Cloning and sequencing of the fragment of angiostatin K (1-3) gene

OBJECTIVE To secure anti-endotheliocyte hyperplasia functional fragment of human angiostatin K (1-3) gene.

METHODS As the template of leukocytotic cDNA, functional fragment of human angiostatin K (1-3) cDNA was amplified by PCR, cloned into the vector pGEM-3Zf, and sequenced according to Dye primer sequencing kit.

RESULTS The functional fragment of angiostatin K (1-3) cDNA (859 bp) was obtained by PCR and determined by sequencing.

CONCLUSIONS The angiostatin K (1-3) gene has been cloned. The gene is of great significance in tumor-antiangiogenesis therapy.

     

中国人血管抑素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆中国人血管抑素(angiostatin，ANG)基因全长并进行序列分析。方法：应用RT-PCR，将5例健康人肝脏组织ANG基因克隆到pSP71载体上，用Sanger法进行基因测序分析。结果：通过RT-PCR获得一个1141bp的扩增产物，测序发现与已报道的ANG比较，国人ANG上有3个碱基突变位点：分别为第825位C→T；第927位T→G和第1078位G→A。前两个碱基突变氨基酸未发生变化，第3个碱基突变结果使缬氨酸(Val342)改变成为蛋氨酸(Met342)。结论：克隆得到中国人ANG基因片段，其碱基和氨基酸的变化可能是人群中该基因的遗传多态现象。     

人内皮抑素基因的克隆与测序

目的　获得人内皮抑素 (endostatin)功能区段基因片段 .方法　从人肝组织提取 m RNA,用反转录聚合酶链反应技术克隆 endostatin基因 ,2 0 g· L- 1 脂糖凝胶电泳后将其重组入 p UC19载体 ,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列 .结果　经 Genbank分析证实 ,所获得的 5 5 2 bp基因片段属于endostatin功能区段基因 ,序列正确 .结论　本研究为应用endostatin基因进行实体瘤抗血管生成治疗奠定了基础     

血小板生成素基因功能区段的体外扩增与序列测定

目的：获取具有功能的血小板生成素基因区段．方法：以正常肝组织ｍＲＮＡ为模板，聚合酶链反应扩增所需目的ｃＤＮＡ，克隆入ｐＵＣ１９中，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列．结果：ＰＣＲ扩增得约４８０ｂｐ片段，经测序证实为血小板生成素功能区段基因．结论：已得到所需血小板生成素功能区段基因．     

小鼠血管抑素基因的克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠血管抑素（mAS)基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠肝组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将mAS的cDNA扩增出，克隆到pcDNA3真核表达载体中，测定其DNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的血管抑素基因，其序列与GenBank中鼠的mAS基因序列有4个碱基不同，所编码的氨基酸有3个发生突变。结论：已成功构建鼠mAS的真核表达载体，为进一步应用AS进行肿瘤基因治疗研究打下基础。     

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。     

人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因的克隆及序列测定

目的：获取人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：从人胎肝组织中用反转录ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法双向测定目的基因序列。结果：从人胎肝组织中成功地扩增到ｈＰＤＩｆ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｈＰＯＩｆ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

黑色素瘤抗原-1基因并进行序列分析

目的:克隆黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因并进行序列分析.方法:从人肝细胞性肝癌(HCC)组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出MAGE-1基因,酶切鉴定后将其插入pGEM-T easy载体,对其进行序列测定并与GenBank中已知序列进行同源性分析.结果:所克隆的MAGE-1基因与GenBank 中的MAGE-1基因序列相比较,仅有4个碱基存在差异,同源性为99.7%,而且仅有1处碱基差异引起了氨基酸改变.结论:从人HCC组织中成功克隆了MAGE-1基因.     

HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ     

人存活素基因编码区的克隆和序列分析

目的：克隆人存活素(survivin)基因编码区cDNA并进行序列分析。方法：以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT-PCR方法得到人存活素的编码区cDNA，克隆至载体pUC19中，酶切鉴定后进行序列分析。结果：获得人存活素编码区基因和重组质粒pUC19-SURVIVIN，DNA序列分析证实所获得的存活素基因编码区cDNA序列和文献报道一致。结论：采用基因克隆的方法获得人存活素基因，为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。     

家兔—高重复顺序DNA片段的分子克隆及克隆片段的核苷酸...

We obtained highly repeated DNA fragments from a rabbit by using restriction endonuclease HindIII digestion of chromosomal DNA; the smallest highly repeated DNA fragment was cloned into vector plasmid pUC12. We used the recombinant plasmid to transform E. coli JM101, selected and identified the positive clone by DNA probe in situ hybridization as well as Southern blotting. We obtained a recombinant clone [termed pRAb (Hind III)-1] which contains the highly repeated DNA fragment [termed RAb (Hind III)-1]. The complete nucleotide sequence of the 345bp RAb (Hind III)-1 fragment was determined by the dideoxynucleotide termination sequencing method. We analyzed the characteristics of the structure of the sequence with a microcomputer, and the results suggested that the RAb (Hind III)-1 sequence is quite different from alphoid DNA of primates.     

重组人血管抑素基因克隆与表达

目的：构建人血管抑素原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As，诱导表达融合蛋白。方法：从人肝组织中提取总RNA，用RT-PCR的方法获得血管抑素基因，克隆到pEZZ18载体中，在E.coli DH5α中诱导表达。结果：成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白。结论：该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。     

人脂联素基因的克隆及序列分析

目的：克隆人脂联素基因（apM1）,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础.方法：应用RT-PCR法自人大网膜脂肪组织的总RNA中扩增出apM1 cDNA全长基因,采用T-A克隆法重组到pGEM-T Vector System中,通过蓝白斑筛选出阳性克隆后,测序鉴定.结果：从脂肪组织总RNA中扩增得到735bp apM1基因,其cDNA序列与GenBank报导的人脂联素基因apM1同源性为99.7%（159位和558位碱基发生了无义突变）,获得了质粒pGEM-T-apM1,测序鉴定正确.结论：成功的克隆了apM1基因全长cDNA.     

人肌肉抑制素cDNA的克隆及测序分析

目的 克隆人肌生长抑制素(myostain,MSTN)基因.方法 提取人肌肉组织mRNA,逆转录成cDNA,将回收PCR产物直接和pCEM-T质粒进行连接,构建重组质粒载体pCEM-T-L4STN,将扩增后的pCEM-T-MSTN进行双酶切鉴定和测序鉴定,对测序结果进行BLAST分析.结果 经克隆得到MSTN基因片段,和人MSTN基因的同源性为100%.结论 肢带型肌营养不良症家系中患者的MSTN基因未发生突变.克隆的MSTN cDNA基因为进一步表达重组MSTN蛋白提供了基础.     

重组人血管抑素基因K(1-3)腺病毒载体的构建

目的 构建携带血管抑素（angiostatin，AG）基因K（1—3）重组复制缺陷型腺病毒表达载体。方法 将人血管抑素K（1—3）cDNA插入穿梭载体pShuttle产生重组质粒pShttle-AG（K1—3），经双酶切与骨架载体pAdeno—X重组产生pAdeno-X—AG（K1—3），转染293细胞制备重组腺病毒。结果 对pShuttle—AG（K1—3）进行酶切鉴定及测序证实插入片断为AG（K1—3）。PCR鉴定pAdeno—X—AG（K1—3），扩增出318bp特异性片断。线性pAdeno—X—AG（K1—3）转染293细胞，成功包装出重组腺病毒。结论 成功构建了携带人anglostatin（K1—3）重组腺病毒栽体，可在体外表达具有生物学活性的人angiostatin（K1—3），为进一步研究奠定了基础。     

鼠牙乳头细胞核心结合因子cDNA片段的克隆与序列测定

目的 从培养大鼠牙头细胞中克隆核心结合因子（cbfal）的cDNA片段。方法 原代培养大鼠牙乳头细胞,提取培养细胞的总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR的方法扩增cbfal基因片段。将获得的预期大小的PCR产物插入pUC18克隆载体中,转化TOP10感受态细胞,蓝白筛选白色克隆,进行体外扩增,提取质粒进行酶切鉴定,含目的插段的克隆在PE317-A自动测序仪上进行序列测定。结果 从培养的鼠牙乳头细胞提取的总RNA中成功克隆出691bp cbfal基因片段,测序结果和GenBank报道序列完全一致。结论 从鼠牙乳头细胞中成功克隆到cbfal基因片段,确切的证实了核心结合因子（cbfal）基因在鼠牙乳头细胞中的表达。