痘苗生长因子和胸苷激酶双基因缺失表达双荧光溶瘤痘病毒的构建及其对胰腺癌细胞的杀伤作用

［摘要］目的: 构建痘苗生长因子(vaccinia growth factor,VGF)和胸苷激酶(thymidine kinase,TK)双基因缺失同时表达绿色荧光蛋白（GFP）和DsRed双荧光的溶瘤痘病毒,并研究其对胰腺癌细胞的杀伤作用。方法: 在病毒TK基因处利用同源重组方法将病毒晚期启动子F17R调控的GFP基因和早晚期启动子SEL调控的DsRed基因克隆入缺失VGF基因的VSC20亲本病毒,构建同时缺失VGF和TK双基因的重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP DsRed。同时利用CCK 8法和结晶紫染色法检测该病毒对胰腺癌细胞Patu8988和BxPC-3的杀伤作用。结果： 通过同源重组和软琼脂筛选获得vvDD-GFP-DsRed重组溶瘤痘病毒。CCK 8法结果显示,与MOI=0相比,MOI分别为1,10时,vvDD-GFP-DsRed对Patu8988细胞和BxPC-3细胞具有明显的杀伤作用,且在此范围内随MOI值增加杀伤效果逐渐增强(P均＜0.05)。与MOI=0相比,Patu8988细胞在MOI为0.01时存活率低(P＜0.05),且在结晶紫染色法测定中形成了明显的空斑。结论： 成功构建vvDD GFP DsRed重组溶瘤痘病毒,其对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用。     

抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体对人脑胶质瘤生长的影响

目的：研究抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体 (双抗)对裸鼠体内人脑胶质瘤生长的影响。方法：动物分为6组,实验组系双抗治疗组,其余为不同的对照组,采用人脑胶质瘤裸鼠模型NHG-1,分别观察各组中肿瘤的出现、生长及宿主的生存情况。结果：在实验组中,肿瘤出现的平均潜伏期、肿瘤细胞生长周期时间以及动物的生存期均比各对照组延长(P<0.05或P<0.01);肿瘤增殖曲线显示,经几周缓慢生长后,各对照组先后进入快速生长期,而经双抗治疗的实验组,肿瘤始终处于缓慢生长状态。结论：抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体可以延缓人脑胶质瘤在动物体内的生长速度,具有临床应用潜力。     

双特异性抗体药物特性及其在肺癌治疗中的临床应用

双特异性抗体具有两种不同抗原结合位点,可结合两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位,相较于常见的单特异性抗体,双特异性抗体具有提升抗肿瘤效果、不良反应小和抗体用量少的特点。肺癌是双特异性抗体研究重点关注的疾病领域之一,amivantamab的出现和获批上市为患者提供了新的选择。本文对肿瘤治疗领域的双特异性抗体药物特性和肺癌领域双特异性抗体研究进展进行综述,为肺癌的临床治疗提供新思路。     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体的鉴定、免疫活性测定及其对T淋巴细胞的作用

目的:鉴定自制的抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)的双向结合能力,测定其免疫活性及其对T淋巴细胞的作用.方法:用标化凝胶柱洗脱、免疫组化等方法对自制双抗的相对分子质量及双向结合能力进行测定,用酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法对双抗的双向免疫活性及其对T淋巴细胞表型的作用进行测定,并观察T淋巴细胞形态的变化.结果:经洗脱证实该双抗相对分子质量为11万;经双抗作用后,胶质瘤细胞和淋巴细胞阳性染色率分别>80％和>90％;免疫活性测定显示双抗不仅可与T淋巴细胞结合(结合效价为1∶32 000),还可结合胶质瘤细胞(结合效价为1∶8 000);在细胞表型方面,被双抗活化时,CD3+细胞数占绝大多数,CD8+细胞比例随着培养时间的延长逐渐增加.结论:所制备的复合物确系具有双向结合能力的双抗,有双向免疫活性,并可活化T淋巴细胞.     

榄香烯协同抗CD3—抗胶质瘤双特异性抗体免疫治疗胶质瘤作用的研究

目的：研究榄香烯协同抗CD3－抗胶质瘤双特异性抗体免疫治疗胶质瘤的作用。方法：外周血单个核细胞（HuPBL)转输入重度联合免疫缺陷）（SCID）鼠,皮下移植入脑胶质瘤,腹腔注入双特异性抗体,通过测量肿瘤,流式细胞仪分析,原位杂交法,观察潜伏期,肿瘤体积及人淋巴细胞浸润。结果：移植鼠潜伏期,肿殖速度延长,活化的HuPBL大量定位肿瘤组织,结论：榄香烯协同双特异性抗性体生物治疗,有可能成为肿瘤生物治疗新途径。     

细胞融合法制备抗人CD3—抗人IgMμ链双特异性抗体

目的 制备抗入CD3－抗人IgMμ链双特异性抗体（Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交－杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定。方法 将抗入CD3单克隆抗体细胞株采用8－AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株,再通过FuGENE^TM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HAT^S G418^R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合,通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株。结果 融合6次,共接种1080孔,共得5株抗CD3－抗IgM杂交－杂交瘤。经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能。结论 采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交－杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似。     

Anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体的纯化与活性

针对细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）和CXC趋化因子受体4型（CXCR4）两个靶点,设计anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体的基因序列,C末端连接组氨酸标签（6 × His标签）,通过pET-22b（+）重组表达质粒转化大肠埃希菌E.coli BL21,经 IPTG 诱导表达,以可溶性形式存在于菌体裂解上清液。为了提高双特异性纳米抗体的产量和纯度,采用3种不同的方法进行样品制备和纯化。结果表明,通过机械裂菌并改进缓冲液的盐离子和咪唑浓度以及pH,经His Trap FF亲和色谱柱纯化后,对双特异性纳米抗体分离效果较好,目的蛋白产量超过1 mg/L,纯度可达到97%。同时,anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体能够与细胞表面两个抗原特异性结合,增强IL-2活化的人外周血单个核细胞（PBMC）对胰腺癌细胞株 AsPC-1的杀伤能力,为其后续体内药效学评价奠定了基础。     

细胞融合法制备抗人CD3-抗人IgM μ链双特异性抗体

目的制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交-杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定.方法将抗人CD3单克隆抗体细胞株采用8-AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株.再通过FuGENETM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HATsG418R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合.通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株.结果融合6次,共接种1 080孔,共得5株抗CD3-抗IgM杂交-杂交瘤.经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能.结论采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交-杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似.     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测

目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]的分离纯化。采用FACS法测定分别经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3ScFv蛋白和Diabody[CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性。采用间接ELISA法进行抗抗CD3ScFv抗体特异性结合活性的检测。结果抗抗CD3ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3ScFv蛋白结合而不与血清发生反应。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%。结论制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应

目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1(CYP2E1)基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒(1.2×1012 pfu/ml).分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞(BMSC).用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白(EGFP)、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪(DTIC)的抗肿瘤效应(实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1+A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC).结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1+A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1+A375组药物半数抑制量(IC50)值为(0.17±0.13)mmol/L,其对照组为(0.65±0.20)mmol/L,二者差异有统计学意义(P＜0.01),可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1+A375组细胞凋亡率明显高于其对照组(26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01).结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.     

汉滩病毒S基因-重组痘苗病毒的制备和表达鉴定

目的 :制备和鉴定汉滩病毒 (HTNV)S基因 重组痘苗病毒 ,为进一步建立肾综合征出血热 (HFRS)患者HTNV核衣壳蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的靶细胞奠定基础。　方法 :用野生型痘苗病毒和HTNVS基因 重组痘苗病毒分别感染Vero细胞 ,进行病毒扩增和滴度测定。用PCR和斑点杂交鉴定重组痘苗病毒基因组中的HTNVS基因 ,用间接免疫荧光和westernblot检测核衣壳蛋白的表达。　结果 :制备了含HTNVS基因的重组痘苗病毒 ,滴度为 4 .0 2× 10 7。该重组痘苗病毒基因组中存在HTNVS基因 ,它在Vero细胞中能有效地表达核衣壳蛋白。　结论 :制备了较高滴度、能有效表达HTNV核衣壳蛋白的重组痘苗病毒。     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

抗CD3单克隆抗体激活杀伤细胞高效扩增培养体系的建立及细胞毒活性检测

目的： 建立从20mL外周血中高效扩增抗CD₃单克隆抗体激活的杀伤细(CD₃AK)的培养体系,并进行体外细胞毒活性检测。 方法： 采用抗CD₃单克隆抗体（Anti-CD₃ mAb）激活人外周血单个核细胞（PBMC）,在人重组白细胞介素2(rIL-2)的协同活化下,获得CD₃AK。对CD₃AK进行长期体外培养,进行增殖动力学、免疫表型和体外抗肿瘤活性的分析。 结果：在培养第7～22天,CD₃AK增殖倍数明显提高,最高可达317倍;免疫表型分析显示,CD₃⁺细胞从活化前的51.9%增加至94.6%,CD₄⁺细胞从19.5%增加至51.1%,CD₈⁺细胞从22.1%增加至52.1%;效靶比20∶1组和40∶1组的杀伤肿瘤细胞活性明显高于10∶1组（P<0.05和P<0.01）;在7～19 d的培养天数之内,杀伤肿瘤细胞活性最强。 结论： 从外周血中高效扩增的CD₃AK是以CD₃⁺、CD₄⁺和CD₈⁺细胞为主的异质性细胞群,在体外有明显的杀伤肿瘤细胞活性。     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。