噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究

目的 构建表达抗人红细胞血型Ａ抗原５０Ａ杂交瘤细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法 应用重组噬菌体抗体技术,从５０Ａ杂交瘤细胞中分离、构建单链抗体基因,并将其克隆入噬粒ｐＣＡＴＮＡＢ５Ｅ中,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－Ｂｌｕｅ,辅助噬菌体援救构建５０Ａ噬菌体单链抗体库;采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体,鉴定重组噬菌体并进行序列测定分析;免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性。结果 用Ｍ１３     

抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达

目的研究人源抗人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｇｐ１２０单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法以人工合成的ＨＩＶ－ｌｇｐ１２０Ｖ３环多肽为抗原，利用噬菌体抗体库技术，筛选含有抗－ｇｐ１２０ＳｃＦｖ基因的噬菌体，提取质粒，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，表达可溶性ＳｃＦｖ。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物分子量为２８ｋＤ左右，且具有ｃ－ｍｙｃ活性；ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，可溶性ＳｃＦｖ具有较好的抗原结合活性和较强的特异性；竞争性ＥＬＩＳＡ实验结果进一步证明表达产物的特异抗－ｇｐ１２０活性。结论该技术便捷有效，可大量获得人源抗ＨＩＶ抗体片段，为进一步研究抗ＨＩＶ抗体的生物活性和ＨＩＶ感染诊治打下基础     

癌胚抗原单链抗体的基因构建表达及免疫活性检测

目的　研制识别癌胚抗原的基因工程单链抗体,使其能够应用于肿瘤的免疫诊断和治疗。方法　利用ＲＴＰＣＲ 方法扩增抗体可变区基因并表达于噬菌体表面。通过免疫筛选获得癌胚抗原特异单链抗体ＣＬ３ｓｃＦｖ 。结果　ＥＬＩＳＡ 和免疫组化均显示抗体ＣＬ３ｓｃＦｖ 能够结合ＣＥＡ,而不与正常胃肠道组织起反应。结论　 该抗体将成为胃肠道恶性肿瘤辅助诊断和治疗的有效试剂。     

抗HIVp24单链抗体的基因构建及序列测定

应用重组噬菌体抗体系统，从经过ＨＩＶ全蛋白裂解物及ｐ２４免疫过的鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建出组合单链抗体（ＳｃＦｖ）ｃＤＮＡ文库。ｃＤＮＡ文库克隆到噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，转化大肠杆菌ＴＧ１，得到２５×１０７个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现，用ｐ２４蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行两轮亲和富集获得一株特异性好的抗ｐ２４的噬菌体单链抗体。经ＥＬＩＳＡ鉴定，该噬菌体呈ｐ２４结合ＥＬＩＳＡ阳性的滴度小于１０７ｐｆｕ／ｍｌ。并对ＳｃＦｖ进行了序列分析，对今后的应用奠定了基础。     

具有G—CSF抗原结合活性的三个重组噬菌体单链抗体基因？…

利用固相化Ｇ－ＣＳＦ亲和吸附法,从已构建的抗ｒｈＧ－ＣＳＦ全套单链抗体噬菌体表面展示文库中,筛选出含有特异抗体片段的噬菌体颗粒。结合直接感染法和酸性洗脱液洗脱法,进行４轮亲和富集筛选,并通过ＥＬＩＳＡ法结合双酶切鉴定,共筛选出９个具有Ｇ－ＣＳＦ结合活性的完整的重组噬菌粒克隆。对其中３个阳性克隆进行了ＳｃＦｖ基因全序列测定,获得６个抗体可变区基因的全序列。计算机分析表明,它们均为新发现的小鼠免疫球蛋     

CEA单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的尝试将ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中进行高效表达。方法以ＣＥＡ单链抗体基因为模板，设计４对引物，ＰＣＲ扩增，将４条ＤＮＡ扩增片段分别插入原核表达载体ｐＢＶ２２０中；重组质粒转染大肠杆菌ＴＧ１，４２℃热诱导外源蛋白的表达；包涵体经８ｍｏｌ／Ｌ脲溶解及谷胱甘肽系统复性；过离子交换柱进行纯化；ＥＬＩＳＡ夹心法测活性。结果得到了ＳＤ序列与起始密码ＡＴＧ分别相隔着５，６，７，８个核苷酸的重组质粒；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示转染入重组质粒的ＴＧ１菌经热诱导后有分子量约为３×１０４的外源蛋白，表达量最高达９３０ｍｇ／Ｌ培养液，约占菌体总蛋白的５０％；ＥＬＩＳＡ活性测定结果表明复性后的ＳｃＦｖ有较高的抗原结合活性。结论ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，且经复性后有较高的抗原结合活性。     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

用噬菌体表面表达技术筛选及表达抗重组人促红细胞 …

目的 获得抗重组人红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）的单链抗体（ＳｃＦｖ），为得到纯度高、活力强的重组人红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）产品和制备红细胞生成素（ＥＰＯ）检测试剂盒奠定基础。方法 采用噬菌体表达表达和重组抗体技术，从已建立的鼠抗ｒｈＥＰＯ杂交瘤细胞株Ｄ３中克隆出抗ｒｈＥＰＯ单链抗体ＳｃＦｖ基因片段，经噬菌体表面呈现，与固相抗原ｒｈＥＰＯ结合，“吸附－洗脱－富集”，酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测，     

抗人CD4单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现的一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｖＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性。     

抗人γδTCR单链抗体G5-4ScFv的制备及生物学功能分析

目的 构建并应用原核表达体系表达能体外刺激人γδ T细胞增殖的抗人γδ TCR单链抗体.方法 在成功建立稳定分泌鼠抗人γδTCR单克隆抗体杂交瘤细胞系G5-4的基础上,通过RT-PCR,扩增得到该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因;通过搭桥PCR法,用连接肽(Gly4Ser)3,将VH和VL连接起来,构建了抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv基因.将该基因插入原核表达载体pET22b(+),并在大肠杆菌TransB( DE3)中经IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE,Werstern blot进行鉴定,并通过流式、固相扩增、细胞因子检测、杀伤检测等方法分析单链抗体G5-4ScFv的生物学功能.结果 单链抗体G5-4ScFv的相对分子质量约30ku,能与γδ TCR特异结合;固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90％;扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞,并在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α.结论 成功构建并表达了具有生物学活性的抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv,为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗用细胞制剂奠定了基础.     

针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体（简称单抗）MGb1的重组抗独特型抗体（抗-Id）,为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子。方法 以单克隆抗体MGb1免疫Balb／c小鼠,取脾分离mRNA。RT-PCR分别扩增抗体VL和VH cDNA,经linker DNA连接形成ScFv DNA。将scFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv文库。以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id scFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VL和VH cDNA分别约为320和340bp,ScFv DNA约为750bp。抗体ScFv文库经四轮淘选后,在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆。在18个克隆中,有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv。结论 经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-Id ScFv,从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体（anti-Id）。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT－PCR分别扩增抗体VH和VLDNA,进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后,随机挑取克生经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后,在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现antii-Id ScFv的菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv,从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。     

胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型ScFv的制备

目的 制备胃癌单抗MGd1的单链可变区片段（single chain variable fragment,ScFv),为胃癌体内诊疗研究提供候选靶向载体分子。方法 从MGd1杂交瘤分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VLDNA）,二者经linkerDNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MGd1结合抗原的细胞株KATOⅢ对重组噬菌体抗体ScFv进行峡谷轮筛选后;随机挑取克隆经ELISA筛选MGd1ScFv单克隆,并对其结合抗原的能力进行鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分别约为340、320和750bp,经两轮亲和筛选后,在随机筛检的30个克隆中得到12个噬菌体呈现型MGd1ScFv单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有5个。结论 用噬菌体呈现技术成功地获得了单抗MGd1的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core)的人源单链可变区抗体（ScFv)，为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc-ScFv。     

抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定

目的：构建表达抗PgpScFv，进行体外活性的测定。方法：利用RT-PCR方法，克隆抗Pgp杂交瘤细胞PHMAO2的重链可变区基因(VH)，轻链可变区基因(VL)，拼接为单链抗体(ScFv)，再克隆到具有强启动子的PET28a( )载体上进行表达，并进行了表达产物体外活性的测定。结果：构建了表达质粒PET28a( )．ScFvPGP，表达产物可与表达Pgp抗原的K562／A02细胞特异性结合，并不抑制Pgp外排泵的功能。结论：构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能，并无抑制作用，因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能，无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。     

人活化血小板单抗SZ-51单链抗体的基因构建及高效表达

目的　为降低鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量 ,进行了人活化血小板单克隆抗体SZ 5 1单链抗体 (ScFv)的基因构建及表达 ,希望摸索出一套稳定、高效表达SZ 5 1ScFv的方法。方法　同时构建了两种不同的SZ 5 1ScFv表达载体pHEN1 5 1ScFv及pET2 0b 5 1ScFv ,并分别导入大肠杆菌HB2 15 1及BL2 1(DE3)plys中进行表达 ,同时对它们的表达特性进行了比较。结果　pHEN1 5 1ScFv在HB2 15 1中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性形式分泌至细菌培养上清中。pET2 0b 5 1ScFv在BL2 1(DE3)plys中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性与不溶性的包涵体两种形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。经Westernblot证明两种体系表达产物均维持了亲本抗体与活化血小板特异性结合的能力。结论　pET2 0b表达体系对于SZ 5 1ScFv而言是一种稳定、高效的表达体系。但其包涵体部分的变复性条件仍需进一步探讨。     

抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的构建和稳定表达

目的　在内质网和细胞质内表达抗汉坦病毒糖蛋白G1,G2细胞内抗体。方法　PCR分别扩增抗汉坦病毒糖蛋白抗体VH和VL段基因 ,克隆入单链抗体表达载体pOPE 10 1 2 15 (Yol) ,转化大肠埃希菌XLI Blue ,IPTG诱导表达并鉴定其活性 ,再将单链抗体基因克隆入真核表达载体pEF myc ER和pEF myc CYTO ,转染VeroE6 ,使单链抗体在内质网和细胞质内得到表达 ;通过G4 18和有限稀释法筛选阳性克隆 ,建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系。结果　Western blot检测证实原核表达单链抗体 ,ELISA ,IFA检测其具有抗原结合活性 ,真核表达显示内质网和细胞质内特异性荧光 ,筛选细胞系阳性率 >95 %。结论　成功建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系 ,为利用汉坦病毒细胞内抗体研究抗病毒作用和病毒的包装复制及病毒感染机制奠定良好基础。     

Development of a functional monoclonal single-chain variable fragment antibody against Venezuelan equine encephalitis virus

We have generated a single-chain variable fragment (ScFv) antibody, from a previously well-characterized monoclonal antibody (MAb) to Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus, 5B4D-6. The variable regions of the heavy (V(H)) and light (V(L)) chain antibody genes, were connected by a DNA linker and cloned in the phagemid vector pCANTAB5E. The ScFv clone in Escherichia coli strain TG-1, 5B4D-6-6, was expressed as a approximately 30 kDa ScFv protein and higher molecular weight fusion products which were functional in recognizing VEE virus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results were reproduced in Escherichia coli strain HB2151, where clone D66 was expressed mainly as soluble periplasmic protein. The D66 ScFv antibody bound VEE virus strongly as determined by ELISA. Nucleotide sequence analysis of 5B4D-6-6 ScFv indicated that the Vkappa gene belonged to family XVI, subgroup V, while the V(H) gene was unique in its sequence, though its amino acid sequence could be subgrouped as IA. The deduced protein sequence of D66 was highly homologous to published murine ScFv protein sequences. This work demonstrates, for the first time, cloning of a functional ScFv antibody against VEE virus.