抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法 通过反转录（RT）？PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK？MEL？1、Hs？695T和MDA？MB？435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（＋）？Flag？DKK3 质粒（实验组）和pcDNA3.1（＋）？Flag？Vector 质粒（对照组），RT？PCR 验证 DKK3 的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析 DKK3 对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析 DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果 DKK3 mRNA 在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK？MEL？1和Hs？695T细胞系表达缺失，MDA？MB？435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比 （100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22% ± 3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P 〈 0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38% ± 2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68% ± 3.92%，P 〈 0.001），细胞凋亡率明显升高（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和 活化的Caspase？3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P 〈 0.001）。结论 DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。     

核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

【摘要】 目的 研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达,及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过 qRT-PCR分析 E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达,免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞,通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均P < 0.001）。qRT-PCR显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09,t = 3.22,P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均P < 0.001）,而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均P < 0.001）。相关性分析显示,恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：r = -0.56,Western印迹：r = -0.63,均P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后,E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（t = 3.38、2.76,P < 0.001）。CCK-8实验显示,继续培养后48 h,E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（t = 4.58,P < 0.01）;软琼脂平板实验显示,E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（t = 2.26,P＜0.001）;迁移实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22,t = 3.14,P < 0.01）;侵袭实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31,t = 2.12,P < 0.01）;3D细胞培养实验显示,E2F6抑制组细胞形态发生明显变化,侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示,E2F6抑制组G0 - G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均P < 0.001）。Western印迹显示,E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（P < 0.001）,P21蛋白水平高于对照组（P＜0.001）;E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（P < 0.001）,而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（P < 0.001）。结论 核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达,敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ，应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系，构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组，经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力，采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力，采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示，相对于癌旁组织，ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825，P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示，shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073，shCtrl组为1.000 ± 0.244，两组比较，t = 9.461，P < 0.001，蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115，t = 8.595，P = 0.002， 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示，shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%，t = 6.464，P = 0.003），且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组划痕愈合减慢，划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%，t = 5.835，P = 0.004）至24 h明显降低，通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139，t = 12.411，P < 0.001）。Western印迹显示，shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响

目的：探讨慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物,构建慢病毒载体,转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒,利用慢病毒感染A?375细胞系并通过嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染细胞系,实验分为实验组细胞（A375?shRNA1和A375?shRNA2）、阴性对照组细胞（A375?con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT?PCR）、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况;侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后,经嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染实验组A375?shRNA2细胞系及对照组A375?con。反转录PCR及Western印迹检测,干扰后实验组A375?shRNA2较对照组A375?con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示,A375?con与A375细胞生长差异无统计学意义（P>0.05）,A375?shRNA2细胞生长明显减慢,与A375和A375?con比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。划痕实验结果显示,A375?shRNA2划痕处细胞无明显迁移,划痕未得到修复,而A375及A375?con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示,A375组与A375?con组穿过的细胞数差异无统计学意义（P>0.05）;而A375?shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375?con组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调,并抑制细胞的生长,降低细胞的侵袭以及运动能力。     

抗原处理相关转运体和MHC-Ⅰ类分子在黑素瘤细胞株的表达

目的 检测抗原处理相关转运体（TAP）及主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子在恶性黑素瘤细胞系中的表达。方法 采用Western印迹法、RT-PCR和流式细胞仪分别检测TAP蛋白、mRNA和MHC-Ⅰ类分子在3株恶性黑素瘤细胞系（A375、A875、KZ28）中的表达,并与正常黑素细胞做对照。结果 与正常黑素细胞相比,TAP mRNA表达在A375、A875、KZ28细胞系中均显著降低,t值分别为5.89,4.45和4.57,P值均 < 0.01;TAP 蛋白的表达均明显降低,t值分别为5.46,4.32和4.67,P值均 < 0.01。在A375细胞中TAP mRNA和蛋白下降最显著。MHC-Ⅰ类分子也具有相同的趋势,t值分别为6.16,5.22和5.61,P值均 < 0.01。结论 TAP蛋白及其mRNA在A375、A875、KZ28细胞系中表达显著降低,可能为恶性黑素瘤细胞逃逸机体免疫监视的一条途径。     

核蛋白14对黑素瘤新生血管形成的影响及机制研究

目的 分析核蛋白14 （NOP14）对黑素瘤血管形成的影响。方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织,免疫组化检测NOP14和CD31［以微血管密度（MVD）表示］的表达。将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组,分别转染空载体（空载体组）、NOP14过表达载体（NOP14组）、靶向NOP14的siRNA（siNOP14组）和阴性对照siRNA（siNC组）。荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达,Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达。利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型,利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力。采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系,多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异,其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验。结果 NOP14高表达组（20例）黑素瘤组织MVD为44 ± 13,中表达组（17例）为58 ± 16,低表达组（3例）为62 ± 11,且NOP14表达和MVD呈负相关（r = -0.525,P = 0.017）。与空载体组相比,NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低（P < 0.05）。与siNC组相比,siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高（P < 0.05）。在A375与HUVEC共培养模型中,与空载体共组相比,NOP14组HUVEC的增殖活性（F = 131.85,P < 0.05）和迁移细胞数［22 ± 5比63 ± 8,t = 7.07,P = 0.002）、侵袭细胞数（14 ± 5比45 ± 10,t = 4.94,P = 0.008）及分支节点数（8 ± 2比14 ± 3,t = 5.06,P < 0.001）均显著下降;与siNC组相比,siNOP14组HUVEC的增殖活性（F = 79.92,P < 0.01）和迁移细胞数（152 ± 30比59 ± 4,t = 5.36,P = 0.006）、侵袭细胞数（134 ± 21比50 ± 8,t = 6.40,P < 0.001）及分支节点数（27 ± 3比15 ± 4,t = 6.10,P < 0.001）显著升高。在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中,各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致。结论 黑素瘤组织中 NOP14表达和MVD呈负相关,NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用。     

过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

目的：探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375?RhoD组和A375?增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组，分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架，Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞周期，Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375?EGFP组细胞相比，A375?RhoD组细胞体积增大，应力纤维变细，软弱无力，黏着斑增多；丝状伪足形成增加；皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67±11.23和72.67±5.03，两组间差异有统计学意义（t =11.25，P <0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33±12.34和9.00±1，两组间差异有统计学意义（t=9.70，P<0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。Western印迹结果显示，A375?RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2，促进其表达，而A375?EGFP组未能激活，两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。     

泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤组织和细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

目的：探讨泛素连接酶Cbl?b在皮肤黑素瘤组织及黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣组织,采用免疫组化法检测Cbl?b蛋白表达水平。实时荧光定量PCR、免疫印迹法分别检测黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中Cbl?b mRNA及蛋白表达水平。结果69份皮肤黑素瘤标本中,52份（75.36%）表达Cbl?b;30份色素痣标本中,4份（13.33%）表达Cbl?b,两组Cbl?b蛋白表达水平差异有统计学意义（χ2=32.745,P<0.01）。黑素瘤组织中Cbl?b表达水平与肿瘤进展程度、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关（rs分别为0.569、0.654、0.727,均P<0.01）。实时荧光定量PCR显示,A375、M14、MV3细胞Cbl?b mRNA表达差异有统计学意义（F=176.537,P<0.01）。免疫印迹法显示,A375细胞Cbl?b蛋白表达水平最高,黑素细胞最低。结论 Cbl?b蛋白在皮肤黑素瘤组织及其细胞株中均高表达。     

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7(CXCR7)基因与蛋白表达的影响.方法 体外培养黑素瘤A375细胞,经1、2、4mg/L丹参酮ⅡA处理48 h后,细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平.结果 1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后,Transwell细胞体外侵袭实验显示,每高倍(×200)视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61,而细胞划痕实验显示,细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00,均显著低于对照组(105.33±6.51、332.00±6.24,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).实时荧光定量PCR及Western印迹显示,1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01,蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055,均显著低于对照组(1.00±0.02、0.9000±0.010,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力.     

长链非编码RNA 068在黑素瘤细胞迁移中的功能研究

目的:探索长链非编码RNA（lncRNA）068对黑素瘤细胞系A375迁移的影响及潜在机制。方法:2015年12月至2020年11月在南通大学附属医院皮肤科门诊收集经病理确诊的皮肤黑素瘤患者21例,采用定量PCR（qPCR）检测其黑素瘤组织与相邻癌旁组织中lncRNA 068的表达。通过慢病毒转染在A375细胞中过表达...     

内皮素受体B在黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应

目的 研究内皮素受体B（ETR－B）在人恶性黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应。方法 采用免疫组化SP法检测ETR－B在黑素瘤组织中的表达，用RT-PCR法检测ETR－B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK－mel－1中的表达，用MTT比色法检测不同浓度内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促增殖活性。结果 ETR-B在41例恶性黑素瘤和23例色素痣中的阳性率分别为78.05%和8.69%，两组间差异有统计学意义，P < 0.05。15例原位和26例Ⅰ ~ Ⅳ期恶性黑素瘤ETR-B阳性表达率分别为53.33%和92.31%，两组比较，P < 0.05。13例转移性恶性黑素瘤（Ⅲ ~ Ⅳ期）中ETR-B阳性表达率100%，28例未转移者（0 ~ Ⅱ期）的阳性表达率为67.86%，两组比较，P < 0.05。ETR－B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK－mel－1中均有表达；内皮素3对黑素瘤细胞A375在体外具有很强的促增殖作用，且促增殖能力呈内皮素3浓度依赖性。结论 内皮素3/ETR－B在促黑素瘤细胞生长中有重要作用     

miRNA211在人皮肤黑素瘤的表达及功能研究

目的 探讨miRNA211（miR?211）在恶性黑素瘤进展过程中的表达以及靶分子MMP?16与miR?211表达的相关关系。方法 实验分阴性对照组、空载体对照组、miR?211过表达组。TaqMan荧光定量PCR检测miR?211在黑素细胞、黑素瘤细胞的表达,以及在痣、黑素瘤组织中的表达。SRB试验和流式细胞仪分别检测细胞增殖和细胞周期分布。甲基纤维素克隆形成试验和Transwell迁移试验研究细胞克隆形成和细胞迁移。用集落大小衡量克隆形成力,而同一迁移距离下的相对细胞数用来衡量细胞迁移能力。TaqMan荧光定量PCR检测比较miR?211表达增加前后MMP?16 mRNA表达的变化。结果 miR?211在黑素瘤细胞G361、C32和A375表达量分别是0.09 ± 0.02,0.000 52 ± 0.000 20,0.000 03 ± 0.000 01（F = 10410,P < 0.01）。miR?211在黑素瘤标本的表达量（0.17 ± 0.03）显著低于痣的表达量（0.87 ± 0.08）,t = 9.118,P < 0.01。在体外,miR?211表达上调的黑素瘤细胞miR?211过表达组与阴性对照组及空载体对照组比较,细胞增殖与细胞周期分布,差异无统计学意义。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.05、0.85 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 2.19,P < 0.05）。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.06、0.82 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 3.15,P < 0.05）。而空载体对照组与阴性对照组比较,差异无统计学意义。转染miR?211 mimics后24 h,在miR?211过表达组和空载体对照组的MMP?16 mRNA水平比较分别是0.33 ± 0.02和0.91 ± 0.03,两组比较,t = 11.30,P < 0.01;48 h分别是0.52 ± 0.01和0.96 ± 0.02,两组比较,t = 5.02,P < 0.05;72 h分别是0.71 ± 0.01和0.97 ± 0.03,两组比较,t = 3.85,P < 0.05。空载体对照组与阴性对照组在3个时间点的比较,差异均无统计学意义。结论 miR?211在恶性黑素瘤的细胞水平和组织水平低表达。miR?211抑制黑素瘤细胞的锚着非依赖性生长及细胞的迁移。miR?211表达上调后,MMP?16 mRNA表达下调,可能是miR?211下游的靶分子从而影响黑素瘤的侵袭转移。     

活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶表达与黑素瘤侵袭转移、预后的相关性分析

目的 探讨活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶（AID）与黑素瘤侵袭转移、预后的关系和临床意义。方法 免疫组化SP法检测AID蛋白在80例黑素瘤、23例色素痣石蜡包埋组织切片中的表达,结合临床病理生物特性进行分析。 结果 黑素瘤AID蛋白的阳性表达率53.75%（43/80）,色素痣的表达率13.04%（3/23）,差异有统计学意义（P < 0.05）。AID蛋白的表达与黑素瘤淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后密切相关（P < 0.05）,在年龄、性别、民族之间差异无统计学意义（均P ＞ 0.05）。19例发生BRAF突变黑素瘤组织中,AID蛋白17例阳性表达,其中15例BRAFV600E突变的黑素瘤AID蛋白均阳性表达。 结论 AID蛋白可能诱导了黑素瘤BRAF突变,并参与黑素瘤的侵袭、转移,与预后相关。     

let-7a微小RNA在黑素瘤中的表达及其对A375细胞增殖的影响

目的 探讨甲醛固定石蜡包埋的黑素瘤组织中let-7a微小RNA（microRNA）的表达情况及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响。方法 选取黑素瘤蜡块13份,先天性色素痣蜡块10份,抽提microRNA,采用茎环引物逆转录为cDNA,然后采用Taqman MGB探针,相应的引物,进行实时荧光定量PCR。继而采用cy3标记的siRNA阴性对照物转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率,最后将let-7a的模拟物转染入A375细胞,MTT实验检测转染后细胞增殖的变化。结果 从石蜡包埋组织中成功抽提出microRNA,而且定量PCR结果显示let-7a在黑素瘤中的表达明显低于色素痣组织（t = 2.364,Ｐ < 0.05）。荧光显微镜下观察siRNA转染效率约80% ~ 90%,hsa-let-7a转染A375细胞后,使其增殖受抑,转染后24 h抑制率达32.7%。结论 let-7a在黑素瘤中表达下降,过表达let-7a可使A375细胞增殖受到抑制,提示其在黑素瘤中可能起抑癌基因样作用。     

5-羟甲基胞嘧啶表达与黑素瘤侵袭、转移、预后的相关性分析

目的 检测5-羟甲基胞嘧啶（5?hmc）在黑素瘤组织中的表达水平,分析5?hmc与黑素瘤侵袭、转移、预后的相关性。方法 采用免疫组化SP法检测5?hmc在67例黑素瘤、20例色素痣组织标本中的表达,采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素回归分析5?hmc表达与黑素瘤患者预后的相关关系。结果 黑素瘤中5?hmc表达阳性率为40.30%（27/67）,色素痣为75%（15/20）,两组间差异有统计学意义（χ2 = 7.428,P = 0.006）。美国癌症联合会临床分期Ⅳ期黑素瘤中5?hmc表达水平明显低于Ⅱ、Ⅲ期黑素瘤（χ2 = 4.416,P = 0.036）,淋巴结转移患者5?hmc表达水平明显低于无淋巴结转移患者（χ2 = 5.902,P = 0.015）,且5?hmc表达水平随黑素瘤组织Clark分级升高而降低（χ2 = 4.828,P = 0.028）。5?hmc表达水平在不同年龄、性别、民族黑素瘤患者之间分布差异无统计学意义（P > 0.05）。Cox回归模型多因素分析显示,存在远处淋巴结转移（风险比：2.67,95% CI：1.22 ~ 5.84）、未手术切除（风险比：0.41,95% CI：0.18 ~ 0.95）、5?hmc低水平表达（风险比：3.54,95% CI：1.09 ~ 11.43）为预后不良的独立影响因素。结论 5?hmc可能参与黑素瘤侵袭转移,与黑素瘤预后相关。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

阿扎胞苷对黑素瘤A375细胞HOXA9基因表达及生物学行为的影响

【摘要】 目的 研究甲基转移酶抑制剂阿扎胞苷（5-azaC）对黑素瘤A375细胞中同源框A9（HOXA9）基因表达及细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 1、5、10、20 μmol/L 5-azaC分别作用于体外培养的A375细胞，以未经药物干预的常规培养A375细胞作为对照组，甲基化特异性PCR检测不同浓度5-azaC处理后HOXA9基因启动子区甲基化状态，筛选5-azaC最佳浓度进行后续实验。细胞计数试剂盒（CCK8）检测5-azaC对A375细胞增殖能力的影响，Transwell及细胞划痕实验分析5-azaC对A375细胞侵袭及迁移能力的影响，实时荧光定量PCR及Western印迹检测5-azaC作用后A375细胞中HOXA9 mRNA及蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本t检验。结果 对照组A375细胞中HOXA9基因启动子区表现为甲基化状态，经5-azaC处理后，A375细胞中HOXA9基因启动子区甲基化与非甲基化状态并存，且随5-azaC处理浓度的增加，HOXA9基因去甲基化程度越高，因此选择20 μmol/L 5-azaC浓度处理A375细胞72 h作为5-azaC处理组，用于后续实验。与对照组相比，5-azaC处理组A375细胞增殖能力显著降低（72.46% ± 2.19%比100%，t = 28.09，P < 0.001），侵袭细胞数量显著减少［（242.70 ± 29.19）个比（466.00 ± 22.65）个，t = 10.47，P < 0.001］，迁移能力减弱（27.56% ± 2.74% 比35.69% ± 2.50%，t = 3.79，P = 0.019），HOXA9 mRNA表达量升高（1.73 ± 0.28 比1.01 ± 0.15，t = 3.93，P = 0.017），HOXA9蛋白表达量增多（0.62 ± 0.03比0.50 ± 0.01，t = 3.82，P = 0.019）。结论 5-azaC能够降低黑素瘤细胞株A375的增殖、侵袭、迁移能力，且该过程可能机制之一是5-azaC反转HOXA9基因启动子区甲基化状态，激活基因表达，从而参与调控黑素瘤细胞生物学行为。