京尼平苷通过P13K-Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤北大核心CSCD

目的 探讨京尼平苷对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的拮抗作用,以及PI3K-Akt途径在其中的作用。方法 取健康青少年环切术后包皮,分离并培养表皮黑素细胞。取第2 ～ 3代黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、京尼平苷组（125 μmol/L京尼平苷处理）、LY294002组（5 μmol/L LY294002处理）、H2O2组（250 μmol/L H2O2处理）、京尼平苷 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入250 μmol/L H2O2作用4 h）、京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入5 μmol/L LY294002作用1 h,然后用 250 μmol/L H2O2作用4 h）。作用完成后,用噻唑蓝（MTT）法检测黑素细胞增殖活性,Western印迹检测Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、血红素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx-1）蛋白的表达,生物化学方法检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）含量。通过单因素方差分析（ANOVA）对各组间数据进行比较,采用SNK-q检验进行组间两两比较。结果 H2O2组细胞增殖率较对照组明显降低（P 〈 0.01）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.05）蛋白表达水平下降,SOD活性、CAT活性降低（均P 〈 0.01）,ROS含量显著升高（P 〈 0.01）。与H2O2组相比,京尼平苷＋ H2O2组黑素细胞增殖率上升（72.98% ± 8.92%比50.53% ± 10.85%,P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.05）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达上调,SOD［（6.82 ± 1.03） U/mg比（1.29 ± 0.43 ） U/mg,P 〈 0.05］和CAT［（46.08 ± 4.16） U/mg比（18.71 ± 3.09） U/mg,P 〈 0.05］酶活性增高,ROS含量（1 284.33 ± 110.64比2 158 ± 222.75,P 〈 0.01）减少;京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组黑素细胞增殖率（44.35% ± 14.85%）较京尼平苷 ＋ H2O2组降低（P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.05）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达下调,SOD活性［（1.31 ± 0.65） U/mg,P 〈 0.05］和CAT活性［（23.25 ± 5.56） U/mg,P 〈 0.05］减弱,ROS含量增加（1 668 ± 62.03,P 〈 0.05）。结论 京尼平苷可通过PI3K-Akt途径促进黑素细胞HO-1和GPx-1表达,增强SOD和CAT活性,拮抗黑素细胞氧化应激损伤。     

C型凝集素1受体参与人中性粒细胞体外杀伤白念珠菌活性的实验研究

【摘要】 目的 探讨人中性粒细胞能否通过C型凝集素1受体（dectin-1）识别白念珠菌细胞壁不溶性β葡聚糖来介导体外杀伤白念珠菌的活性。 方法 100 mg/L β葡聚糖体外作用于中性粒细胞1、6、24 h后,实时荧光定量逆转录PCR分析dectin-1和Toll样受体2 mRNA表达水平。100 mg/L β葡聚糖体外分别刺激中性粒细胞15 min、2 h、6 h,或先用dectin-1抑制剂昆布多糖100 mg/L和50 mg/L预处理30 min后,再予100 mg/L β葡聚糖刺激2 h,微量培养板荧光分析法检测中性粒细胞H2O2释放水平。昆布多糖预处理的中性粒细胞与白念珠菌体外共培养后,检测菌落形成单位（CFU）。结果 β葡聚糖作用中性粒细胞1、6、24 h后,dectin-1 mRNA水平分别为2.8195 ± 0.1669、5.4859 ± 0.7244、3.6041 ± 0.5372,均明显高于空白对照组（均P < 0.01）。β葡聚糖刺激中性粒细胞15 min后H2O2水平为（64.55 ± 15.67） μmol/L,2 h时为（290.34 ± 30.56） μmol/L,6 h时为（208.54 ± 26.88） μmol/L,与空白对照组（22.05 ± 3.99） μmol/L比较,差异均有统计学意义（均P < 0.01）;100 mg/L和50 mg/L昆布多糖预处理组分别为（80.45 ± 22.41） μmol/L和（130.42 ± 44.55） μmol/L,与β葡聚糖刺激组相比,分别降低了73%和45%,差异均有统计学意义（P < 0.01）。昆布多糖能明显抑制中性粒细胞体外杀伤白念珠菌的活性（均P < 0.01）。 结论 Dectin-1参与人中性粒细胞分泌H2O2以及对白念珠菌杀灭活性,为过继性粒细胞转输治疗系统性念珠菌感染提供初步依据。 【关键词】 念珠菌,白色; 中性白细胞; β葡聚糖类; 外源凝集素类,C型; 过氧化氢     

喜树碱对人原代角质形成细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对人原代角质形成细胞（HPK）自噬的影响。方法 取健康男性包皮组织,采用两步消化法分离提取HPK,取第3代细胞用于实验。将HPK分为实验组和对照组,实验组用200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱处理,对照组用0.1%二甲基亚砜（DMSO）处理。处理24、48 h后,采用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡;免疫印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62变化。选取2 μmol/L喜树碱作用HPK 24 h,间接免疫荧光法检测LC3蛋白变化,透射电镜观察自噬体超微结构,进一步确认喜树碱对自噬的诱导效应。结果 随着喜树碱浓度的增加,对HPK的增殖抑制作用逐渐增强,各组24 h增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 152.9,P < 0.01）,其中2、6 μmol/L组高于对照组,差异有统计学意义（t = 12.09、18.76,均P < 0.01）,200 nmol/L组与对照组差异无统计学意义（t = 2.24,P > 0.05）。48 h时各组增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 123.8,P < 0.01）,实验组均高于对照组（均P < 0.01）。对照组和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱组24 h细胞凋亡率分别为（2.30 ± 1.68）%、（15.90 ± 2.14）%、（29.33 ± 3.51）%、（35.28 ± 3.05）%,差异有统计学意义（F = 89.57,P < 0.01）,各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（均P < 0.01）。2、6 μmol/L喜树碱处理细胞24 h后,LC3Ⅱ蛋白显著上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光检测显示,2 μmol/L喜树碱组与对照组自噬体阳性细胞比例分别为（60.16 ± 8.78）%、（38.96 ± 13.12）%,差异有统计学意义（t = 3.003,P < 0.05）。透射电镜观察到2 μmol/L喜树碱作用细胞24 h后细胞内形成自噬体和自噬溶酶体。结论 2、6 μmol/L喜树碱可诱导HPK自噬水平升高,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。     

维生素C溶液在H2O2诱导体外培养黑素细胞氧化损伤中的影响

目的：探讨维生素C对体外培养的人黑素细胞增殖活性的影响并评估维生素C对H2O2诱导的人黑素细胞氧化损伤的影响。方法通过CCK8法取最佳浓度的维生素C溶液和半数致死浓度的H2O2溶液应用于实验。将黑素细胞分为对照组、维生素C组、H2O2组、联合处理组4组,经过48 h处理后,分别用CCK8法和流式细胞仪检测4组细胞活率及凋亡率;将除维生素C组以外其他3组细胞,分别用生物化学法检测超氧化物歧化酶活力和丙二醛浓度,荧光染色法检测细胞内的活性氧。结果最佳浓度的维生素C溶液为1000μmol/L,半数致死浓度的H2O2溶液300μmol/L。对照组细胞活率、细胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛浓度、活性氧荧光强度分别为（100±4.99）％、（6.90±0.87）％、（54.71±4.75）U/mgprot、（263.39±20.17）nmol/mgprot、342.16±27.36。H2O2溶液可以明显提高黑素细胞凋亡率[（16.47±1.07）％]、超氧化物歧化酶活性[（103.62±10.44）U/mgprot]、丙二醛[（493.70±31.36）nmol/mgprot]和细胞内活性氧（782.48±36.25）水平,降低细胞活率[（39.07±2.94）％],而维生素C溶液可以显著降低H2O2溶液诱导的凋亡[（11.83±0.95）％],降低超氧化物歧化酶活性[（76.73±5.20）U/mgprot]、丙二醛[（371.82±23.05）nmol/mgprot]、活性氧（475.64±52.18）的含量,同时恢复细胞的活率[（74.31±5.53）％）]。结论1000μmol/L维生素C溶液不仅能促进人黑素细胞的增殖,对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用。     

芹黄素对过氧化氢所致黑素细胞凋亡的作用

目的采用过氧化氢(H2O2)诱导的黑素细胞体外氧化应激模型探讨芹黄素对黑素细胞的抗氧化保护作用。方法采用MTT法测定不同浓度芹黄素预处理前后H2O2对正常人表皮黑素细胞活力的影响,An-nexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞的凋亡情况,DCFH-DA流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)的含量。结果 250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞24h,黑素细胞活力降低至(36.42±7.21)%,凋亡率增加至(48.82±12.55)%。0.6μmol/L,2.5μmol/L和10.0μmol/L芹黄素预处理1h后,H2O2所致细胞活力分别增加至(41.53±5.25)%,(45.33±6.28)%和(51.92±5.29)%,凋亡率减少至(42.25±7.69)%,(37.54±8.82)%和(32.25±58.28)%。250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞2h后,黑素细胞ROS含量增加至空白对照组的(69.22±8.57)倍。10μmol/L芹黄素预处理1h后H2O2所致黑素细胞ROS含量为空白对照组的(54.48±5.03)倍,低于单用H2O2处理组。结论芹黄素可能通过减少ROS生成和抑制氧化应激对HO所致黑素细胞凋亡具有保护作用,其可能具有开发为治疗白癜风新药的前景。     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。     

尘螨变应原rDer p1诱导HaCaT细胞表达胸腺基质淋巴生成素的研究

【摘要】 目的 探讨尘螨变应原rDer p1在体外对角质形成细胞表达胸腺基质淋巴生成素（TSLP）的影响。 方法 体外培养人角质形成细胞株HaCaT细胞,予以0.1、1和10 mg/L尘螨变应原rDer p1与蛋白酶活化受体2（PAR2）特异性激动剂SLGIKV（500 μmol/L）和拮抗剂VKGILS（500 μmol/L）共培养,以无血清培养基为空白对照。用ELISA法和荧光定量PCR法检测各实验组和对照组TSLP蛋白及mRNA表达水平;通过激光共聚焦显微镜检测细胞内钙流变化分析rDer p1诱导HaCaT细胞产生TSLP和PAR2受体活化的关系。 结果 1 mg/L和10 mg/L rDer p1组培养12 h上清中TSLP水平分别为（155.5 ± 5.9） ng/L和（228.8 ± 28.7） ng/L,显著高于空白对照组（54.3 ± 13.9 ng/L,P < 0.01）,TSLP表达水平随rDer p1浓度增加而升高。SLGIKV组TSLP表达［（166.2 ± 8.8） ng/L］也显著高于空白对照组（P < 0.01）。10 mg/L rDer p1组和SLGIKV组TSLP mRNA相对表达量在8 h最高,分别为（3.28 ± 0.27）倍和（2.15 ± 0.26）倍,与4 h和24 h相比差异有统计学意义（P < 0.01）。SLGIKV可引起HaCaT细胞钙内流增加;10 mg/L rDer p1也可引起HaCaT细胞钙内流增加,经过PAR2受体特异性阻断剂VKGILS（500 μmol/L）处理后再给予rDer p1刺激,细胞内钙内流峰值明显降低。 结论 尘螨变应原rDer p1能够通过部分活化HaCaT细胞表面的PAR2受体诱导产生促炎细胞因子TSLP。     

外源性胆绿素对中波紫外线诱导的HaCaT细胞光损伤的保护作用

目的 探讨外源性胆绿素对中波紫外线（UVB）照射的HaCaT细胞的保护作用及其机制。方法 将培养的HaCaT细胞分为对照组（不加胆绿素,不照射UVB）、UVB组（30 mJ/cm2 UVB照射）和100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素 + UVB组（分别于30 mJ/cm2 UVB照射前1 h加入相应浓度胆绿素）,处理完成后继续培养24 h,观察HaCaT细胞形态变化,CCK8法检测各实验组细胞生存率。Western 印迹检测抗氧化信号分子Nrf?2蛋白及光损伤信号分子基质金属蛋白酶1（MMP?1）和MMP?3蛋白表达。结果 CCK8法结果显示,UVB组HaCaT细胞活力低于对照组（P < 0.05）,在加入100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 胆绿素预处理后,细胞生存率逐渐升高,与UVB组比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）。Western印迹显示,UVB组MMP?1（1.150 ± 0.187）、MMP?3（0.979 ± 0.054）蛋白表达较对照组（0.116 ± 0.018、0.636 ± 0.035）升高（均P < 0.01）,而100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素 + UVB组MMP?1（0.825 ± 0.139、0.313 ± 0.047和0.286 ± 0.036）、MMP?3（0.888 ± 0.017、0.672 ± 0.042和0.569 ± 0.037）蛋白表达较UVB组降低（均P < 0.05）。UVB组Nrf?2蛋白（0.906 ± 0.034）较对照组（1.242 ± 0.141）表达降低（P < 0.05）,100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素 + UVB组Nrf?2蛋白表达（1.556 ± 0.112、1.897 ± 0.234和2.035 ± 0.274）较UVB组升高（均P < 0.01）。结论 外源性胆绿素对UVB诱导的HaCaT细胞损伤起保护作用,该作用可能与Nrf?2抗氧化信号通路有关。     

异鼠李素对H2O2诱导的HaCaT细胞线粒体结构及功能损伤的保护作用研究

目的探究异鼠李素对氧化应激状态下HaCaT细胞线粒体结构及功能的保护作用。方法以HaCaT细胞为研究对象, 实验分为4组:对照组(常规培养HaCaT细胞)、异鼠李素组(仅加入60 μmol/L异鼠李素处理)、H2O2组(仅加入600 μmol/L H2O2处理)、异鼠李素+ H2O2组(加入60 μmol/L异鼠李素预处理12 h后换液加入600 μmol/L H2O2处理12 h)。采用流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平, 电镜观察线粒体超微结构, 共聚焦荧光显微镜观察线粒体膜电位, ATP检测试剂盒检测线粒体ATP含量, 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定线粒体DNA拷贝数。多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HaCaT细胞经H2O2处理后呈氧化应激状态, H2O2组细胞内ROS水平(10 725.0 ± 845.8)显著高于对照组(1 708.0 ± 69.4, t = 18.40, P<0.001), 线粒体膜电位荧光强度、ATP含量、线粒体DNA特征性基因ND-1表达量均显著低于对照组(t值分别为4.58、4.48、6.11,...     

白介素6在痤疮囊肿皮损中的表达及痤疮丙酸杆菌体外对THP-1细胞白介素6水平的影响

目的 检测寻常痤疮患者囊肿皮损中白介素6（IL?6）的表达,并观察痤疮丙酸杆菌体外对人急性单核细胞白血病细胞系THP?1信号分子p38MAPK及白介素6水平的影响。方法 实时荧光定量PCR检测6例痤疮患者囊肿皮损和6例健康人皮肤组织中IL?6 mRNA表达水平。用2 × 106、2 × 107、2 × 108 CFU/ml灭活痤疮丙酸杆菌菌悬液或脂多糖（100 μg/L）刺激THP?1细胞,同时设培养基对照组和p38MAPK抑制剂SB203580组（先用20 μmol/L SB203580处理,再用2 × 108 CFU/ml痤疮丙酸杆菌刺激）,作用不同时间（1 ~ 6 h）后,实时荧光定量PCR检测IL?6 mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验检测上清液中IL?6含量。2 × 108 CFU/ml灭活痤疮丙酸杆菌菌悬液刺激THP?1细胞15、30、60 min或脂多糖（100 μg/L）刺激30 min后,Western印迹法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK表达水平。结果 痤疮囊肿皮损和健康对照皮肤IL?6 mRNA水平分别为3.680 ± 0.790、1.155 ± 0.250,两组比较差异有统计学意义（t = 3.047,P < 0.05）。双因素方差分析显示,不同浓度痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组IL?6 mRNA表达水平差异有统计学意义（F = 532.3,P < 0.001,ν = 4）,痤疮丙酸杆菌刺激1、3、6 h之间差异也有统计学意义（F = 526.6,P < 0.001,ν = 2）。2 × 108 CFU/ml痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组上清液中IL?6浓度分别为（1 618.22 ± 32.23）、（3 212.06 ± 353.00）、（147.10 ± 0.53） ng/L,3组间差异有统计学意义（ν = 2,F = 102.35,P < 0.01）。2 × 108 CFU/ml痤疮丙酸杆菌作用于THP?1细胞15、30、60 min后磷酸化p38MAPK蛋白水平升高。SB203580组THP?1细胞IL?6 mRNA水平与未抑制组比较明显降低（t = 15.91,P = 0.004）。结论 寻常痤疮患者囊肿中IL?6 mRNA水平显著升高。痤疮丙酸杆菌体外可激活人THP?1细胞信号分子p38MAPK,促进其分泌IL?6。     

全乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯对氧化应激导致黑素细胞损伤的保护作用研究

目的 研究全乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯（AcEGCG）对H2O2诱导的人表皮黑素细胞损伤的保护作用,探讨其可能的作用机制。 方法 体外培养人表皮黑素细胞,采用H2O2诱导细胞损伤模型。实验分对照组、H2O2组、不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）组和AcEGCG组。MTS法测定细胞存活率,LDH测试盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的漏出量,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的表达水平;Western印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达情况。多个样本均数比较采用单因素方差分析,各样本间多重比较采用SNK-q检验。 结果 与对照组相比,H2O2处理组黑素细胞存活率明显降低（22.99% ± 0.53%,P < 0.01）,细胞内LDH漏出量增加（36.58% ± 0.73%,P < 0.01）,细胞内ROS水平明显升高（19.08 ± 0.57,P < 0.01）,caspase-9和caspase-3表达升高（分别为2.65 ± 0.079和2.36 ± 0.057,均P < 0.01）。与H2O2组相比,细胞存活率在10、20、40 μmol/L AcEGCG组（79.50% ± 3.62%、86.52% ± 5.13%、97.81% ± 5.21%）及EGCG组（43.19% ± 1.68%、63.34% ± 3.60%、70.82% ± 2.1%）明显增加（均P < 0.01）,caspase-9分别降低为1.44 ± 0.067、1.26 ± 0.059、1.10 ± 0.072及2.31 ± 0.085、2.13 ± 0.091、1.35 ± 0.064,caspase-3分别降低为1.70 ± 0.053、1.57 ± 0.057、1.24 ± 0.068及2.09 ± 0.076、1.98 ± 0.093、1.79 ± 0.056,差异均有统计学意义（P < 0.05）;LDH含量均明显下降（P < 0.01）;40 μmol/L AcEGCG或EGCG处理后,ROS含量明显下降（均P < 0.01）。 结论 AcEGCG对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,且显著优于EGCG,可能通过清除自由基、抗氧化、降低caspase-9及caspase-3表达等途径发挥作用。     

白藜芦醇对中波紫外线照射的人角质形成细胞凋亡及细胞周期的影响

【摘要】 目的 探讨白藜芦醇对中波紫外线（UVB）照射后人原代角质形成细胞（HEK）凋亡和细胞周期的影响。方法 0、25、50、100、150和200 μmol/L白藜芦醇处理人原代角质形成细胞12 h,分别采用CCK-8、BrdU和LDH法检测白藜芦醇对细胞增殖活性和死亡的影响。分别采用50 mJ/cm2 UVB和100 μmol/L白藜芦醇处理HEK细胞,分为正常对照组、白藜芦醇组、UVB组和UVB + 白藜芦醇组,采用Western印迹检测凋亡相关蛋白多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）和胱天蛋白酶3（caspase-3）以及细胞周期相关蛋白（cyclin）B1和cyclin E1的表达水平,采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平和细胞周期分布。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 0、25、50、100、150和200 μmol/L白藜芦醇组HEK细胞增殖活性差异有统计学意义（F = 46.52,P < 0.001）,不同浓度组均低于对照组（均P < 0.001）;100 μmol/L白藜芦醇组细胞DNA合成活力（0.761 ± 0.141）低于对照组（2.226 ± 0.141,t = 17.92,P < 0.001）;25、50、100和200 μmol/L白藜芦醇组细胞死亡率差异无统计学意义（F = 1.938,P > 0.05）。UVB和白藜芦醇处理后,4组细胞凋亡率和G1期、G2期、S期的细胞比例以及PARP、caspase-3、 cyclin B1、cyclin E1的表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。UVB组细胞凋亡率（24.69% ± 3.54%）及PARP、caspase-3的剪切水平（2.190 ± 0.349、0.090 ± 0.016）均高于对照组和UVB + 白藜芦醇组（4.00% ± 0.81%、0.926 ± 0.040、0.024 ± 0.019,均P < 0.05）;UVB组cyclin E1、cyclin B1蛋白水平（0.116 ± 0.017、0.775 ± 0.080）均低于正常对照组,UVB + 白藜芦醇组cyclin E1表达水平（0.287 ± 0.047）高于UVB组、cyclin B1表达水平（0.504 ± 0.009）低于UVB组（均P < 0.05）;UVB组S期细胞比例低于对照组和UVB + 白藜芦醇组,G1期、G2期细胞比例均高于UVB + 白藜芦醇组（P < 0.05）。结论 白藜芦醇可以抑制HEK增殖活力,抑制紫外线照射诱导的细胞凋亡,调控细胞周期进程。     

茶多酚对人乳头瘤病毒16亚基因永生化人宫颈上皮细胞生长的影响

目的 探讨茶多酚对人乳头瘤病毒16（HPV16）亚基因永生化宫颈上皮细胞（H8细胞）生长的影响。方法 采用0（对照组）、6.25、12.5、25、50 mg/L茶多酚与H8细胞共孵育24、36、48 h后,CCK8法检测细胞增殖,孵育24 h后流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,荧光显微镜观察细胞凋亡形态。结果 不同浓度茶多酚孵育H8细胞24、36、48 h可抑制H8细胞的增殖,12.5 mg/L茶多酚可时间依赖性降低H8细胞的相对生长率。流式细胞仪检测结果示,0、6.25、12.5、25、50 mg/L茶多酚组细胞凋亡率分别为29.96% ± 0.70%、52.62% ± 0.62%、52.22% ± 0.72%、42.52% ± 0.90%、45.96% ± 2.11%,组间差异有统计学意义（F = 272.00,P < 0.05）,各浓度茶多酚组细胞凋亡率均显著高于对照组（均P < 0.05）。荧光显微镜下可见茶多酚处理组H8细胞出现核固缩、核碎裂等典型凋亡形态学改变。各浓度组细胞G1、G2期细胞比例和细胞增殖指数差异均有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比,6.25、12.5、25 mg/L组G1期细胞比例增加（55.96% ± 0.72%、54.12% ± 3.20%、65.30% ± 1.51%,均P < 0.05）,G2期细胞比例减少（3.17 ± 1.82%、4.94 ± 1.46%、4.65 ± 4.26%,均P < 0.05）,增殖指数降低（0.44 ± 0.01、0.46 ± 0.02、0.36 ± 0.01,均P < 0.05）。结论 茶多酚可抑制H8细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期。     

β联蛋白对体外过氧化氢所致人皮肤成纤维细胞衰老表型的影响

目的 观察高表达的β联蛋白对体外过氧化氢（H2O2）所致正常人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老表型的影响。方法 NHSF分别转染pcDNA3.1-β联蛋白或空载体pcDNA3.1,然后150 μmol/L H2O2处理2 h。实验分为转染H2O2处理组（NHSF + β联蛋白 + H2O2）、转空载体H2O2处理组（NHSF + 空载体 + H2O2）以及转空载体组（NHSF + 空载体）。用RT-PCR和Western印迹分析β联蛋白的表达,显微镜观察细胞形态,试剂盒检测衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-gal）、细胞活性氧（ROS）以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析,多组间比较采用ANOVA检验。结果 pcDNA3.1-β联蛋白明显上调了NHSF中β联蛋白的表达。NHSF + 空载体 + H2O2组β联蛋白mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.2900 ± 0.0195和0.3130 ± 0.0171）明显低于NHSF + 空载体组（分别为0.5963 ± 0.0400和0.6190 ± 0.0090）,两组比较,均P ＜ 0.05;NHSF + β联蛋白 + H2O2组β联蛋白表达水平（0.7953 ± 0.0074）高于NHSF + 空载体 + H2O2组（P ＜ 0.05）。SA-β-gal染色率在NHSF + 空载体组、NHSF + 空载体 + H2O2组、NHSF + β联蛋白 + H2O2组分别为（2.9667 ± 0.2517）%、（37.70 ± 0.9539）%、（29.330 ± 0.6359）%,各组比较,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。NHSF + 空载体、NHSF + 空载体 + H2O2、NHSF + β联蛋白 + H2O2组ROS活性分别为（50.9963 ± 9.2688）%、（109.9190 ± 11.5215）%、（75.1063 ± 3.0138）%,SOD水平分别为（88.0856 ± 3.9181）、（35.5585 ± 3.4438）、（61.7029 ± 3.1716） U/mg,各组比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 高表达的β联蛋白能够抑制细胞衰老相关β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和细胞活性氧（ROS）的表达,同时上调了SOD的活性。 【关键词】 β连环素; 过氧化氢; 成纤维细胞; 氧化性应激; 细胞衰老     

组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究

目的 探究组织蛋白酶D（CatD）对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物（AGE）的调控作用。方法 分别以CatB + CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂（pepstatin A）、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性。CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8 h,而对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS）。孵育8 h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度。以不同浓度pepstatin A（37.5、75、150 μmol/L）或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率。慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性。分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率。结果 1 μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatin A组及1 μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90%以上,与对照组（100%）差异无统计学意义（F = 1.525,P > 0.05）。去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me + AGE-BSA组和MG-132 + AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度（275.00 ± 10.15、259.00 ± 11.14）均较其相应8 h点荧光强度（295.00 ± 6.56、285.67 ± 8.74）显著下降（配对t值分别为4.778、6.154,均P < 0.05）,而pepstatin A + AGE-BSA组8 h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义（均P > 0.05）。37.5、75和150 μmol/L pepstatin A组24 h内对吞入胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64% ± 1.27%、5.62% ± 0.47%和3.21% ± 0.73%,各组间差异有统计学意义（F = 45.876,P < 0.05）,且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低（P < 0.05）。荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80%以上。CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调（均P < 0.05）。CatD高表达慢病毒转染 + AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染 + AGE-BSA组（均P < 0.05）。结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。