自噬对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 观察自噬对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法 采用不同浓度雷帕霉素诱导人宫颈癌HeLa细胞,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关基因LC3B以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。应用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌细胞自噬后,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。构建带有绿色荧光蛋白的LC3B质粒,转入HeLa细胞,通过G418药物筛选转染阳性细胞,荧光显微镜观察LC3B的细胞定位,Western blot检测LC3B表达。RTCA仪器实时检测野生型和LC3B过表达HeLa细胞的增殖能力,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。结果 雷帕霉素诱导后,宫颈癌HeLa细胞自噬水平增高,增殖和迁移能力有所下降;PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达改变(P＜0.05)。自噬抑制剂3-MA诱导HeLa细胞增殖和迁移水平下降(P＜0.05)。荧光显微镜和Western blot结果显示构建的LC3质粒成功转入Hela细胞中并且能够抑制宫颈癌细胞的增殖(P＜0.05)。结论 在一定范围内,随着自噬水平的升高,HeLa细胞增殖和迁移能力降低,可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。通过基因靶向扰乱自噬关键基因(如LC3等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可能为宫颈癌的治疗带来新策略。     

不同浓度二磷酸氯喹和雷帕霉素对CNE-2细胞自噬的影响

目的 探讨不同浓度二磷酸氯喹和雷帕霉素对人鼻咽低分化鳞癌(CNE-2)细胞自噬的影响.方法 利用Western-blot技术检测CNE-2细胞经不同浓度二磷酸氯喹(chloroquine disphosphate,CDP)和雷帕霉素(rapamycin)处理后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达情况.以碘化丙啶(propidineiodide,PI)染色技术分别检测CNE-2细胞经抑制自噬最明显的CDP及rapamycin浓度处理后的细胞凋亡率.结果 Western-blot结果示,CNE-2细胞经不同浓度CDP和rapamycin处理后LC3-Ⅱ和p62蛋白均有不同程度表达.CDP处理组中20.60mg/L浓度组LC3-Ⅱ和p62表达水平均明显高于其他各浓度组(F1 =719.388,F2=73.885,P均＜0.01);rapamycin处理组中18.28 μg/L浓度组LC3-Ⅱ表达水平明显高于其他各浓度组(F =375.120,P＜0.01),而p62表达水平却明显低于其他浓度组(F=70.770,P＜0.01).PI染色检测结果显示,20.60mg/L CDP组及18.28μg/L rapamycin组的细胞凋亡率与对照组间无明显差异(F=0.371,P=0.705).结论 二磷酸氯喹可以抑制CNE-2细胞的自噬功能,且在20.60mg/L浓度时抑制功能最显著,而不引起细胞凋亡;雷帕霉素可以诱导CNE-2细胞发生自噬,且在18.28μg/L浓度时自噬现象最为明显,而不影响细胞增殖.     

巴弗洛霉素A1对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及自噬的抑制作用

目的 探讨巴弗洛霉素A1（Baf-A1）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法 采用终浓度为0.1、0.5 μmol／L的Baf-A1处理Tca8113细胞,并设不加药的对照组。MTT比色法测定对照组及不同浓度Baf-A1处理0、24、48、72 h细胞的增殖情况,流式细胞仪检测0.5 μmol／L Baf-A1处理72 h的细胞周期,Western blotting、细胞免疫荧光检测自噬标记蛋白LC3B的表达,电子透射显微镜观察细胞自噬体形成情况。结果 Baf-A1呈剂量依赖性抑制Tca8113细胞增殖,05 μmol/L Baf-A1处理72 h时细胞增殖抑制作用最明显。流式细胞仪检测显示,与对照组比较,Baf-A1组sub-G1期、G1期细胞增多（P＜0.05）,S期和G2/M期细胞减少（P＜0.05）。Baf-A1组LC3B-II蛋白的相对表达量为1.83±0.23,高于对照组的0.79±0.18（P＜0.01）;细胞免疫荧光检测显示,对照组中可见少量LC3B表达,而Baf-A1组72 h后可见大量LC3B点状聚集物;电镜观察显示,与对照组比较,0.5 μmol／L Baf-A1处理后可见大量自噬体形成,自噬溶酶体形成增加。结论 Baf-A1对舌鳞癌Tca8113细胞有增殖抑制作用,可能与其阻滞细胞周期和抑制细胞自噬有关。     

新生霉素诱导前列腺癌PC-3细胞自噬的研究

目的:通过体外细胞实验,观察新生霉素是否抑制了前列腺癌PC-3细胞的增殖,并在分子水平和形态学上证实新生霉素通过细胞自噬抑制了前列腺癌PC-3细胞的增殖.为新生霉素应用于去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)的临床治疗提供理论和实验依据.方法:设置对照组和不同浓度的新生霉素实验组,作用前列腺癌PC-3细胞24小时后,利用MTT法测定对照组和不同浓度实验组的增殖率,并计算出新生霉素的半抑制率.透射电镜观察对照组及实验组细胞内的自噬体.利用免疫荧光技术,在荧光显微镜下观察对照组和不同浓度实验组发生细胞自噬时的自噬标志性蛋白LC-3Ⅱ和自噬底物蛋白p62的不同.利用RT-PCR在mRNA水平上检测对照组和不同浓度实验组的自噬相关基因LC-3Ⅱ、Beclin-1的表达.结果:MTT结果示新生霉素能使PC-3细胞的增殖明显受到抑制(F=569.26,P=0.000),其抑制率随着药物浓度的增加而增加,根据公式计算出其IC50=1.52mmol/L.透射电镜观察可见实验组PC-3细胞质内自噬体和自噬溶酶体数量较对照组多,且随着浓度的增加自噬体数量增加.自噬体在细胞中的分布通过绿色荧光FITC标记的自噬特异性蛋白LC-3Ⅱ在荧光显微镜下清晰显示,在细胞膜附近有绿色荧光呈散点状分布,随着实验组新生霉素浓度的增加荧光强度增加.而绿色荧光FITC标记的自噬底物蛋白p62在荧光显微镜下的强度随着药物浓度的增加而降低.RT-PCR在mRNA水平上检测到随着药物浓度的增加自噬相关基因LC-3Ⅱ、Beclin-1的表达量升高.结论:在体外细胞实验中,新生霉素能够在一定浓度范围内呈浓度依赖性的抑制PC-3细胞增殖.新生霉素能在mRNA水平上增强Beclin-1、LC-3Ⅱ的表达.新生霉素可能是通过诱导细胞自噬性死亡来抑制前列癌PC-3细胞的增殖.     

miR-18a对胶质瘤细胞增殖和自噬的影响

目的:探讨miR-18a在神经胶质瘤细胞增殖和自噬中的作用。方法:采用瞬时转染的方法将miR-18a inhibitor及其阴性对照(negative control inhibitor,NC inhibitor)分别转染大鼠C6胶质瘤细胞;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-18a在C6胶质瘤细胞中的表达;CCK-8法检测转染miR-18a inhibitor后C6细胞的增殖活性;mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染各组细胞,以动态监测自噬通量;Western blot检测敲低miR-18a后C6细胞中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1的表达情况;RT-qPCR检测转染miR-18a抑制剂后C6细胞中自噬相关基因Beclin1和LC3B的相对表达水平。结果:RT-qPCR结果显示,与NC inhibitor组相比,miR-18a inhibitor组的miR-18a表达量显著降低（P＜0.05）。敲低miR-18a后显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖（P＜0.05）。倒置荧光显微镜下观察到抑制miR-18a后可阻断自噬流,抑制自噬小体和溶酶体融合。抑制miR-18a可使胶质瘤细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05）,p62蛋白的相对表达量明显升高（P＜0.05）。敲低miR-18a后能抑制胶质瘤细胞中的Beclin1和LC3B mRNA表达（P＜0.05）。结论:miR-18a下调可抑制胶质瘤细胞的增殖和自噬。     

丁酸钠对大肠癌HCT-116细胞增殖及自噬影响研究

目的 研究丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对大肠癌HCT-16细胞增殖和自噬的影响.方法 不同浓度(0.1、0.5、1、2和5 mmol/L) NaB处理大肠癌HCT-116细胞,MTT法检测细胞的存活率;蛋白质印迹法检测自噬特异性蛋白LC3B表达量的变化;单丹磺酰尸胺(MDC)和吖啶橙(AO)染色检测酸性自噬泡的形成.结果 单因素方差分析结果显示,不同浓度(0.1、0.5、1、2和5mmol/L)NaB处理组与对照组细胞的存活率相比,差异有统计学意义,F=24.076,P＜0.001;0.5 mmol/L浓度的NaB作用24 h即能显著抑制大肠癌HCT-116细胞的增殖,细胞存活率为(94.00±4.09)％,P＜0.05;1、2、5 mmol/L浓度的NaB作用大肠癌HCT-116细胞24 h,细胞存活率分别为(89.43±1.83)％、(84.56±4.77)％和(81.00±7.38)％,与对照组比较,P值均＜0.01.2 mmol/L NaB处理24后,HCT-116细胞内酸性囊泡细胞器明显蓄积;不同浓度NaB处理HCT-116细胞24 h后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB浓度增加而增加;2 mmol/LNaB处理HCT-116不同时间(10 min、30 min、1h、2h、4h、6h、12h和24 h)后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB作用时间的延长而增加.结论 NaB可抑制大肠癌HCT-116细胞增殖并诱导其发生自噬.     

lncRNA TUG1对肝癌细胞增殖及自噬水平的影响

目的:检测长链非编码RNA牛磺酸上调基因（taurine upregulated gene 1,TUG1）在肝癌组织中的表达情况,证实TUG1对肝癌细胞增殖和自噬能力的影响。方法:实时定量PCR检测50例肝癌组织标本以及相应癌旁组织中TUG1的表达水平以及在肝癌细胞系中的表达情况。通过将构建的TUG1过表达质粒转染肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2,验证转染效率并采用CCK-8法检测肝癌细胞增殖情况;Western blot检测自噬标志蛋白（LC3-Ⅱ/Ⅰ）表达变化;通过实时定量PCR筛选表达差异最显著的自噬相关基因并采用Western blot验证。结果:肝癌组织中TUG1的表达显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。TUG1能够显著促进肝癌细胞增殖能力（P<0.05）;并且过表达TUG1后增加了LC3-I向LC3-Ⅱ的转化,促进自噬水平的发生（P<0.05）;TUG1能够显著上调ATG7的基因和蛋白的表达。结论:在肝癌组织中TUG1表达高于癌旁组织;在体外细胞实验中发现,TUG1能够促进肝癌细胞增殖能力,并通过上调ATG7的表达诱导自噬的发生。     

自噬对放射敏感性的影响

自噬广泛存在于真核生物中,利用溶酶体降解受损细胞器或蛋白质,维持细胞内环境的稳定,并提供能量;且通过自噬相关基因和信号通路参与肿瘤细胞的生长、增殖及凋亡。放疗是肿瘤治疗的主要方法之一,但肿瘤细胞常存在放射抵抗,降低疗效。有研究表明自噬与肿瘤细胞的放射敏感性相关,但结论不一。文章就自噬对肿瘤放射敏感性的不同影响作一综述。     

自噬对放射敏感性的影响

自噬广泛存在于真核生物中,利用溶酶体降解受损细胞器或蛋白质,维持细胞内环境的稳定,并提供能量;且通过自噬相关基因和信号通路参与肿瘤细胞的生长、增殖及凋亡。放疗是肿瘤治疗的主要方法之一,但肿瘤细胞常存在放射抵抗,降低疗效。有研究表明自噬与肿瘤细胞的放射敏感性相关,但结论不一。文章就自噬对肿瘤放射敏感性的不同影响作一综述。     

白藜芦醇通过自噬途径对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

摘 要：［目的］ 研究白藜芦醇（Resveratrol,Res）对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡效应,并从自噬角度探讨其机制。［方法］ 不同浓度Res及联合自噬抑制剂3-MA处理HepG2细胞。CCK-8法检测各组的细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;MDC染色后荧光显微镜下观察自噬形态;RT-PCR和Western blot检测Beclin1、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。［结果］ Res可以显著降低HepG2细胞的存活率和诱导凋亡。Res诱导HepG2细胞发生自噬,Beclin1表达显著上调,Bcl-2表达显著下调;联合3-MA抑制自噬后,减弱了Res对HepG2细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。［结论］ Res可通过诱导HepG2细胞自噬发挥抑制增殖和促凋亡作用,其机制可能与作用于Beclin1/Bcl-2复合体有关。     

中药单体对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用及对酪氨酸酶活性的影响

目的:研究五种中药单体对人恶性黑色素瘤细胞A375体外增殖的影响和对细胞内酪氨酸酶活性的作用。方法:将具有美白功效的五种中药单体（熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素和丹参酮ⅡA）分别与A375细胞作用。MTT比色法观察这五种中药单体对A375细胞体外增殖的影响;多巴速率氧化法研究这些中药单体对A375细胞内酪氨酸酶活性的作用。结果:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性（P<0.05）。熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素均可抑制A375细胞内酪氨酸酶的活性;且作用48 h后,高浓度的熊果苷和丹参素仍可显著抑制酪氨酸酶活性(P<0.05),而芦荟大黄素及姜黄素虽对酪氨酸酶活性仍有抑制作用,但无统计学差异。丹参酮ⅡA在不同浓度下均未检测到对酪氨酸酶活性的抑制作用。结论:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性;一定浓度的熊果苷和丹参素对A375细胞增殖抑制的同时亦可显著抑制细胞内酪氨酸酶活性;而芦荟大黄素、姜黄素、丹参酮ⅡA对细胞内酪氨酸酶活性均未见明显抑制作用。我们推测对酪氨酸酶活性的抑制作用可能是具有美白功效的中药单体熊果苷和丹参素抑制A375细胞增殖的作用机理之一,而芦荟大黄素、姜黄素及丹参酮ⅡA可能是通过其他机制来抑制细胞增殖。     

16例恶性黑色素瘤的病理形态观察和预后分析

本文对１６例恶性黑色素瘤（后称恶黑）的临床病理和随访结果分析显示：下肢和足底是恶黑的好发部位。有黑痣者占３４．２％。肿块色调深浅与表皮内异型黑色素细胞增生程度有对应关系。外伤及长期慢性磨擦刺激等因素，可促发恶性变，故早期预防切除尤为必要。直肠肛管区恶黑发病隐袭，初期诊断困难，易延误治疗。通过随访，重点分析了不同部位恶黑的形态特点与预后和存活期的关系。对发病特点、临床表现及诊断治疗亦作了探讨。     

白藜芦醇对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

目的:探讨白藜芦醇对黑色素瘤细胞WM239增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:MTT法检测白藜芦醇对WM239细胞增殖的影响;流式细胞术检测白藜芦醇对WM239细胞周期及凋亡的影响。结果:12.5～200μmol/L的白藜芦醇作用于WM239细胞48h和72h后,对其增殖具有一定的抑制作用,作用72h时,浓度>50μmol/L其抑制率>50%,且抑制程度与药物浓度呈正相关。其中0、25、50和100μmol/L药物与WM239细胞作用48h后,凋亡率分别为0.1%、9.7%、8.9%和19.3%,处理组与未处理组相比细胞凋亡明显增加,G0/G1期细胞分别为71.9%、77.3%、81.0%和83.7%,S期分别为21.5%、17.9%、16.0%和14.6%,G2/M期为6.5%、4.8%、2.9%和1.8%,细胞周期阻滞于G1期,S期和G2期细胞比例下降,剂量依赖关系明显。结论:白藜芦醇可以抑制WM239细胞的增殖,引起细胞周期改变,凋亡细胞明显增加。     

特异性微小RNA在恶性黑色素瘤中的研究进展

微小RNA（miRNA）是一类小分子非编码调控性RNA,以细胞及组织特异性方式表达,在维持细胞自身稳态及癌变过程中具有关键性作用.近年来,研究表明许多特异性miRNA与恶性黑色素瘤的发生发展有关.黑色素瘤相关性miRNA通常定位于肿瘤易发生基因扩增及缺失的基因组区域.文章旨在探讨特异性miRNA通过各种途径对不同靶基因的调控从而参与恶性黑色素瘤的生物学进程,并描述了黑色素瘤的治疗现状.     

Amelanotic malignant melanoma of the esophagus: case report and review of the literature

A case of amelanotic malignant melanoma of the esophagus in a 76-year-old woman is reported. A whitish polypoid tumor, measuring 3 x 2 x 2.7 cm, surrounded by black pigmented mucosa, was detected in the middle intrathoracic esophagus. The tumor showed a lobulated surface lined by squamous cell layer, and had epithelioid and polyhedral cells forming alveolar clusters. Melanin pigments or stainability for the dihydroxyphenylalanine (DOPA) reaction were only observed in a few tumor cells. Junctional changes and mucosal melanosis, however, were found freely in the mucosa around the tumor. Many tumor cells showed a strongly positive immunohistochemical reaction for neuron specific enolase (NSE) and S100 protein. The patient died of widespread metastases six months after surgery. Further, a review of 106 reported cases of primary esophageal malignant melanoma, including 29 autopsies, was made; the melanomas were found to include 10 of amelanotic type, eight of which had been misdiagnosed at biopsy. Junctional changes could be found in the mucosa over or around the tumor, in four cases, and mucosal melanosis in one. Lymph node metastasis was the most frequently observed development at autopsy regardless of whether the tumor was amelanotic or melanotic. For correct diagnoses of melanomas of the amelanotic type, peripheral mucosal findings, such as junctional changes or melanosis, should be helpful; and, in order to obtain a good prognosis, a careful resection of the regional lymph nodes could prove valuable.     

Individualized therapy of disseminated cancer using malignant melanoma as a model

Approximately 20 to 25% of patients with malignant melanoma will die of metastatic disease. The current standards of care for advanced metastatic melanoma (stage IV, AJCC classification) are poor. To date, randomized trials have failed to demonstrate that one regimen is better than another. It is therefore crucial that patients with disseminated malignant melanoma be recruited into clinical trials. In recent years, there have been impressive advances in our knowledge of the biology and nature of cancer development and the growth and progression to metastasis. The approach “from bench to bedside” is current reality in the treatment of several solid tumors and hematologic malignancies. The identification of new targets to facilitate individualized melanoma treatment is now an important issue. This article will give an overview of recent developments in clinical trials of targeted therapies in metastatic melanoma patients. Presented as Session VII of the First International Symposium on Cancer Metastasis and the Lymphovascular System. April 28–30, 2005, San Francisco, CA; Chaired by Axel Hauschild.     

Radiotherapy in the management of malignant melanoma

We performed a retrospective analysis of 45 patients with malignant melanoma who were treated with radiation therapy at the University of Illinois and Mercy Hospitals, Chicago, between 1%2 and 1978. Thirty-nine patients received 69 courses of radiation therapy for metastatic disease, six patients received radiotherapy with curative intent for localized lesions. We analyzed some of the factors governing the response to radiation therapy. Although most of the patients were treated with conventional daily fractions, their response seemed comparable to that reported by other investigators using large fractions. Until the issue of optimum fraction size is settled by a comparative trial, our experience indicates that conventional fractionation may be equally effective.     

盐霉素通过靶向调控ALDH影响三阴性乳腺癌细胞MDA-MB- 231增殖和凋亡

目的 探讨盐霉素（salinomycin,Sal）对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 采用流式细胞术筛选ALDH高表达乳腺癌细胞系;采用MTT法检测不同浓度Sal（1~32 μmol/L）对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测Sal对细胞凋亡以及肿瘤干细胞表面标志物ALDH表达的影响;采用qRT-PCR、Western blot检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP mRNA和蛋白表达;TCGA（the Cancer Genome Atlas）数据库下载乳腺癌患者数据集（n=1 218）,采用Pearson法分析ALDH与凋亡相关分子表达的相关性。结果 Sal在24 h、48 h、72 h均可以剂量依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞增殖（均P<0.001）;Sal作用MDA-MB-231细胞48 h后,与对照组比较,2 μmol/L组、4 μmol/L组、8 μmol/L组的细胞凋亡率均升高（均P<0.05）;Bcl-2、PARP、Caspase-3 mRNA表达下降（均P<0.05）,Bax mRNA表达升高（均P<0.05）;Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达下降（均P<0.05）,PARP、Bax 蛋白表达升高（均P<0.05）;MDA-MB-231乳腺癌干细胞表面标志物ALDH表达下降（均P<0.05）。TCGA数据库分析显示,ALDH与抗凋亡分子Bcl-2、Caspase-3的表达呈正相关（r=0.209,P=0.007;r=0.235,P=0.002）,与Bax、PARP的表达呈负相关（r=-0.326,P＜0.001;r=-0.453,P＜0.001）。结论 Sal可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长,可能通过下调肿瘤干细胞表面标志物ALDH表达实现。     

Primary malignant melanoma of the esophagus: report of four cases

We report four cases of malignant melanoma of the esophagus treated at the National Cancer Center Hospital in Tokyo over a period of 28 years. There were three men and one woman. One patient had been diagnosed as having Werner's syndrome. The three male patients smoked and were alcohol drinkers. The chief complaint was dysphagia--three patients--and pain on swallowing--one patient. All the tumors were polypoid, and three were large at the time of initial diagnosis. Histological diagnoses were made by examining endoscopic biopsy specimens, and confirmed with resected specimens in three cases. Esophagectomy was performed in three patients, the other receiving radiotherapy. Three patients died of recurrent disease in a rather short period of time, as in many reported cases. The mean survival for the three patients was eight months. The fourth, who had a superficial polypoid lesion and received esophagectomy and adjuvant chemotherapy, lived for 29 months. The combination of early detection and extended radical surgery followed by adjuvant chemotherapy may offer a better prognosis than in the past.