生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

目的研究葡萄糖?6?磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞,采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%~90%融合时,将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞,未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达,CCK?8法检测3组A431细胞的增殖情况,流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019）,且A431细胞显著高于SCL?1细胞（均P<0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018）,差异均有统计学意义（P<0.05）。G6PD siRNA组在24~96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P<0.001）,而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P>0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）,而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。     

siRNA干扰Gadd45α表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞侵袭和迁移的影响北大核心CSCD

目的探讨靶向沉默生长抑制和DNA损伤诱导45蛋白α（Gadd45α）对皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞株A431侵袭和迁移的影响。方法采用实时荧光定量PCR、Western印迹检测A431和Colon16细胞Gadd45α基因和蛋白的表达,选取高表达Gadd45α的A431细胞株作为研究对象。将A431细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染Gadd45α-siRNA-1,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测干预后Gadd45αmRNA和蛋白的表达,Transwell小室法及细胞划痕法检测干预对A431细胞株侵袭及迁移能力的影响。结果A431细胞高表达Gadd45α基因和蛋白。干预后实验组A431细胞Gadd45αmRNA及蛋白相对表达量分别为0．286±0．013、0．33±0．007,明显低于阴性对照组组（1．028±0．183、0．87±0．002）以及空白对照组（1．001±0．057、0．86±0．004）,差异均有统计学意义（F值分别为5893．857、2763．000,均P〈0．001）。实验组A431细胞株穿过聚碳酸酯膜的细胞数为66．33±3．79,明显多于阴性对照组（26．00±4．36）和空白对照组（28．33±4．16）,3组间差异有统计学意义（F=20．084,P=0．002）。划痕实验中,实验组每高倍视野下细胞迁移数为315．33±6．66,明显多于阴性对照组（154．67±2．08）和空白对照组（130．67±3．51）,3组间差异有统计学意义（F=1676．255,P〈0．001）。结论A431细胞株高表达Gadd45α,靶向沉默Gadd45α表达能增强A431细胞株的侵袭和迁移能力。     

角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸(KGFR ASODN)对角质形成细胞生长因子(KGF)促HaCaT细胞增殖效应的抑制作用。方法 HaCaT细胞体外培养,采用绘制生长曲线、MTT实验、集落形成实验研究KGFR ASODN对KGF促增殖效应的抑制作用。采用流式细胞仪研究KGFR ASODN对KGFR表达的影响。结果 反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞的生长速度(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制KGF介导的HaCaT细胞增殖(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2都可抑制KGF诱导的HaCaT细胞集落形成(P<0.05)。HaCaT细胞存在KGFR基础表达,高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞KGFR表达(P<0.05),抑制率呈浓度依赖性,正义序列核苷酸(S-ODN)对KGFR表达无抑制作用(P>0.05)。结论 KGFR ASODN可有效抑制KGFR表达,进而抑制KGF介导的HaCaT细胞过度增殖。     

微小RNA-373表达下调对皮肤鳞状细胞癌A431细胞周期和凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨微小RNA-373（miR-373）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）A431细胞周期和凋亡的影响。方法 将对数生长期A431细胞分为3组,miR-373抑制剂组和阴性对照组分别转染miR-373抑制剂和阴性对照miRNA,未处理组不做任何处理。转染后48 h,采用实时PCR检测各组miR-373的表达水平;采用CCK-8试剂分析miR-373表达下调对A431细胞增殖的影响,流式细胞仪检测不同处理组A431细胞周期分布和凋亡的变化,最后采用比色法检测各组胱天蛋白酶3（caspase-3）活性的变化。两组之间数据比较采用t检验,3组及以上采用单因素方差分析,两两组间比较采用LSD-t检验。结果 miR-373抑制剂组miR-373表达水平为0.120 ± 0.036,显著低于未处理组（1.002 ± 0.022）和阴性对照组（1.037 ± 0.028）,t值分别为36.21、34.83,均P < 0.001。miR-373抑制剂组在48、72和96 h细胞增殖活性均显著低于未处理组和阴性对照组,F值分别为10.805、13.720和30.907,P值分别为0.038、0.010和0.001）。miR-373抑制剂组G0/G1期比例为64.69% ± 1.18%,显著高于未处理组（52.74% ± 0.66%）和阴性对照组（53.80% ± 0.80%）,t值分别为15.51和13.24,均P < 0.001;总凋亡细胞比例为22.69% ± 1.24%,显著高于未处理组（9.62% ± 1.14%）和阴性对照组（9.66% ± 0.97%）,均P < 0.001;caspase-3活性为1.238 ± 0.057,显著高于未处理组（0.413 ± 0.028）和阴性对照组（0.437 ± 0.036）（均P < 0.001）。结论 miR-373可能在皮肤鳞癌细胞周期调控和凋亡诱导中发挥重要作用。     

lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭

【摘要】 目的 研究长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1（lncRNA DLX6-AS1）对皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭的影响及潜在机制。方法 以双荧光素酶报告系统实验验证lncRNA DLX6-AS1与miR-16-5p、miR-16-5p与核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1（NUCKS1）mRNA的靶向结合。通过单独或联合转染lncRNA DLX6-AS1抑制物（si-DLX6-AS1）、miR-16-5p抑制物（anti-miR-16-5p）、NUCKS1抑制物（si-NUCKS1）和相应对照（DLX6-AS1-NC、anti-miR-NC、NUCKS1-NC）调控A431细胞目的基因的表达，采用qRT-PCR 检测A431细胞lncRNA DLX6-AS1、miR-16-5p、NUCKS1 mRNA的表达；Western印迹检测NUCKS1、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9蛋白水平；CCK8实验检测细胞存活率；Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。两组间比较采用独立样本t检验。结果 双荧光素酶报告系统实验显示，lncRNA DLX6-AS1靶向结合miR-16-5p，miR-16-5p靶向结合NUCKS1。si-DLX6-AS1组A431细胞miR-16-5p表达水平（3.01 ± 0.31）高于DLX6-AS1-NC组（1.02 ± 0.10，t = 18.33，P < 0.001）；NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05）。si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1后，anti-miR-16-5p组A431细胞miR-16-5p表达（0.34 ± 0.04）低于anti-miR-NC组（1.00 ± 0.12，t = 15.65，P < 0.05），Cyclin D1、MMP2和MMP9相对表达水平均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1、敲减miR-16-5p后，si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05）。结论 lncRNA DLX6-AS1可通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控A431细胞增殖、迁移和侵袭，lncRNA DLX6-AS1可能是治疗皮肤鳞状细胞癌的潜在分子靶点。     

抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响

目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组（阴性对照shRNA转染）,空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P < 0.01）。流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%,均P < 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）,而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）。Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14,差异有统计学意义（F = 794.50,P < 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。     

姜黄挥发油联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的 探讨姜黄挥发油（TVO）联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）A431细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法 取对数生长期A431细胞,用5、10、20、40、80 mg/L TVO处理,对照组用含有1％二甲基亚砜（DMSO）的DMEM高糖培养基处理,24 h后,CCK8法检测细胞增殖情况。另取部分A431细胞,分为4组,分别用含1％ DMSO的DMEM高糖培养基（对照组）、40 mg/L TVO（TVO组）、10 mg/L顺铂（顺铂组）、40 mg/L TVO和10 mg/L顺铂（TVO + 顺铂组）处理24 h后,利用CCK8法检测细胞增殖活性;倒置显微镜观察细胞形态变化;吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）双染色荧光显微镜观察细胞凋亡情况;比色法检测Caspase?3、Caspase?9酶活性;Western印迹检测Caspase?3、P糖蛋白表达。结果 5、10、20、40、80 mg/L TVO作用A431细胞24 h,对细胞增殖抑制率分别是（12.83 ± 6.4）%、（16.27 ± 11.4）%、（21.61 ± 9.1）%、（33.11 ± 2.0）%和（46.00 ± 3.3）%,与对照组（4.03 ± 1.4）%比较差异均有统计学意义（P < 0.05）;24 h时抑制50%细胞增殖的TVO浓度为（61.66 ± 1.03） mg/L;TVO组、顺铂组及TVO + 顺铂组细胞增殖抑制率显著上升,与对照组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）,联合用药有协同作用,联合指数（CI）为1.366（P < 0.05）。TVO组、顺铂组细胞均不同程度变圆并出现凋亡,TVO + 顺铂组细胞明显减少,出现大量细胞碎片。TVO组、顺铂组及TVO + 顺铂组细胞Caspase?3酶活性分别是1.117 ± 0.095、1.381 ± 0.089、1.520 ± 0.115,Caspase?9酶活性分别是1.259 ± 0.059、1.829 ± 0.171、2.760 ± 0.297,Caspase?3蛋白表达量分别是1.156 ± 0.006、1.296 ± 0.021、1.482 ± 0.016,P糖蛋白表达量分别是1.311 ± 0.011、1.169 ± 0.012、0.528 ± 0.014,其中TVO + 顺铂组细胞Caspase?3、Caspase?9酶活性及Caspase?3蛋白表达量显著高于TVO组和顺铂组,P糖蛋白表达量显著低于TVO组和顺铂组,差异均有统计学意义（P < 0.01）。结论 姜黄挥发油与顺铂联用可协同抑制人皮肤鳞癌A431细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与活化Caspase系统并降低P糖蛋白表达相关。     

西罗莫司和饥饿处理对人A431细胞自噬水平的影响

目的 探讨经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿处理对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431自噬水平的影响。方法 分别将A431细胞和人宫颈癌细胞系HeLa分为对照组（单纯DMEM培养基处理）、二甲基亚砜（DMSO）组、20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、平衡盐溶液（EBSS）组。作用4 h后,Western印迹检测A431细胞和HeLa细胞自噬微管相关蛋白轻链3A/3B（LC3A/B）、重组人γ?氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）的表达水平。吖啶橙染色分析细胞自噬体表达水平。结果 Western印迹检测显示,对照组与DMSO组A431细胞中LC3A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值差异无统计学意义（P > 0.05）;20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、EBSS组LC3 A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值较对照组均明显升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）。HeLa细胞Western印迹检测结果与A431细胞类似。双变量相关性分析显示,HeLa细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达呈正相关（r = 0.869,95% CI：0.807 ~ 0.999,P = 0.051）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.742,95% CI：-0.982 ~ 0.406,P = 0.042）;A431细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达亦呈正相关（r = 0.837,95% CI：-0.173 ~ 0.989,P = 0.037）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.684,95% CI：-0.977 ~ 0.500,P = 0.047）。吖啶橙染色显示,A431细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（23.750% ± 0.260%）与EBSS组（32.450% ± 0.488%）同样高于对照组（15.987% ± 0.242%,均P < 0.05）;HeLa细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（33.307% ± 0.715%）和EBSS组（66.097% ± 1.141%）高于对照组（14.117% ± 0.295%,均P < 0.05）。结论 经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿能够上调A431细胞的自噬水平, GABARAP蛋白可能与LC3A/B高度相关。     

siRNA干扰水通道蛋白3和磷脂酶D2表达对A431细胞株生长和凋亡的影响

目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）在人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖和凋亡中的作用。 方法 针对AQP3和PLD2各设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞。用荧光定量PCR方法筛选出其中干扰效果最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA,Western印迹法检测转染后AQP3和PLD2蛋白的表达水平。将A431细胞分为5组：正常培养组（不加任何处理）,转染试剂组（加入转染试剂）,阴性对照组（转染阴性对照siRNA）,AQP3-siRNA组（转染AQP3-siRNA）,PLD2-siRNA组（转染PLD2-siRNA）。CCK8法检测AQP3和PLD2表达下调对A431细胞增殖的影响,膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞后,AQP3和PLD2的mRNA和蛋白表达均较阴性对照组明显下降。与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后A431细胞增殖在24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为24.10、11.00、9.54,均P < 0.01）;转染PLD2-siRNA后,A431细胞增殖同样在24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为30.47、7.02、8.73,均P < 0.01）。与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后,A431细胞凋亡在48 h和72 h均明显增加（t值分别为11.36、20.91,均P < 0.01）;转染PLD2-siRNA后,A431细胞凋亡在72 h明显增加（t值为4.86,P < 0.05）。 结论 siRNA下调AQP3或PLD2表达可抑制A431细胞增殖,诱导A431细胞凋亡。     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）沉默肾上腺髓质素（ADM）基因对黑素瘤细胞系A375增殖和凋亡的影响。方法 实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）检测干扰效果,并选出干扰效果最好的siRNA。用筛选出的最有效siRNA转染A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。免疫细胞化学法蛋白水平检测干扰效果;噻唑蓝法（MTT）分别测定沉默ADM基因 24、48 h后A375细胞增殖的变化;流式细胞仪（FCM）检测干扰ADM基因48 h后A375细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR显示ADM-siRNA-2干扰效果最好。免疫细胞化学结果显示转染ADM-siRNA-2后ADM蛋白的表达显著低于未转染组和阴性对照组。MTT结果显示,转染ADM-siRNA-2的细胞24、48 h吸光度A值为0.389 ± 0.0375,0.469 ± 0.0330,低于空白对照组 （ 0.574 ± 0.0733、0.685 ± 0.0154）和阴性对照组（0.548 ± 0.0376、0.676 ± 0.0374）,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。FCM检测显示转染ADM-siRNA-2组的细胞早期凋亡率为（20.200 ± 6.046）%,高于空白对照组（1.667 ± 0.340）%和阴性对照组（4.587 ± 1.294）%,差异有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。结论 siRNA沉默ADM基因对A375增殖有抑制作用;而对凋亡则有明显促进作用。     

lncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-612调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

【摘要】 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法 通过干扰皮肤鳞状细胞癌SCC13细胞LEF1-AS1的表达和过表达、抑制miR-612的表达，将SCC13细胞分为转染LEF1-AS1干扰序列、无义序列的干扰LEF1-AS1组、干扰对照组，转染miR-612过表达序列、无义序列的miR-612过表达组、过表达对照组，以及转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制序列的干扰抑制组，和转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制无义序列的干扰抑制对照组。采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达，CCK8法检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞的凋亡情况，Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力，Western印迹检测细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21）、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。用LncBase Predicted v.2 在线预测网站预测lncRNA LEF1-AS1与miR-612之间的互补序列，将互补/非互补序列用于构建荧光素酶报告基因质粒，分别与miR-612过表达及过表达对照基因共转染SCC13细胞，验证lncRNA LEF1-AS1与miR-612的结合能力。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 miR-612过表达组细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均低于过表达对照组（均P < 0.05），凋亡率高于过表达对照组（P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组、干扰对照组、干扰抑制组、干扰抑制对照组miR-612的相对表达差异有统计学意义（F = 150.78，P < 0.001），24、48、72 h时的增殖能力差异有统计学意义（均P < 0.05），凋亡率、迁移及侵袭细胞数差异均有统计学意义（均P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组细胞中miR-612表达、凋亡率高于干扰对照组，48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数低于干扰对照组（均P < 0.05），而干扰抑制组细胞中miR-612表达、细胞凋亡率低于干扰抑制对照组，48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数高于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。Western印迹显示，4组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P < 0.001），干扰LEF1-AS1组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰对照组，p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰对照组（均P < 0.05）；而干扰抑制组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰抑制对照组，p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。共转染互补序列后，miR-612过表达组细胞荧光活性低于过表达对照组（t = 21.19，P < 0.001）；而共转染非互补序列后，miR-612组细胞荧光活性与过表达对照组差异无统计学意义（t = 0.28，P = 0.78）。结论 lncRNA LEF1-AS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，机制与靶向miR-612相关。     

HPA-siRNA促进皮肤鳞癌A431细胞凋亡并抑制其增殖、侵袭和迁移的机制

目的探讨乙酰肝素酶(HPA)小干扰RNA(siRNA)对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其机制。方法将体外培养的A431细胞分为空白对照组(未转染)、阴性对照组(转染NC-siRNA)和HPA沉默组(转染HPA-siRNA),RT-PCR检测各组细胞中HPA mRNA的表达,MTT法、流式细胞仪和Transwell分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移;Western blot检测细胞中HPA蛋白和PI3K/AKT信号通路相关蛋白PCNA、MMP-2、Bcl-2、p-AKT和AKT的表达。结果与空白对照组相比,HPA沉默组细胞在2～3 d生长过程中的A值明显下降,侵袭和迁移细胞数均明显减少,HPA mRNA和HPA、PCNA、MMP-2、Bcl-2、p-AKT蛋白的表达水平均明显降低,细胞凋亡率明显升高(P0.05);而空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 HPA siRNA可抑制A431细胞增殖、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活化有关。     

安石榴苷对中波紫外线诱导HaCaT细胞光损伤的预防作用研究

目的 探讨安石榴苷对中波紫外线（UVB）诱导角质形成细胞损伤的保护机制。 方法 培养的HaCaT细胞分为空白对照组、安石榴苷组、UVB组、安石榴苷 + UVB组。噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力,Hoechst/碘化丙锭（PI）染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法测定金属基质蛋白酶1（MMP1）及其组织抑制因子1（TIMP1） mRNA表达水平,Western印迹检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白P38、JNK、ERK的磷酸化水平变化。 结果 MTT试验示,10 ～ 40 μmol/L安石榴苷对UVB诱导的HaCaT细胞损伤有较佳的预保护作用。UVB组HaCaT细胞强Hoechst和强PI双染细胞较空白对照组增多,安石榴苷 + UVB组较UVB组减少。流式细胞仪分析,UVB组凋亡细胞百分率（9.82% ± 0.11%）高于空白对照（1.24% ± 0.91%,P < 0.01）,而安石榴苷（10、20、40 μmol/L） + UVB组凋亡细胞百分率（分别为6.38% ± 0.14%、5.24% ± 0.17%、3.77% ± 0.11%）较UVB组低,差异有统计学意义（均P < 0.01）。UVB组MMP1 mRNA相对表达量（12.376 ± 0.602）高于空白对照组（1.007 ± 0.147,P < 0.01）,而TIMP1 mRNA相对表达量（0.103 ± 0.006）低于空白对照组（1.006 ± 0.139,P < 0.01）,安石榴苷组MMP1及TIMP1 mRNA与空白对照组比较,差异无统计学意义（均P > 0.05）。安石榴苷预处理的HaCaT细胞经30 mJ/cm2 UVB照射后MMP1 mRNA相对表达量较UVB组降低（均P < 0.01）,而TIMP1 mRNA较UVB组升高（均P < 0.01）。Western印迹示,经UVB照射后,HaCaT细胞p-ERK、p-JNK及p-p38表达升高（均P < 0.01）。安石榴苷组HaCaT细胞p-ERK、p-JNK及p-p38表达没有明显改变（P > 0.05）,而安石榴苷 + UVB组有不同程度下降（均P < 0.01）。 结论 安石榴苷对UVB引起HaCaT细胞损伤有一定的预防作用。     

载芬维A铵脂质体体外对恶性黑素瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的 探讨载芬维A铵脂质体（4-HPR-L）对A375及B16F10黑素瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 采用薄膜-超声分散法制备载4-HPR-L。体外分别培养A375及B16F10黑素瘤细胞,分为3组,空白对照组仅加入细胞和新鲜培养基,4-HPR组和4-HPR-L组分别加入同浓度4-HPR和4-HPR-L。细胞增殖抑制实验（CCK-8法）检测各组细胞增殖情况;Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过激光共聚焦显微镜观察4-HPR-L入胞情况。采用SPSS22.0软件进行统计分析,多组间数据比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果 4-HPR与4-HPR-L对A375和B16F10的增殖抑制作用均表现出浓度依赖,0.1、1、15、30、50、70 mg/L 4-HPR和4-HPR-L处理A375和B16F10细胞48 h后,4-HPR组A375细胞存活率分别为（94.3 ± 1.4）%、（91.7 ± 2.5）%、（84.4 ± 2.5%）、（78.8 ± 2.1）%、（59.0 ± 1.1）%、（42.8 ± 2.0）%,4-HPR-L组分别为（86.0 ± 0.2）%、（76.5 ± 0.6）%、（60.9 ± 1.5）%、（49.0 ± 0.5）%、（32.9 ± 0.2）%、（18.9 ± 0.5）%,同浓度两组间比较,t值分别为8.019、8.298、11.455、19.978、33.672、16.314,均P < 0.01;4-HPR组B16F10细胞存活率分别是（95.4 ± 1.9）%、（90.5 ± 2.6）%、（77.0 ± 0.8%）、（64.4 ± 3.5）%、（59.1 ± 2.9）%、（49.9 ± 1.9）%,4-HPR-L组分别是（88.4 ± 2.0）%、（80.9 ± 3.4）%、（60.9 ± 2.2）%、（51.5 ± 2.9）%、（41.1 ± 1.2）%、（33.5 ± 2.4）%,同浓度两组间比较,均P < 0.05。相同浓度下,4-HPR同浓度组A375和B16F10细胞存活率均高于4-HPR-L组。Hoechst33258染色显示,对照组、4-HPR组细胞无明显变化,而4-HPR-L组细胞体积变小,细胞质浓缩,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。流式细胞仪检测显示,4-HPR-L组A375和B16F10细胞凋亡率均显著高于4-HPR组,均P < 0.01。细胞划痕实验显示,4-HPR-L较4-HPR能更好地抑制细胞移行,显著降低划痕的愈合程度。激光共聚焦显微镜观察显示,C6脂质体入胞迅速。结论 4-HPR-L能更好地进入A375细胞、B16F10细胞,且能有效抑制A375、B16F10细胞的增殖和迁移,并诱导其凋亡。     

氨基酮戊酸光动力疗法对鳞状细胞癌细胞株A431蛋白激酶D1及其磷酸化位点的影响

目的 研究氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞蛋白激酶D1（PKD1）的影响,探讨ALA-PDT诱导A431细胞凋亡的机制。方法 体外培养A431细胞,用CCK-8法检测筛选出抑制作用最强的ALA浓度和光动力照射（PDT）剂量组合。将对数期生长A431细胞随机分为不予任何干预的对照组、ALA组、PDT组及ALA-PDT组,观察4组细胞接受相应干预12、24、36、48 h后细胞增殖抑制率和增殖抑制作用最强时间点的凋亡率。反转录PCR检测ALA-PDT作用A431细胞不同时间点后各组PKD1基因mRNA的表达。Western 印迹法检测各组A431细胞中PKD1及其磷酸化位点Tyr463蛋白（pTyr463）、Ser916蛋白（pSer916）表达。结果 ALA浓度1.5 mmol/L、光照剂量2 J/cm2为最佳剂量组合。4组细胞干预12、24、36、48 h的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 39.56,P < 0.05）。孵育24 h时：ALA-PDT组细胞增殖抑制率（46.26% ± 1.25%）高于ALA组（14.65% ± 0.33%）、PDT组（14.96% ± 0.68%）和对照组（11.98% ± 0.32%）,差异有统计学意义（均P < 0.05 ）;ALA-PDT组细胞增殖抑制率高于12 h（P < 0.05）;4组细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 16.32,P < 0.05）,ALA-PDT组（41.92% ± 3.23%）高于对照组（4.67% ± 0.88%）、ALA组（7.02% ± 1.52%）和PDT组（8.37% ± 0.59%）,均P < 0.05。ALA-PDT作用于A431细胞后0、6、12、24、36、48 h,细胞PKD1基因mRNA的相对表达量差异有统计学意义（F = 22.24,P < 0.05）,孵育24 h mRNA相对表达量低于0、6、12 h（均P < 0.05）,与36、48 h差异无统计学意义（均P > 0.05）。4组A431细胞中pSer916表达量差异无统计学意义（F = 1.53,P > 0.05）,PKD1和pTyr463表达量差异有统计学意义（F值为10.04、8.27,均P < 0.05）,ALA-PDT组PKD1、pTyr463的表达低于对照组、ALA组、PDT组（均P < 0.05）。结论 PKD1可能参与ALA-PDT疗法诱导A431细胞凋亡的光化学反应进程,且可能是通过Tyr463位点活化促进癌变的发展。     

组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究

目的 探究组织蛋白酶D（CatD）对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物（AGE）的调控作用。方法 分别以CatB + CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂（pepstatin A）、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性。CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8 h,而对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS）。孵育8 h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度。以不同浓度pepstatin A（37.5、75、150 μmol/L）或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率。慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性。分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率。结果 1 μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatin A组及1 μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90%以上,与对照组（100%）差异无统计学意义（F = 1.525,P > 0.05）。去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me + AGE-BSA组和MG-132 + AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度（275.00 ± 10.15、259.00 ± 11.14）均较其相应8 h点荧光强度（295.00 ± 6.56、285.67 ± 8.74）显著下降（配对t值分别为4.778、6.154,均P < 0.05）,而pepstatin A + AGE-BSA组8 h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义（均P > 0.05）。37.5、75和150 μmol/L pepstatin A组24 h内对吞入胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64% ± 1.27%、5.62% ± 0.47%和3.21% ± 0.73%,各组间差异有统计学意义（F = 45.876,P < 0.05）,且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低（P < 0.05）。荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80%以上。CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调（均P < 0.05）。CatD高表达慢病毒转染 + AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染 + AGE-BSA组（均P < 0.05）。结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。     

Fam114A1蛋白对黑素细胞生物学功能影响的初步研究

【摘要】 目的 初步探讨Fam114A1对黑素细胞生物学功能的影响。方法 以黑素瘤细胞A375为工具细胞株,通过慢病毒转染的方式构建稳定过表达和抑制Fam114A1蛋白的细胞株,即过表达组和表达抑制组,以转染空载慢病毒的A375细胞作为对照组。实时荧光定量PCR检测Fam114A1对黑素合成相关基因酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）、前黑素小体蛋白（PMEL）、小眼畸形相关转录因子（MITF）和多巴色素异构酶（DCT）mRNA表达的影响,Western印迹法检测TYR、MITF蛋白的表达,MTT法、Transwell迁移和黏附实验分别检测Fam114A1对A375细胞增殖活性、迁移细胞数及黏附能力的影响。统计分析采用单因素方差分析和Dunnett-t检验。结果 荧光显微镜观察慢病毒转染效率均在90%左右。与对照组A375细胞Fam114A1相对表达水平（0.850 ± 0.120）相比,过表达组显著升高（1.507 ± 0.170,t = 5.888,P = 0.001）,而表达抑制组显著降低（0.397 ± 0.120,t = 4.065,P = 0.007）,成功构建稳定过表达和抑制Fam114A1的A375细胞株。实时荧光定量PCR及Western印迹结果显示,表达抑制组TYR和MITF mRNA及蛋白表达均显著低于对照组（均P < 0.01）,而过表达组TYR和MITF mRNA及蛋白表达与对照组差异无统计学意义（均P > 0.05）。与对照组相比,表达抑制组细胞增殖活性和黏附能力显著增强（P = 0.009、0.001）,细胞迁移能力显著减弱（P = 0.005）,而过表达组仅细胞迁移能力显著增强（P = 0.021）。结论 Fam114A1可影响A375的增殖活性、迁移和黏附能力,且影响黑素合成相关蛋白TYR和MITF的表达,可能是一种参与调控黑素细胞生物学活性的功能蛋白。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。