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实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌 总被引:2,自引:1,他引:1
目的 探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法.方法 根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqMan探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究.结果 该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10cfu/mL.反应体系具有很高的稳定性.结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值. 相似文献
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目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系(Y=-3.93×log(X)+37.34,R=0.999),最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义(P〉0.05,χ^2=0.27)。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。 相似文献
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目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。 相似文献
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目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。 相似文献
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目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3~5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。 相似文献
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目的建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌(HP)的方法。方法针对HP cagA基因设计特异性引物和探针,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。用该法对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠共1 201份标本进行检测,同时作常规细菌分离和测序分析。结果本方法特异性为100%,最低可检测2.2×101copies/μL的质粒DNA。标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X+38.633,相关系数(r)为0.999,扩增效率为100.648%。批内相对标准偏差(RSD)为0.19%~1.2%,批间RSD为0.14%~3.4%,RSD均<5%。上述1 201份标本用本法检出HP阳性130份,常规细菌分离法仅检出2份HP阳性。测序结果表明,与GenBank中收录的HP序列同源性为99%~100%。结论建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法特异性和灵敏度高,重复性良好,适用于HP感染的检测。 相似文献
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目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg~(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。 相似文献
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目的:建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y=-3.51 Log(X)+37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4%,95.8%和94%;检测结果重复性良好(CV%<5%)。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强(Kappa=0.88,P<0.05)。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。 相似文献
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目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008~2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100%.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测. 相似文献
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实时荧光定量PCR检测志贺氏菌方法的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 建立志贺氏菌实时荧光定量PCR快速方法,探讨在志贺氏菌感染检测和食源性污染监测中的应用价值.方法 根据志贺氏菌ipaH基因设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测志贺氏菌的诊断方法;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性,以验证方法的可行性.结果 成功构建了志贺氏菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异度,最低检测限为103 copies/ml,相当于100cfu/ml的菌细胞,并具有良好的稳定性和重复性.结论 利用实时荧光定量PCR方法检测志贺氏菌,可直接用于临床粪便中沙门氏菌的快速检测,也可用于分离菌株的鉴定,以及食品、乳品等的检测,对志贺氏菌感染诊断,提高食(乳)品安全的卫生监督检测具有重要的意义. 相似文献
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目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P<0.01),病毒平均含量为7.52±0.43 cop ies/m l;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0.01),但平均病毒含量与大三阳组无差异(P>0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。 相似文献
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RNA荧光定量标准品制备新方法的探讨 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 以丙型肝炎病毒(HCV)为例,介绍一种简便快速的RNA定量标准品的制备方法.方法 RT-PCR扩增目的片段,产物以pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品.结果RNA标准品具有较大的线性范围(10^9copies/ml~10 copies/ml),批内和批间重复性也较好,CV分别为1.68%~5.97%和6.40%~10.581%.结论 此法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用. 相似文献
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本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。 相似文献
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目的建立HTLV—I前病毒tax基因的荧光定量PCR检测方法。方法根据HTLV—Itax基因序列设计引物,将PCR克隆的tax片段链接入质粒载体,经筛选鉴定后,以含有目的片断的质粒为阳性模板建立实时荧光定量检测方法。结果扩增体系的敏感度可达10拷贝/反应。模板浓度在10^5~10^1拷贝/反应时,模板浓度与循环闽值(Q)之间相关性良好,相关系数r=-0,9987,且模板浓度相同的反应管之间具有良好的重复性和稳定性。结论SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV—I前病毒tax基因方法具有简便、快速和灵敏度高等优点,可能在疾病诊断、监测以及血液筛查中具有一定的应用前景。 相似文献
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本研究建立实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测白血病相关miRNA的方法,探讨此方法在定量检测miRNA中的应用价值。通过提取82例慢性淋巴细胞白血病(CLL)、70例急性白血病(AL)患者骨髓或外周血标本总RNA,以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释,分别作miRNA及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率;运用ABF7300定量PCR仪进行定量检测;采用SYBRGreen荧光染料法、以U6RNA作为内参照、循环阈值(ct)比较法进行miRNA表达相对定量分析,以检测CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181b及AL患者miR.128.1、miR-223、let-7b、miR-155、miR-181a的表达。方法学考核参数包括特异性、线性范围、精密度和重复性。结果表明:RQ—PCR检测miRNA仅需10—50ng总RNA样本,检测下限为0.05ng,miRNA及u6的Ct值均在15—30之间,10倍系列稀释法制作的标准曲线呈现良好的线性关系(R^2〉0.980),扩增效率均在0.9以上,溶解曲线均为单峰,PCR产物经琼脂糖电泳均显示较亮的目的条带,批内差和批间差分别小于4.8%和6.3%。结论:RQ-PCR技术检测白血病相关miRNA敏感、快速,高通量,节约成本,定量范围宽,极大的方便了对miRNA的定量研究。 相似文献
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目的 建立检测人广泛型线粒体肌酸激酶(ubiquitous mitochondrial creatine kinase,uMtCk)mRNA荧光定量的方法,并检测了结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中uMtCk基因表达的水平.方法 基于TaqMan荧光探针技术,以GAPDH作为内参,建立实时荧光定量RT-PCR方法,并检测了30名结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织 uMtCk mRNA的表达.结果 30例结直肠肿瘤患者肿瘤组织中有uMtCk mRNA的表达, 范围为7.4×105 ~5.3×108拷贝/μg RNA, 均值为(9.4±5.7)×106拷贝/μg RNA; 30例癌旁组织uMtCk表达为 4.5×103~6.9×105 拷贝/μg RNA, 均值为(8.6±3.4)×104拷贝/μg RNA.结论 成功地建立了人uMtCk基因表达含量的荧光定量检测方法,检测结果可用绝对拷贝数表示,定量准确可靠.且结直肠腺癌病人肿瘤组织uMtCk mRNA的含量是升高的,提示uMtCk mRNA含量的检测有助于结直肠腺癌病人临床诊断. 相似文献
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目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定,预防X连锁遗传病患儿的出生.方法 从孕早期、中期及晚期共80名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA,采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain-reaction,FQ-PCR)方法对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离的胎儿DNA(fDNA)进行定量分析,初步探讨游离fDNA在不同妊娠状态下的浓度变化,为尽早应用于临床提供科学依据.结果 早孕组28例血浆标本中有25例检测到SRY基因,其平均浓度为58.82 copies/ml,实测浓度范围为33.7~126.2 copies/ml;中孕组20例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为152.08 copies/ml,实测浓度范围为37.7~390.2 copies/ml;晚孕组32例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为212.34 copies/ml,实测浓度范围为87.90~493.56 copies/ml.组间两两比较,差异有统计学显著性意义(P<0.01).结论 用实时荧光定量PCR的方法最早在孕62 d的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因,随孕周的增加,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加.实时荧光定量PCR技术在进行无创性产前诊断中有重要的价值. 相似文献