遗传性凝血因子Ⅺ缺陷的分子发病机制研究进展

凝血因子Ⅺ(FⅪ)是血浆丝氨酸蛋白酶活化的凝血因子Ⅺ(FⅪa)的酶原，后者在钙离子存在时，可以活化FⅪ，形成活化的凝血因子Ⅺ(FⅪa)。FⅪ由肝脏和巨核细胞所产生，人体内除血浆中存在有FⅪ外，血小板中也可能含有一部分FⅪ。     

一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XII缺陷症家系分析

目的：对一个复合杂合基因突变导致的遗传性凝血因子XII（FXII）缺陷症家系进行实验室表型和基因突变分析,寻找致病基因并初步探讨其分子发病机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代5人）血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子VIII促凝活性（FVIII:C）、凝血因子Ⅸ促凝活性（FIX:C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）、XII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原含量（FXII:Ag）等指标以明确诊断。采用PCR直接测序法分析先证者F12基因所有的外显子及其侧翼序列,对可疑的突变反向测序进行验证,并对家系成员的相应突变位点区域进行检测。采用ClustalX-2.1-win软件和4个在线生物信息工具（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）分析氨基酸突变位点的保守性和突变对蛋白质功能的可能影响;用Swiss-Pdb Viewer 4.0.1软件对突变位点进行蛋白模型相互作用分析。结果：先证者APTT为59.1 s,明显延长;FXII:C和FXII:Ag分别降低至4%和5%,其父亲、母亲、女儿的FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%。基因分析发现先证者F12基因第13号外显子存在复合杂合基因突变,即c.1561G＞A杂合错义突变（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C杂合错义突变（p.Met527Thr）;其父亲为p.Met527Thr携带者,母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者。保守性分析结果表明,Glu502和Met527在同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件对该两个突变的预测结果一致,均预示很可能是有害突变,可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,野生型Glu502与His365之间形成1条氢键,Glu502替换为Lys502导致氢键的消失;野生型Met527与Leu524之间形成1条氢键,Met527替换为Thr527导致Thr527-Leu524之间增加2条氢键。结论：该先证者F12基因第13号外显子上存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr复合杂合突变,推测该突变遗传自具有血缘关系且分别存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr杂合子的父母,并与该家系FXII水平降低有关。     

错义突变Gly400Val导致的凝血因子Ⅺ缺陷症

目的 检测一个中国汉族人凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷家系中的基因突变。方法 测定先证及家系成员凝血因子活性(FⅪ：C);抽取外周血单个核细胞中的基因组DNA,采用PCR扩增FⅪ基因所有外显子及其侧翼序列,直接测序;针对突变位点进行等位基因特异性PCR(ASPCR)扩增。结果 先证者部分凝血活酶时间(APTT)延长94．15s,FⅪ：C为正常的2．1％。家系成员杂合子的FⅪ：C均下降,为正常对照的27．0％～48．4％。先证者FⅪ基因外显子11第1296位苷酸G突变为T,导致其所编码的甘氨酸残基为缬氨酸残基替代((Gly400Val)。部分家系成员该位点呈杂合性改变。结论 Gly400Val为FⅪ缺陷的原因,杂合子的FⅪ水平可能由于显性负机制的存在而进一步降低。     

1例复合杂合突变导致遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的基因分析

目的 对一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析,初步探讨其分子致病机制.方法 检测先证者及其家系成员(3代6人)的血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)含量及内源性凝血途径因子(FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C、FⅫ:C)活性和FⅪ...     

两例遗传性凝血因子Ⅺ缺乏症患者的基因分析

目的对两例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的患者进行FⅪ基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法两例患者在常规凝血检查时发现活化部分凝血活酶时间(aPTT)明显延长,进行aPTT纠正试验和凝血因子活性检测,发现均为凝血因子Ⅺ活性(FⅪ:C)降低。收集患者外周血,分别提取DNA,使用聚合酶链式反应分别扩增两例患者FⅪ的所有外显子及其侧翼序列,并将扩增产物进行测序。测序结果应用Chromas软件与FⅪ正常序列(NG_008832.1)进行比对;有突变的片段进行反向测序并比对。结果病例1:aPTT 109.6 s,FⅪ:C 0.4%;病例2:aPTT 50.1 s,FⅪ:C6.7%;两例患者aPTT纠正试验和其余凝血因子活性均正常。FⅪ基因测序结果显示:病例1在Exon2上发生18 del A纯合缺失,导致移码突变(Val-13 Trpfs X15),该突变为新发现的突变点;病例2在Exon7上发生738 GA杂合突变、导致Trp228 stop,同时在Exon9上发生1021 GA杂合突变、导致Glu323 Lys。结论上述突变可能分别是导致两例患者FⅪ缺乏的分子致病机制。     

2个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的表型与基因型分析

  目的  对2个遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症家系进行表型诊断和基因突变分析,探讨其分子发病机制。  方法  对2014年11月及2018年1月潮州中心医院收治的2例遗传性凝血因子FⅪ缺陷症患者及家系进行分析。采用血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、FⅪ活性（FⅪ∶C）和FⅪ抗原（FⅪ∶Ag）等凝血指标进行表型诊断;对2个先证者FⅪ基因所有的外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。针对先证者的突变位点,分别对其家系成员进行相应的基因突变检测。应用逆转录PCR (RT-PCR)检测先证者-1 FⅪ mRNA的水平,分析突变对FⅪ mRNA剪切造成的影响。  结果  先证者-1男性,7岁。PT为10.7 s,APTT为 97.4 s（参考值9～12.8 s和24～40 s）,FⅪ∶C为0.6%,FⅪ∶Ag<1%（参考值65%～150%和72.1%～122.3%）;先证者-2女性,30岁。PT为11.7 s,APTT为71.3 s,FⅪ∶C为0.7%,FⅪ∶Ag<1%。2例先证者因子Ⅷ活性（FⅧ∶C）、因子Ⅸ活性（FⅨ∶C）和因子Ⅻ活性（FⅫ∶C）均在正常范围内。先证者-1基因测序发现FⅪ基因内含子4的3′端剪切受位存在c.326-1G>A剪接突变及10号外显子c.1107C>A（p.Tyr351X） 复合杂合突变;家系分析表明,先证者-1外婆、母亲及哥哥存在c.326-1G>A杂合剪接突变,奶奶及父亲存在c.1107C>A杂合无义突变。在先证者-1外周血中未能检测到FⅪ mRNA。先证者-2 FⅪ基因测序发现8号外显子存在c.841C>T（p.Gln263X）纯合无义突变;家系分析表明先证者-2父亲、母亲、女儿及儿子存在c.841C>T杂合突变。  结论  FⅪ基因c.326-1G>A剪接突变、p.Tyr351X和p.Gln263X是导致2个遗传性FⅪ缺陷症先证者FⅪ缺乏的原因。     

遗传性凝血因子X缺陷症两家系基因分析

目的:对两个遗传性凝血因子X缺陷症家系共8个成员F11基因进行分析,为评估突变基因的致病性和出血风险提供参考.方法:收集先证者及其家系成员的临床资料,检测家系成员的凝血功能、凝血因子XI活性(FXI:C),并对出血情况进行评分等.提取家系成员的DNA,对其F11基因第1?15外显子及其侧翼序列进行PCR扩增、纯化和测序...     

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI缺陷症家系分析

目的 寻找复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症患者家系的致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法 检测先证者及家系成员(共13人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FXI活性(FXI:C)及FXI抗原(FXI:Ag)等指标;提取基因组DNA,用Sanger测序法分析先证者F11基因的全部外显子和侧翼序列,发现突变位点后反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。ClustalX软件分析突变位点的保守性;用MutationTaster和PROXIEAN在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能的影响。用Swiss-PdbViewer软件构建突变蛋白模型。结果 先证者APTT明显延长,为85.9 s,其FXI:C和FXI:Ag均降低,分别为2%和4.8%;其母亲、二哥、二姐、侄子、外甥女和儿子FXI:C和FXI Ag也有不同程度下降。先证者F11基因第8外显子存在c.841C> T(p.Gln263stop)杂合突变及第10内含子3’端剪切位点突变(IVSJ-4del gttg);其母亲、二哥、侄子携带p.Gl...     

遗传性凝血因子缺陷症和抗凝血因子缺陷症研究

遗传性凝血因子缺陷症，包括低(无)纤维蛋白原血症、凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ(血友病A)、凝血因子Ⅸ(血友病B)、血管性血友病(vWD)、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅺ、凝血因子ⅩⅢ等缺陷症，它们引起遗传性出血病；遗传性抗凝血因子缺陷症，主要包括抗凝血酶(AT)、蛋白C(PC)和蛋白S(PS)等缺陷症，它们引起遗传性血栓病。罹患这些疾病的患者，不仅自幼发病、持续终生，而且还遗传给后代。     

遗传性凝血因子XIII缺陷症分子机制的研究

目的 研究两种遗传性凝血因子(FXIII)A基因的缺陷(FXIIIA Arg77→Cys,Ser413→Trp)以了解其致病的分子机制。方法 构建正常人FXIIIA重组表达质粒(wt-PCI／FXIIIA),通过定点突变获得上述2种突变的FXIIIA重组表达质粒(mut-PCI／FXIIIA),并分别将它们转染到COS7细胞表达,PCR、RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中人FXIIIA的DNA水平、RNA水平及其蛋白质的表达量。用脉冲追踪试验追踪人FXIIIA蛋白在细胞内的变化。通过生物素化戊胺的掺入检测细胞内、外人FXIIIA的活性。结果 wt-PCI／FXIIIA和mut-PCI／FXIIIA稳定转染的COS7细胞内FXIIIA在RNA水平表达量相同;而两种mut-PCI／FXIIIA转染的细胞内未检测到人FXIIIA蛋白质,且蛋白活性Ser413→Trp突变者仅为正常的8．7％,Arg77→Cys突变者则为0％。用脉冲追踪法显示正常FXIIIA蛋白质各时间点含量无减少,而两种突变的人FXIIIA在0．5h和1h虽存在,但很快消失。结论 两种FXIIIlA基因突变导致FXIIIA在细胞内不稳定,迅速被降解,从而FXIIIA蛋白量减少和活性丧失。     

一个遗传性蛋白C缺陷症家系表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法：对先证者及其家系成员（共3代6人）进行血浆蛋白C活性（PC:A）、蛋白C抗原（PC:Ag）含量及其他相关凝血指标检测。采用DNA直接测序法分析先证者蛋白C基因（PROC）9个外显子及侧翼序列,发现突变位点,再对其家系成员进行该位点的突变检测。用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的危害程度;用Swiss-PdbViewer软件和PIC程序进行蛋白模型分析。结果：先证者、其儿子和二姐的血浆PC:A与PC:Ag均平行下降,介于39%～58%。这3人的PROC基因第9外显子携带c.997G＞A杂合错义突变（p.Ala291Thr）。生物信息学软件分析提示：p.Ala291Thr为有害突变;Ala291在同源物种间不高度保守;蛋白模型分析显示：p.Ala291Thr突变导致Thr291与Pro327之间新增一氢键,改变了氨基酸的空间构型,使PC的稳定性下降。结论：该先证者PROC基因第9外显子存在c.997G＞A杂合错义突变,导致p.Ala291Thr;p.Ala291Thr为未报道过的新突变,是该家系遗传性PC缺陷症的主要原因。     

蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

目的：探讨蛋白C（PC）p.Ala333Thr突变导致遗传性蛋白C缺陷症（IPCD）的分子机制。方法：使用氨基酸多序列比对工具T-Coffee评估突变氨基酸位点的保守性,使用突变有害性评分工具PolyPhen-2预测突变对PC结构和功能的危害性。利用定点突变试剂盒QuickMutationTM构建PC基因（PROC ）野生型和p.Ala333Thr突变型质粒,并瞬时转染入HEK-293T细胞进行体外表达,RT-qPCR检测突变PC转录24 h后的mRNA水平变化,利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测突变PC胞内外水平变化,并对细胞内质网、高尔基体PC进行免疫荧光染色,初步探讨p.Ala333Thr突变导致IPCD的分子机制。结果：多序列比对结果显示PC的Ala333位点保守性不高,PolyPhen-2对PROC 的p.Ala333Thr突变评分为0.763。成功转染野生型与p.Ala333Thr突变型PROC 质粒后,突变型PROC 转录水平无明显变化;Western blot结果显示,突变型PROC的PC表达量明显下降;免疫荧光染色结果显示,野生型PC在内质网和高尔基体均有大量分布,而p.Ala333Thr突变型PC主要分布于内质网。结论：PROC p.Ala333Thr突变可能导致了PC的错误折叠和加工障碍,造成胞外PC表达量下降,最终引起了IPCD的发生。     

A novel mutation in a patient with congenital coagulation factor XII deficiency

Human coagulation factor Ⅻ （FⅫ）, also called Hageman factor, is a plasma plycoprotein that is functionally deficient in individuals with Hageman trait; which is an inherited trait discovered by chance during preoperative blood coagulation screening tests. FⅫ is a single-chain 596-amino-acid zymogen of a serine protease with an approximate molecular weight of 80 000 FⅫ appears to play an important role in blood coagulation,     

凝血因子XI基因变异致下消化道出血病因分析

目的：对1 例遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症患者行内镜下直肠息肉摘除术后出现下消化道异常出血进行病因分析,探讨FⅪ基因变异与治疗后下消化道出血的关系。方法：家系调查（共3 代5 人）。检测患者及其家系成员相关凝血指标。提取外周血基因组DNA进行PCR扩增,采用DNA直接测序法分析患者FⅪ基因的全部外显子、侧翼序列、5’和3’端非翻译区序列,及家系成员相应的变异位点区域。用PyMol软件构建基因变异前后蛋白模型。结果：患者因“直肠息肉摘除术后3 d,血便2 d”入院。凝血指标检查显示患者的活化部分凝血活酶时间（APTT）、FⅪ活性（FⅪ:C）和FⅪ抗原（FⅪ:Ag）分别为50.9 s、53%和47.2%;其父亲上述3 项指标分别为45.4 s、44%和43.1%。DNA测序发现患者及其父亲的FⅪ基因第8号外显子均存在c.841C＞T杂合无义变异（p.Gln281*）。蛋白模型分析显示p.Gln281*变异会产生截短蛋白。结论：该家系FⅪ基因第8号外显子c.841C＞T（NM_000128）杂合无义变异与其FⅪ水平减低有关,可能也是该患者行内镜下直肠息肉摘除术后出现下消化道异常出血的主要原因。     

一个先天性肾性尿崩症家系的基因分析

Background As an X-linked recessive way, arginine vasopressin receptor 2 （AVPR2） gene mutation resulted in ahereditary disease - congenital nephrogenic diabetes insipidus （CNDI）. We found a suspect clinical CNDI pedigree. Inorder to identify the genetic etiology, we performed the genetic analysis.     

一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行凝血指标和基因表型分析,初步探讨其分子发病机制。方法：在Stago仪器上检测家系各成员外周血的血浆AT活性（AT:A）、AT抗原（AT:Ag）等凝血指标;提取外周血DNA并测序,定位基因突变位点;利用生物信息学软件分析突变对蛋白功能的影响。结果：先证者及其外祖母、父亲、母亲和弟弟的AT:A均有不同程度降低,且AT:Ag同步下降,所有家系成员蛋白S活性（PS:A）和蛋白C活性（PC:A）指标均无明显异常,表现为I型AT缺陷症。基因分析显示：先证者SERPINC1 基因存在第1号外显子c.1A＞G杂合错义突变（p.Tyr2stop）以及第5号外显子c.1005G＞A杂合同义突变;其父亲携带c.1A＞G杂合错义突变,其外婆、母亲和弟弟携带c.1005G＞A杂合同义突变。保守性分析显示,Tyr2在同源物种间高度保守;MutationTaster、PolyPhen-2和LRT三个在线生物信息学软件分析均显示p.Tyr2stop突变为“致病的、有害的”;蛋白模型分析显示,p.Tyr2stop突变会引起AT基因翻译过程提前终止,产生截短蛋白。结论：该先证者及家系成员AT:A和AT:Ag不同程度降低与SERPINC1 基因上存在的c.1A＞G杂合错义突变和c.1005G＞A杂合同义突变有关。     

空卵泡综合征患者家系的LHCGR基因突变检测及系谱分析

目的 探究促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)基因突变与空卵泡综合征(EFS)的关系,指导相关生殖疾病的诊治。方法 通过基因测序对一例EFS的不孕症患者进行LHCGR基因突变和家系分析。结果 该患者LHCGR 基因第11 外显子处存在纯合突变:chr2:48915113A>G,c.1823T>C,p.Leu608Pro,突变使LHCGR 蛋白在第 608 位由亮氨酸(Leucine, Leu)突变为脯氨酸(Proline ,Pro)。对该患者进行家系分析并对其家庭成员测序发现,父母在此位点属于杂合突变,先证者弟弟(46,XY。未育)属于纯合突变,先证者妹妹(育有一女孩、一男孩)属于杂合突变。结论 LHCGR基因突变可导致EFS,进而导致相关生殖疾病的发生。     

遗传性对称性色素异常症家系中ADAR1基因的遗传分析

目的 研究一个遗传性对称性色素异常症家系的致病基因.方法 采用聚合酶链反应(PCR)后酶切测序的方法鉴定ADAR1基因是否存在变异.结果 在先证者及其2个患病的儿子中同时检测到了ADAR1基因在编码区发现变异C.1105insA杂合改变,导致其编码的蛋白提前终止T369fsX374.结论 ADAR 基因T369fsX变异导致了遗传性对称性色素异常症的发生.     

一个遗传性纤溶酶原缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性纤溶酶原（PLG）缺陷症家系进行表型和基因变异分析,探讨其发病的分子机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代4人）的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体（D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（FDP）、纤溶酶原活性（PLG:A）、纤溶酶原抗原（PLG:Ag）、抗凝血酶活性（AT:A）、蛋白C活性（PC:A）及蛋白S活性（PS:A）等指标以明确诊断。用DNA直接测序法分析先证者PLG基因的所有外显子及侧翼序列、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序予以证实。应用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析;利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster 4个在线生物信息学软件分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响;用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白质模型和氨基酸相互作用分析。结果：先证者和其祖父、父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右,PLG:Ag含量正常,结果分别为45%、95%,64%、94%和64%、104%;基因分析发现先证者PLG基因第15号外显子存在c.1858G＞A杂合错义突变导致p.Ala601Thr;其祖父和父亲具有同样的基因突变。Ala601在其11个同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件预测结果一致,均为有害突变,可引起相应疾病。结论：该先证者的PLG基因第15号外显子存在c.1858G＞A（p.Ala601Thr）杂合错义突变;祖孙三代均为Ala601Thr杂合子,突变符合孟德尔遗传规律,且与该家系PLG活性降低有关。