miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

TGF-β1对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的诱导作用

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）诱导胶质瘤U87细胞发生上皮-间质转化（EMT）的作用,为阐明胶质瘤侵袭性生长的机制提供依据。方法：以不同浓度TGF-β1体外处理胶质瘤U87细胞,分为2.5×10^-6、5.0×10^-6、10.0×10^-6和20.0 ×10^-6g·L^-1 TGF-β1组,以0×10^-6g·L^-1TGF-β1组作为空白对照组。Western blotting法检测各组U87细胞中上皮标志物（上皮钙黏蛋白）和间质标志物（神经钙黏蛋白和波形蛋白）以及转录因子（Snail、Slug和Zeb1蛋白）的相对表达水平;倒置显微镜下观察U87细胞形态表现;划痕愈合实验检测U87细胞相对迁移距离。结果：随着TGF-β1浓度的升高,胶质瘤U87细胞中上皮钙黏蛋白相对表达水平逐渐降低,2.5×10^-6、5.0×10^-6、10.0×10^-6和20.0 ×10^-6g·L^-1 TGF-β1组U87细胞中上皮钙黏蛋白相对表达水平低于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）;神经钙黏蛋白和波形蛋白相对表达水平则随着TGF-β1浓度的升高逐渐升高,神经钙黏蛋白相对表达水平分别比空白对照组升高11.5%（P>0.05）、39.4%（P>0.05）、51.0%（P<0.05）和76.9%（P<0.05）;10.0×10^-6和20.0×10^-6g·L^-1TGF-β1组U87细胞中波形蛋白相对表达水平均高于空白对照组（P<0.01）。5.0×10^-6、10.0×10^-6和20.0×10^-6g·L^-1TGF-β1组U87细胞中Snail、Slug和Zeb1蛋白的相对表达水平高于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）。与空白对照组比较,10.0×10^-6 g·L^-1TGF-β1组U87细胞呈拉伸状和更为狭长,细胞迁移能力明显增强。结论：一定浓度范围内,TGF-β1能以浓度依赖方式诱导胶质瘤U87细胞发生EMT。     

MSCs旁分泌对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响

目的: 探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）旁分泌因子肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响及其机制。方法: 将SD大鼠MSCs传代至第3代后分为未转染组、转染HGF-siRNA组及转染阴性对照（NC）-siRNA组,分别进行相应处理。通过ELISA、蛋白质印迹法检测各组MSCs细胞上清中及细胞中HGF、转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）含量和蛋白表达量。用浓度为1 μmol/L的多柔比星处理H9C2细胞4 h后分为4组：单独培养组、MSCs共培养组、与HGF-siRNA-MSCs共培养组及与NC-siRNA-MSCs共培养组。培养24 h后通过流式细胞术Annexin Ⅴ/PI双染法检测H9C2细胞凋亡率。结果： HGF-siRNA组MSCs上清中TGF-β1浓度为（519.23±24.34）pg/mL,明显高于未转染组［（459.65±11.78）pg/mL］及NC siRNA组[（459.33±11.78）pg/mL]（P均＜0.05）;转染HGF-siRNA组MSCs中TGF-β1表达量亦明显高于其他两组。HGF-siRNA-MSCs与H9C2细胞共培养组中H9C2细胞凋亡率为（18.54±0.64)%,较MSCs共培养组［(6.65±0.49)%］及NC-siRNA-MSCs共培养组［(9.70±1.62)%］明显增加（P均＜0.05）。结论： MSCs旁分泌因子HGF通过抑制TGF-β1的表达对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡起保护作用。     

LINC00665通过let-7i/HMGA1促进肝癌细胞增殖与侵袭的机制研究

目的 探讨LINC00665通过let-7i/HMGA1对肝癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法 通过qRT-PCR分析LINC00665在肝癌组织中的表达情况。选择人肝癌细胞Hep3B和Huh7细胞，分别将其分为siRNA-NC组、siRNA-LINC00665组、let-7i mimics-NC组、let-7i mimics组进行转染；采用qRT-PCR和Western blot检测各组的HMGA1 mRNA和蛋白水平；CCK8法检测各组细胞的增殖活力；划痕实验检测各组细胞的划痕愈合率；Transwell实验检测各组细胞的侵袭数量。结果 LINC00665在肝癌组织中的表达量显著高于正常组织。hep3B和Huh7细胞转染48 h后，与si-NC组相比，si-LINC00665组细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降，HMGA1的mRNA和蛋白水平下降，let-7i的表达水平升高；与let-7i mimics-NC组相比，let-7i mimics组细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降，HMGA1的mRNA和蛋白水平下降。结论 LINC00665通过let-7i/HMGA1途径，在肝癌进展中调控肿瘤增...     

Let-7a microRNA沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用

目的：研究let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用,并利用分子生物学实验探索其可能的作用机制。方法：用LipofectamineTM2000介导的let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌细胞株MCF-7,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24h后蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡。结果: 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组（0.586±0.032 vs 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,let-7a在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性;转染24h后,let-7a组的细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。结论： LipofectamineTM2000介导的let-7a可以通过抑制c-myc的基因表达,对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖进行抑制。     

Let-7a沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用

目的 探讨let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用及可能的作用机制.方法 用lipofectamineTM2000介导let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞株,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24 h后c-myc蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡.结果 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组(0.586±0.032, 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62 kD的特异性条带,与c-myc蛋白分子量相符,let-7a组的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性.结论 Let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用,其机制可能与抑制c-myc的基因表达有关.     

磷脂酰肌醇3激酶和细胞外调节蛋白激酶信号通路对支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖的协同调控作用

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路对支气管哮喘（简称哮喘）大鼠气管平滑肌细胞（ASMC）增殖的协同调控作用。方法 6～8周龄SPF级雄性SD 大鼠,复制大鼠慢性哮喘模型,离体培养大鼠气管ASMC,将细胞分为正常组、哮喘组、转化生长因子β1（TGF-β1）组、TGF-β1+PD98059组、TGF-β1+渥曼青霉素（wortmannin）组、TGF-β1+PD98059+wortmannin组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况及Western blotting法检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）表达情况。结果 CCK-8法检测各组大鼠ASMC OD 值,TGF-β1组高于正常组和哮喘组,TGF-β1+ PD98059组、TGF-β1+wortmannin组和TGF-β1+PD98059+wortmannin组低于TGF-β1组,TGF-β1+ PD98059+wortmannin组低于TGF-β1+ PD98059组和TGF-β1+wortmannin组（P＜0.01）。Western blotting法检测ASMC中p-Akt的表达,哮喘组高于正常组,TGF-β1组高于哮喘组,TGF-β1+wortmannin组低于TGF-β1组（P＜0.01）。Western blotting法检测ASMC中p-ERK1/2的表达,哮喘组高于正常组,TGF-β1组高于哮喘组,TGF-β1+ PD98059组低于TGF-β1组（P＜0.01）。结论 PI3K和ERK信号通路协同调控了TGF-β1刺激哮喘大鼠ASMC增殖过程。     

Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的：构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤（Ewing’s sarcoma,ES）细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法：通过 Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体———pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒———pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株 A673和 SK-ES-1获得A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内 let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达。结果：PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带 let-7a 的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的 A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍（P=0.000）和6.5倍（P=0.001）,差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论：成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株 A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。     

Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

microRNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控及其在白内障中的作用

目的 探讨micro RNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控作用及其在白内障中的作用。方法 利用Real time q-PCR方法,检测年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜和正常人眼晶状体前囊膜、人晶状体上皮细胞凋亡模型和正常人晶状体上皮细胞系let-7a的表达情况;利用Lipofectamine 2000瞬时转染let-7a mimic和let-7a inhibitor,分别上调和下调人晶状体上皮细胞中let-7a的表达,并利用Real time q-PCR方法验证转染效率,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果 年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组let-7a的表达显著低于正常对照组;人晶状体上皮细胞凋亡模型组let-7a的表达显著低于正常对照组;let-7a mimic转染组let-7a的表达显著高于对照组,let-7a inhibitor转染组let-7a的表达显著低于对照组;let-7a mimic转染组细胞凋亡率显著低于对照组,let-7a inhibitor转染组细胞凋亡率显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 micro RNA let-7a能够调控人晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发病过程中发挥重要作用,micro RNA let-7a可能成为白内障非手术治疗的新靶点。     

Let-7d通过靶向调控Rhotekin基因抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨let-7d在骨肉瘤组织中的表达,并研究let-7d及其靶基因对人骨肉瘤细胞U2OS增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集2010年至2015年于我科行手术切除的25例骨肉瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘>5 cm）,并用qPCR检测let-7d的表达情况。构建稳定过表达let-7d的U2OS细胞,用qPCR验证let-7d过表达情况,以转染pCDH空病毒载体的U2OS细胞作为对照组细胞,并分别采用CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验检测过表达let-7d对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过微RNA靶基因预测软件和双荧光素酶实验明确let-7d的下游靶基因,检测过表达let-7d的U2OS细胞中靶基因的表达水平,并通过小干扰RNA技术研究抑制靶基因表达对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 骨肉瘤组织中let-7d表达水平低于癌旁组织（P<0.01）。与人成骨细胞hFOB1.19相比,U2OS细胞中let-7d表达水平下调（P<0.01）。与对照组相比,过表达let-7d能抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭（P均<0.05）。微RNA靶基因预测软件和双荧光素酶实验结果显示,Rhotekin（RTKN）基因是let-7d的直接靶基因,且过表达let-7d导致U2OS细胞中RTKN mRNA表达水平较对照组降低（P<0.01）。干扰RTKN表达能抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭（P均<0.05）。结论 Let-7d通过靶向调控RTKN抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,可作为骨肉瘤治疗一个新的靶点。     

蓬乱蛋白2 干扰和过表达慢病毒载体的构建 及其在hUVECs 中的表达

目的 获得蓬乱蛋白2（DVL2）基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中（hUVECs） 稳定表达。方法 ①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2 干扰 和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和测序技术鉴定载体构建是否成功;② 以3 质粒系统在HEK293T 细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转 染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC 组（hUVECs 空白对照）、NC 组（HBLV-GFP-PURO 阴性对照）、干扰组（pHB-shRNA-HDVL2）及过表达组（pHBLV-HDVL2）。③通过 qRT-PCR 与Western blotting 检测分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果 ①插 入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装 后,NC 组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108 和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率 达98%。③干扰组DVL2 的表达较BC 组降低,差异有统计学意义（P <0.05）,过表达组较BC 组升高,差异有统 计学意义（P <0.05）,其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC 组的2.7 倍。结论 DVL2 基因干扰和过表 达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs 中稳定表达。     

miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移

目的 探讨miR-let-7c-5p能否调控HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移。方法 生物信息学方法确定miR-let-7c-5p的关键基因;RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌和癌旁组织中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2 蛋白相对表达量。以人正常膀胱细胞SV-HUC-1作为对照,RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌细胞系T24,UM-UC-3,5637细胞中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2蛋白的相对表达量。对UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p分别进行上调和下调,上调实验设模拟物阴性对照组（mimic-NC）、miR-let-7c-5p模拟物组（mimicmiR-let-7c-5p）、下调实验设阴性对照组（inhibitor NC）及miR-let-7c-5p抑制剂组（si-miR-let-7c-5p）,双荧光素酶实验、RT-qPCR和Western blot法共同验证miR-let-7c-5p和HMGA2的靶向关系;Transwell小室检测单独上调或下调miR-let-7c-5p表达及同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移的变化;Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin, N-cadherin, vimentin, Snail）相对表达量。结果 HMGA2为miR-let-7c-5p的靶基因之一;与癌旁组织相比,膀胱癌组织中miR-let-7c-5pmRNA相对表达量降低（P<0.05）,HMGA2蛋白相对表达量增加（P< 0.05）;与SV-HUC-1细胞相比,UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p相对表达量显著降低,HMGA2显著增加（P=0.01）。上调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著下降（P<0.05）;下调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著增加（P<0.05）;当同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力显著下降（P<0.05）。Western blot结果显示,上调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达增加,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达下降;下调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达下降,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达增加;同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达能够抑制UM-UC-3细胞EMT（P<0.05）。结论 miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制EMT进而抑制UM-UC-3细胞侵袭和迁移。     

H19介导miR-let-7的分子机制及其在妊娠期糖尿病中的作用研究

背景　妊娠期糖尿病作为临床中常见的妊娠期合并症,其严重威胁产妇及胎儿的生命健康。H19作为一种印记基因,进一步分析其为妊娠期糖尿病靶向治疗工作的开展提供依据。目的　研究H19介导miR-let-7的分子机制及其在妊娠期糖尿病中的作用。方法　2017年1月—2018年1月于北京大学医学部购进50只SPF级小鼠,根据小鼠的血糖以及血脂水平等将其分为正常组（n=20）和高脂组（n=30）。采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术分析正常组和高脂组小鼠H19、let-7、靶基因脂蛋白脂肪酶（LPL）以及肝脏胰岛素受体β（INSR-β）和胰岛素通路相关因子2（IRS-2）、胰岛素受体（INSR）的相对mRNA表达水平。同时于小鼠成肌细胞株中,分别通过细胞转染技术转染干扰RNA（siRNA）,特异性敲除小鼠H19,以及转染反义链抑制剂ilet-7,特异性阻断let-7结合靶基因,共转染后分别在第3、6周时收获细胞,观察不同时间点H19、let-7以及靶基因LPL、INSR-β、IRS-2和INSR的相对mRNA表达水平。在人卵巢畸胎瘤细胞系PA-1中,分别通过细胞转染技术转染siRNA,特异性敲除人H19,以及转染反义链抑制剂ilet-7,特异性阻断let-7结合靶基因,共转染后分别在第3、6周时收获细胞,观察各组中H19、let-7以及靶基因LPL、INSR-β、IRS-2及INSR的相对mRNA表达水平。结果　高脂组小鼠H19、let-7及LPL mRNA表达水平高于正常组,INSR-β、IRS-2及INSR mRNA表达水平低于正常组（P<0.05）。不同时间点小鼠成肌细胞株H19、let-7、LPL、INSR-β、IRS-2及INSR mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。不同时间点人卵巢畸胎瘤细胞系PA-1 H19、let-7、LPL、INSR-β、IRS-2及INSR mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论　H19在miR-let-7中发挥分子介导机制,且在妊娠期糖尿病的参与中发挥至关重要的作用,临床中应当加强对妊娠期孕妇的H19以及miR-let-7等相关指标的检测,实现对妊娠期糖尿病的早期预测。     

稳定高表达ANO1对Hep-2细胞生物学性状的影响

［摘 要］目的：建立外源性ANO1稳定高表达的Hep-2细胞株,并观察其对 Hep-2 细胞生物学性状的影响。方法：设计引物,提取头颈鳞癌患者的临床标本DNA,并以其为模板行PCR,得到ANO1基因序列片段,将ANO1片段插入到PSG-5质粒,转染入Hep-2细胞株,将稳定高表达ANO1的Hep-2细胞株设为实验组,空白质粒转染的Hep-2细胞株设为对照组。并利用Western blotting法和免疫荧光实验检测已转染细胞,观察ANO1的表达情况。利用Boyden小室侵袭实验和黏附实验检测Hep-2细胞生物学性状的变化。结果：成功构建含ANO1片段的pSG-5质粒,Western blotting法检测结果显示,各组均出现目的条带,实验组的相对分子质量为100 000处条带明显较浓。间接免疫荧光实验结果显示,稳定高表达ANO1的Hep-2细胞内显现出亮绿色荧光,而空白质粒转染的Hep-2细胞内仅有较暗、较浅的绿色荧光。Boyden小室侵袭实验和黏附实验结果显示,稳定高表达ANO1的Hep-2细胞穿膜细胞百分比和黏附细胞百分比均明显高于对照组,两组结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：成功建立了ANO1稳定高表达的Hep-2细胞株,稳定高表达ANO1提高了Hep-2细胞的迁移能力。     

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建

目的  构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法  采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果  HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论  HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

代谢型谷氨酸受体7对人胚胎神经干细胞增殖的影响

目的 研究代谢型谷氨酸受体7(mGluR7)对人胚胎神经干细胞增殖的影响。方法 利用MTT比色法分析mGluR7过表达载体、mGluR7siRNA在不同时间对体外的人胚胎NSCs细胞活力的影响, 神经球测量方法分析mGluR7对人神经球生长的影响, 流式细胞术分析mGluR7对人NSCs细胞周期及细胞凋亡的影响。结果 MTT结果表明在处理24 h, 48 h和72 h后, mGluR7显著增强人NSCs的细胞活力, 增殖细胞数量显著增多, 神经球直径显著增大, mGluR7siRNA抑制人神经球的增殖。过表达mGluR7后, 与对照组相比G1/G0期和细胞比率显著下降, S期细胞比率显著上升, mGluR7过表达促进了细胞G1到S期转化, 沉默mGluR7将人NSCs细胞阻滞在G1/G0期。应用流式细胞术分析过表达mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响, 转染48 h后, 早凋晚凋均显著下降, 沉默mGluR7能够显著诱导人NSCs的早凋和晚凋。结论 mGluR7可促进体外培养的人胚胎皮质NSCs增殖。     

慢病毒介导miR-145对骨肉瘤MG-63细胞侵袭和迁移力的影响

目的 探讨慢病毒介导miR-145对成骨肉瘤细胞MG-63侵袭及迁移能力的影响。 方法 通过慢病毒携带miR-145表达载体转染骨肉瘤MG-63细胞,实验分为:转染组(转染miR-145阳性序列)、对照组(转染阴性对照序列)、空白组(PBS)。利用生物信息学软件预测血管内皮生长因子(VEGF)为miR-145的候选靶基因,利用双荧光素酶报告基因检测验证miR-145对靶基因VEGF的直接调控作用。实时荧光定量PCR检测基因表达,Western-blot检测蛋白表达,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移运动能力。 结果 与对照组比较,转染组细胞内荧光素酶活性明显下降(P<0.05); 与对照组和空白组比较,转染组miR-145 mRNA的表达量显著增加(P<0.05),VEGF mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05),穿膜细胞数及细胞划痕愈合率均显著降低(P<0.05)。 结论 miR-145通过靶向VEGF基因,进而抑制骨肉瘤MG-63细胞的侵袭及迁移能力。