荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌检测中的应用

空肠弯曲菌是引起人类食源性疾病的主要病原菌之一。快速、特异检测方法的建立对于该病原菌感染的诊断及鉴别诊断具有重要意义。荧光定量PCR方法作为一种快速诊断方法已经广泛应用于空肠弯曲菌的检测及鉴定。本文从荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌病原检测中的建立、发展以及应用等方面进行综述。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的 探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法.方法 根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqMan探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究.结果 该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10cfu/mL.反应体系具有很高的稳定性.结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值.     

志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究

目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系（Y=-3.93×log（X）＋37.34,R=0.999）,最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义（P〉0.05,χ^2=0.27）。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌

目的建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌(HP)的方法。方法针对HP cagA基因设计特异性引物和探针,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。用该法对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠共1 201份标本进行检测,同时作常规细菌分离和测序分析。结果本方法特异性为100%,最低可检测2.2×101copies/μL的质粒DNA。标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X+38.633,相关系数(r)为0.999,扩增效率为100.648%。批内相对标准偏差(RSD)为0.19%～1.2%,批间RSD为0.14%～3.4%,RSD均<5%。上述1 201份标本用本法检出HP阳性130份,常规细菌分离法仅检出2份HP阳性。测序结果表明,与GenBank中收录的HP序列同源性为99%～100%。结论建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法特异性和灵敏度高,重复性良好,适用于HP感染的检测。     

肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg~(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。     

实时荧光定量PCR检测人粪便中空肠弯曲杆菌方法的建立与评价

目的：建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y＝-3.51 Log（X）＋37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4％,95.8％和94％;检测结果重复性良好（CV％＜5％）。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强（Kappa＝0.88,P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。     

嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008～2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100％.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测.     

实时荧光定量PCR检测志贺氏菌方法的实验研究

目的 建立志贺氏菌实时荧光定量PCR快速方法,探讨在志贺氏菌感染检测和食源性污染监测中的应用价值.方法 根据志贺氏菌ipaH基因设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测志贺氏菌的诊断方法;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性,以验证方法的可行性.结果 成功构建了志贺氏菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异度,最低检测限为103 copies/ml,相当于100cfu/ml的菌细胞,并具有良好的稳定性和重复性.结论 利用实时荧光定量PCR方法检测志贺氏菌,可直接用于临床粪便中沙门氏菌的快速检测,也可用于分离菌株的鉴定,以及食品、乳品等的检测,对志贺氏菌感染诊断,提高食(乳)品安全的卫生监督检测具有重要的意义.     

乙型肝炎病毒核酸的实时荧光定量PCR检测及其临床意义

目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P<0.01),病毒平均含量为7.52±0.43 cop ies/m l;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0.01),但平均病毒含量与大三阳组无差异(P>0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。     

RNA荧光定量标准品制备新方法的探讨

目的 以丙型肝炎病毒（HCV）为例,介绍一种简便快速的RNA定量标准品的制备方法.方法 RT-PCR扩增目的片段,产物以pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品.结果RNA标准品具有较大的线性范围（10^9copies/ml～10 copies/ml）,批内和批间重复性也较好,CV分别为1.68%～5.97%和6.40%～10.581%.结论 此法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用.     

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。     

SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV-I前病毒tax基因方法的建立

目的建立HTLV—I前病毒tax基因的荧光定量PCR检测方法。方法根据HTLV—Itax基因序列设计引物，将PCR克隆的tax片段链接入质粒载体，经筛选鉴定后，以含有目的片断的质粒为阳性模板建立实时荧光定量检测方法。结果扩增体系的敏感度可达10拷贝／反应。模板浓度在10^5～10^1拷贝／反应时，模板浓度与循环闽值（Q）之间相关性良好，相关系数r=-0，9987，且模板浓度相同的反应管之间具有良好的重复性和稳定性。结论SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV—I前病毒tax基因方法具有简便、快速和灵敏度高等优点，可能在疾病诊断、监测以及血液筛查中具有一定的应用前景。     

实时定量PCR检测白血病相关miRNA方法的建立

本研究建立实时定量PCR（RQ-PCR）技术检测白血病相关miRNA的方法,探讨此方法在定量检测miRNA中的应用价值。通过提取82例慢性淋巴细胞白血病（CLL）、70例急性白血病（AL）患者骨髓或外周血标本总RNA,以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释,分别作miRNA及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率;运用ABF7300定量PCR仪进行定量检测;采用SYBRGreen荧光染料法、以U6RNA作为内参照、循环阈值（ct）比较法进行miRNA表达相对定量分析,以检测CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181b及AL患者miR．128．1、miR-223、let-7b、miR-155、miR-181a的表达。方法学考核参数包括特异性、线性范围、精密度和重复性。结果表明：RQ—PCR检测miRNA仅需10—50ng总RNA样本,检测下限为0．05ng,miRNA及u6的Ct值均在15—30之间,10倍系列稀释法制作的标准曲线呈现良好的线性关系（R^2〉0．980）,扩增效率均在0．9以上,溶解曲线均为单峰,PCR产物经琼脂糖电泳均显示较亮的目的条带,批内差和批间差分别小于4．8％和6．3％。结论：RQ-PCR技术检测白血病相关miRNA敏感、快速,高通量,节约成本,定量范围宽,极大的方便了对miRNA的定量研究。     

实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中广泛型线粒体肌酸激酶基因的表达

目的 建立检测人广泛型线粒体肌酸激酶(ubiquitous mitochondrial creatine kinase,uMtCk)mRNA荧光定量的方法,并检测了结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中uMtCk基因表达的水平.方法 基于TaqMan荧光探针技术,以GAPDH作为内参,建立实时荧光定量RT-PCR方法,并检测了30名结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织 uMtCk mRNA的表达.结果 30例结直肠肿瘤患者肿瘤组织中有uMtCk mRNA的表达, 范围为7.4×105 ～5.3×108拷贝/μg RNA, 均值为(9.4±5.7)×106拷贝/μg RNA; 30例癌旁组织uMtCk表达为 4.5×103～6.9×105 拷贝/μg RNA, 均值为(8.6±3.4)×104拷贝/μg RNA.结论 成功地建立了人uMtCk基因表达含量的荧光定量检测方法,检测结果可用绝对拷贝数表示,定量准确可靠.且结直肠腺癌病人肿瘤组织uMtCk mRNA的含量是升高的,提示uMtCk mRNA含量的检测有助于结直肠腺癌病人临床诊断.     

不同妊娠状态下母体循环中胎儿游离DNA—SRY基因的定量检测

目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定,预防X连锁遗传病患儿的出生.方法 从孕早期、中期及晚期共80名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA,采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain-reaction,FQ-PCR)方法对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离的胎儿DNA(fDNA)进行定量分析,初步探讨游离fDNA在不同妊娠状态下的浓度变化,为尽早应用于临床提供科学依据.结果 早孕组28例血浆标本中有25例检测到SRY基因,其平均浓度为58.82 copies/ml,实测浓度范围为33.7～126.2 copies/ml;中孕组20例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为152.08 copies/ml,实测浓度范围为37.7～390.2 copies/ml;晚孕组32例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为212.34 copies/ml,实测浓度范围为87.90～493.56 copies/ml.组间两两比较,差异有统计学显著性意义(P＜0.01).结论 用实时荧光定量PCR的方法最早在孕62 d的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因,随孕周的增加,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加.实时荧光定量PCR技术在进行无创性产前诊断中有重要的价值.