-β1都可以促进关节软骨全层缺损的修复,100ng较理想,最佳剂量和方法仍需探讨。     

自由基在大骨节病病理过程中的作用——Ⅱ.在活性氧自由基及大骨节病病区黄腐酸损伤的Ⅱ型胶原蛋白中羟基磷灰石结晶生长的动力学研究

研究了在·OH与病区饮水中黄腐酸(FA)造成损伤的猪软骨Ⅱ型胶原蛋白中羟基磷灰石(HAP)成长的动力学,并与未损伤的胶原蛋白比较。结果表明,正常情况下的Ⅱ型胶原蛋白抑制HAP成长,而氧化性降解损伤的Ⅱ型胶原蛋白促进HAP成长,但反应均为二级。X射线分析及扫描电镜观察发现,损伤的Ⅱ型胶原蛋白使HAP成长初期结晶性差,最终所得结晶聚合度大。提示软骨组织中的Ⅱ型胶原蛋白因氧化降解后表现了促矿化的性质,这与大骨节病的发生发展可能有重要联系。     

骨缺损修复材料煅烧牛骨粉的理化特性

目的:获得具有良好生物相容性和骨引导作用的骨修复材料——煅烧骨粉并探讨其理化特性,为骨缺损修复寻找理想支架。方法：以牛骨为材料,通过煅烧彻底去除其有机成分（相应的抗原性和可能存在的病原微生物）,保留其与人体骨基本一致的无机成分和天然的三维交通结构,经前期处理后煅烧至850℃的牛骨制成颗粒状,通过X-射线衍射、电子探针、电感耦合等离子体原子光谱法、电镜及光电子能谱检测煅烧骨理化特征及化学成分。结果:X-射线（粉末）衍射显示煅烧后牛骨粉的成分为羟基磷灰石(HAP),通过电感耦合等离子体原子光谱法检测煅烧骨未检出氮元素,表明无蛋白、无有机成分;扫描电镜观察显示清晰的天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统;孔隙大小为200～850 μm,平均孔隙率为（84.9±0.6）%。 结论:高温煅烧后的牛骨粉主要成分是羟基磷灰石,与骨组织有亲合力,具有三维交通孔隙结构,基本符合骨缺损修复理想支架的要求。     

聚乳酸涂层的多孔羟基磷灰石负载软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损

目的　研究复合材料负载软骨细胞修复兔关节软骨缺损。方法　把软骨细胞种植到聚乳酸 (PLA)涂层的多孔羟基磷灰石 (HA)表面 ,培养 2周后 ,移植软骨细胞 载体的复合体修复兔膝关节股骨髁的软骨缺损 (直径约 5mm ,深约 2 .5mm ,达钙化层 )。然后对缺损的修复情况在移植后进行大体、光镜评估和电镜观察。另外对兔膝关节正常的软骨和移植后 12周缺损处的修复软骨进行胶原量的测定。结果　移植的软骨细胞能在复合材料上良好地生长 ,形成透明软骨 ,软骨缺损被修复。无细胞移植的对照组仅纤维修复。另外 ,多孔HA在修复过程中充当了软骨下骨的临时替代。胶原量的测定显示移植 12周后的修复软骨胶原量约 44 .6 9% ,自身正常的软骨胶原量约为 5 4.74% ,两者差异有统计学意义。结论　PLA涂层的多孔HA负载软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损。软骨细胞不成熟导致胶原量的差异有统计学意义。     

补肾活血方对骨关节炎关节软骨保护作用的临床研究

为探讨补肾活血方对骨关节炎关节软骨的保护作用,选取膝关节炎患者60例,随机分为补肾活血方组和西乐葆组各30例,单盲给药,用平均Womac关节炎指数评分和平均OA严重程度指数评定2组用药前后临床症状的改善情况,采用夹心酶联免疫吸附法测定血清蛋白聚糖与Ⅱ型胶原表达.结果:6个月后补肾活血方组的改善明显优于西乐葆组(P＜0.01);蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达变化治疗前后比较,有显著性差异(P＜0.01).说明补肾活血方对骨关节炎的关节软骨有保护和促进修复的作用.     

关节软骨浅表层的透射电镜观察

目的　观察正常关节软骨浅表层的超微结构。方法　应用透射电子显微镜对正常成年兔膝关节软骨进行超微结构观察。结果　透射电镜下正常成年关节软骨浅表层由三层结构组成 :最上层为一黏液层 ,中层为一层细胶原纤维网 ,下层为含梭形细胞的胶原纤维层。结论　浅表层的三层结构是关节软骨的重要组成部分     

大鼠DDH关节软骨早期退变和X型胶原、基质金属蛋白酶13表达相关性的研究

目的：检测 X 型胶原、基质金属蛋白酶13（MMP-13）在发育性髋关节发育不良（DDH）大鼠模型不同时期关节软骨中表达的改变情况,探讨 X 型胶原、MMP-13与软骨早期退变的相关性。方法选取新生 Wistar 大鼠80只,随机均等分成 DDH 组和对照组。DDH 组新生大鼠后肢襁褓位固定10 d 后解除固定继续饲养,分别于鼠的2、4、6、8周龄处死,离断髋关节,观察髋关节软骨的大体形态。用免疫组化和 qRT-PCR 法检测 X 型胶原、MMP-13的表达。结果 DDH模型鼠的尸体解剖样本显示关节囊增厚,髋臼表面呈不规则、不平整,股骨头扁平且发育较小,头臼包容差,尤其4周后更明显;与对照组相比,在髋关节软骨浅表区域有较高的X 型胶原和 MMP-13表达（P <0.05）,并且这种增长是随着年龄增长而增长的,X 型胶原和 MMP-13的 mRNA 表达显示出相似的结果（P <0.05）。结论 DDH 模型鼠在较早阶段出现软骨退化,随着年龄逐渐加重;X 型胶原和 MMP-13表达与 DDH 软骨早期退变有密切的关系。     

去势大鼠髁突软骨雌激素受体及Ⅱ型胶原表达的研究

目的：观察去势大鼠髁突软骨组织学变化,并检测雌激素受体（ER）和Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达,分析去势后髁突软骨生长代谢的变化,探讨雌激素缺乏与颞下颌关节骨关节病（OA）的关系。方法 HE染色观察大鼠去势后不同时期髁突软骨组织学变化,免疫组织化学法检测去势大鼠髁突软骨ER及ColⅡ表达,并运用图像分析仪测量并计算其平均阳性染色面积百分比。结果雌激素缺乏导致髁突软骨退行性改变。去势后大鼠ER和ColⅡ的表达受到抑制,且随作用时间的延长,其作用增强。结论雌激素缺乏或低下导致大鼠髁突软骨病损。低浓度雌激素降低或抑制ER表达,髁突软骨胶原表达与雌激素相关。     

大鼠增龄过程中椎间盘退变指标的研究

目的 研究大鼠增龄过程中椎间盘退变的指标.方法 同批SD大鼠21只,分别喂养6月(9只)和22月(12只)建立青年大鼠组和老龄大鼠组模型,计算椎间盘退变Miyamoto分级值,体视法分析椎体软骨终板血管芽数量、面积、钙化层和非钙化层厚度,单克隆抗体免疫组化染色测定软骨Ⅱ型和X型胶原的表达.结果 老龄组大鼠椎体软骨终板血管芽数量、血管芽相对面积、非钙化层/钙化层比值、钙化层和髓核Ⅱ型胶原含量均低于青年组(P＜0.05);老龄组非钙化层X型胶原含量高于青年组(P=-0.003);而Miyamoto分级老年组和青年组无统计学差异(P=1.130).结论 终板血管芽相对面积、非钙化层/钙化层比值、Ⅱ型胶原和X型胶原表型表达是评估增龄性椎间盘退变的灵敏指标,而Miyamoto分级不是评估增龄性椎间盘变化的灵敏指标.     

Herbst矫治器前移下颌对成年大鼠髁状突中Ⅲ型胶原表达的影响

目的探讨Herbst功能矫治器引导成年大鼠下颌前伸,对其髁状突组织中Ⅲ型胶原表达水平的影响,进一步明确Herbst矫治器对成年大鼠髁状突组织改建的作用.方法 60只14周龄雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组;实验组大鼠全天佩戴自制Herbst矫治器引导下颌前伸,对照组不佩戴矫治器.于时间点3、7、14、21和30 d分别处死各组大鼠,取右侧髁状突组织,使用免疫组化方法检测髁状突中Ⅲ型胶原蛋白的表达情况.结果对照组髁突软骨Ⅲ型胶原表达较低;3 d实验组髁突后部Ⅲ型胶原表达较相应对照组强（P〈0.05）,其余各实验组均明显强于相应对照组（P〈0.01）.实验组Ⅲ型胶原在30 d时表达最强.结论 Herbst矫治器能够诱导成年大鼠髁状突发生适应性改建.     

Repair of articular cartilage defects in minipigs by microfracture surgery and BMSCs transplantation

Objective：To investigate the feasibility of minimal invasive repair of cartilage defect by arthroscope-aided microfracture surgery and autologous transplantation of mesenchymal stem cells. Methods： Bone marrow of minipigs was taken out and the bone marrow derived mesenchymal stem cells （BMSCs） were isolated and cultured to passage 3. Then 6 minipigs were randomly divided into 2 groups with 6 knees in each group. After the articular cartilage defect was induced in each knee, the left defect received microfracture surgery and was injected with 2.5 ml BMSCs cells at a concentration of 3×107 cells/ml into the articular cavity; while right knee got single microfracture or served as blank control group. The animals were killed at 8 or 16 weeks, and the repair tissue was histologically and immunohistochemically examined for the presence of type Ⅱ collagen and glycosaminoglycans （GAGs） at 8 and 16 weeks. Results： Eight weeks after the surgery, the overlying articular surface of the cartilage defect showed normal color and integrated to adjacent cartilage. And 16 weeks after surgery, hyaline cartilage was observed at the repairing tissues and immunostaining indicated the diffuse presence of this type Ⅱ collagen and GAGs throughout the repair cartilage in the treated defects. Single microfracture group had the repairing of fibrocartilage, while during the treatment, the defects of blank group were covered with fewer fiber tissues, and no blood capillary growth or any immunological rejection was observed. Conclusion： Microfracture technique and BMSCs transplantation to repair cartilage defect is characterized with minimal invasion and easy operation, and it will greatly promote the regeneration repair of articular cartilage defect.     

The relationship between cartilage end-plate calcification and disc degenerat ion: an experimental study

目的　研究椎体软骨终板钙化在椎间盘退变过程中的作用。方法　 2 0只新西兰兔随机分为造模与对照组 2组 ,每组再分 3个月和 8个月 2个观察亚组。切除造模组动物颈棘上、棘间韧带及分离颈椎后旁两侧肌肉 ,造成颈椎力学上的失衡而诱导兔颈椎间盘退行性改变。在术后 3个月和 8个月时分别处死动物 ,取颈椎间盘组织 ,行病理学检查在形态学上评定颈椎间盘退变程度 ,测定不同退变程度椎间盘软骨终板钙化层厚度。结果　退变程度较轻或基本正常的颈椎间盘 ,软骨终板结构良好 ,潮标清晰 ;退变程度较重的颈椎间盘 ,软骨终板发生明显纤维化 ,潮标前移 ,钙化软骨和软骨下骨板增厚。软骨终板钙化层厚度与椎间盘退变程度呈非常明显的相关性。结论　颈椎软骨终板的不断钙化和骨化导致颈椎间盘营养发生障碍可能是启动颈椎间盘退变的关键因素