单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重组质粒的构建及序列分析

目的：构建ＨＳＶ１ 型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐ ＵＣ１８／ ＴＫ 重组质粒ＤＮＡ 为模板,用ＰＣＲ 方法扩增ＴＫ５′端５０３ｂｐ 基因片段,并将扩增的片段克隆入载体ｐ ＵＣ１８ 中（ｐ ＵＣ１８／ＴＫ１） ;用Ｐｓｔ Ｉ 和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ｐＵＣ１８／ ＴＫ, 获得ＴＫ３′端３８３ｂｐ 片段, 将此酶切片段克隆入ｐＵＣ１８／ ＴＫ１ 中, 并进行测序。结果： 构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ ＴＫ－ 。经酶切鉴定获得１ 条约９００ ｂｐ 的基因片段; 序列测定证实, ＨＳＶ１１７ｓｙｎ ＋ ＴＫ 基因缺失了第４９３ ～７４４ 位２５１ 对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的ＨＳＶ１／ＴＫ－ 基因重组质粒,为研制其突变株奠定了基础。     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因在大肠杆菌中的融合表达

用ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切已构建的含单纯疱疹病毒Ｉ 型胸苷激酶（ ＨＳＶ１ ＴＫ） 基因的ｐ ＵＣ１８／ＴＫ 质粒，将切出的ＴＫ 基因片段克隆入原核表达载体ｐ ＷＲ４５０１ 中，构建成ＨＳＶ１ ＴＫ 基因重组表达质粒ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ。以ＨＳＶ１ ＴＫ 特异性引物ＴＫ１ Ｆｏｒ 和ＴＫ２ Ｒｅｖ 进行ＰＣＲ 鉴定可扩增出预期的５０３ ｂｐ 的ＴＫ 基因编码区部分序列；ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切质粒ｐ ＷＲ４５０１／ ＴＫ， 可切出约１１５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段， 表明重组质粒中已插入ＨＳＶ１ ＴＫ基因片段。用ＩＰＴＧ 诱导ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ／ＪＭ１０９ ，表达出相对分子质量（ Ｍｒ） 约为９７ ０００ 的ＴＫ 和β半乳糖苷酶（ Ｍｒ５５ ０００） 融合蛋白。薄层扫描显示，该融合蛋白含量占菌体蛋白总量的２７ ．４７ ％ 。     

rBPI23基因克隆与鉴定

ｒＢＰＩ２３基因（ＢＰＩ６０ｂｐ）克隆与鉴定。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩＮ端１９９个氨基酸的基因片段,经酶切后通过连接反应构建重组克隆载体,测序鉴定。结果：ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＬ６０ｂｐ基因片段。成功构建ＰＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ＰＵＣ１８－＝ＢＰＩ４２０重组克隆载体,酶切、酶谱分析与预期结果相符。ＤＮＡ测序结果与文献报道一致,结论：ＰＵＣ     

THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布     

人CD23基因的亚克隆与部分序列测定

已构建的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＢＣＤ９７６，以ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，回收ＣＤ２３全基因，定向插入ｐＵＣ１８载体，构建ｐＵＣ１８－ＣＤ２３全基因重组体（ｐＵＣｄ９７６）。进一步利用该基因中第３９９位的ＨｉｎｄⅡ酶切点，在ｐＵ１８中构建了ＣＤ２３Ｎ端４０３ｂｐ和Ｃ端６０７ｂｐ的二个亚克隆，分别称为ｐＵＣＤ４０３Ｎ和ｐＵＣＤ６０７Ｃ。并对ｐＵＣＤ６０７Ｃ进行测离，最终确认其为ＣＤ２３基因。     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子与HBsAg融合蛋白基因的 …

目的 研究粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的免疫活性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）３８４ｂｐ的基因片段及ＨＢｓＡｇ８４６ｂｐ基因片段，扩增产物经柱纯化后，由Ｔ４ＤＮＡ酶连结因子１２３０ｂｐ的片段，将此片段命名为ＬＧＨ，克隆到ｐＵＣ１９质粒中，利用菌落ＰＣＲ法快速筛选阳性克隆及限制酶切鉴定片段的大小。结果 该基因全长１２３０ｂｐ，经     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析

目的 对致肾盂肾炎大肠杆菌（ＵＰＥＣ）１３２株的ｐａｐＡ基因进行克隆和序列分析。方法 根据Ｆ１３型ｐａｐＡ基因序列设计引物,并在二引物５′端加上限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＢａｎＨⅠ的酶切位点。采用此引物扩增１３２菌株ｐ菌毛粘附基因群的ｐａｐＡ基因,扩增产物克隆人质粒,选取阳性重组质粒进行核苷酸序列分析。结果 ＵＰＥＣ１３２株经ＰＣＲ法扩增获得约７００ｂｐ的ｐａｐＡ片段,经克隆获得阳性重组质粒ｐＣＴ２     

CD34基因克隆和表达

ＣＤ３４分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于多功能造血干细胞、祖细胞表面，在成熟血细胞表面无ＣＤ３４抗原表达，提示ＣＤ３４分子在早期造血调控方面起着重要的作用。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从高表达人ＣＤ３４抗原的ＫＧ－１ａ细胞系中成功地克隆出人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ，并将此基因插入克隆“载体ｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ酶切位点，构建了重组质粒ｐＵＣ１８－３４。用双酶切ｐＵＣ１８－３４质粒，将分离得到的基因片段插入痘苗病毒载体的ＳｍａⅠ位点，构建了重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－３４。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ＰＪＳＡ１１７５－３４转染已被野生痘苗病毒感染的ＴＫ￣－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＡＰ检测，表明重组痘苗病毒能特异地表达人ＣＤ３４抗原。人ＣＤ３４抗原ｃＤＮＡ克隆和表达，为进一步研究其结构和功能的关系以及研究造血调控机理奠定了基础。     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）ＳＭ４４株胸苷激酶基因（ＴＫ）,采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－Ｉ ＳＭ４４株病毒,提取病毒核酸作为模板,设计了ＨＳＶ－１ ＴＫ基因的上、下游引物,在引物的５‘端分别引入ＢａｍＨ１和ＥｃｏＲ１限制性内切酶位点,通过ＰＣＲ方法扩增出ＴＫ基因,经ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ １双酶切与ＰＵＣ１９质粒载体相连接,构建重组体转化受体菌ＪＭ１０９,通过筛选和酶切鉴定,获得     

大鼠心肌H^＋—ATP酶抑制蛋白基因克隆及初步鉴定

目的和方法：根据大鼠线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶抑制蛋白基因（ＩＦ１）ｃＤＮＡ序列，设计并人工合成一对特异性扩增ＩＦ１ｃＤＮＡ的引物。以提取的大鼠心肌ｍＲＮＡ为模板，反转录－聚合酶链式反应扩增出约４００ｂｐ条带，以Ｋｌｅｎｏｗ酶处理、纯化ＰＣＲ产物，与经Ｓｍａｌ酶切线性化的ｐＵＣ１９质粒ＤＮＡ连接，经转化、筛选初步获得两个重组质粒。对重组质粒进行酶切图谱分析并以重组质粒为模板做ＰＣＲ检测。结果：该质粒为ＩＦ１ｃＤＮＡ基因重组ｐＵＣ１９，并且该基因以正向插入，命名为ｐＩＦ１。     

IL—2／HBV PreS融合基因的克隆及序列测定

目的：获得ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因克隆，为表达ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白奠定基础，方法：用ＰＣＲ方法从乙肝全序列中扩增ＨＢＶｐｒｅＳ基因片段，并克隆入带ＩＬ－２基因的ｐｌｙ５质粒中，挑出的阳性克隆再亚克隆到ｐＵＣ１８中进行序列测定。结果：基因全长９３０ｂｐ，编码３１０个氨基酸，序列内有起始码和终止码。结论：所克隆的基因为ＩＬ－２与ＨＢＶｐｒｅＳ的融合基因。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1529bp cDNA的核苷酸序列分析

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－Ｋ５的大片段经直接自身环化，小片段与质粒载体ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ重组，构建测序用的亚克隆。用双链双脱氧末端终止法测各亚克隆的核苷酸序列，再拚接出全长为１５２９ｂｐ的３Ｄ５－５ｃＤＮＡ全长序列。与国际基因库资料比较，未见有相同的序列。此ｃＤＮＡ中有一个长４６５ｂｐ（从５４０ｂｐ－１００４ｂｐ）的ＯＲＦ，编码１５４个氨基酸的蛋白质。此蛋白质中有二个疏水区（第１～３４位氨基酸及第７９～１０９位氨基酸），提示它可能属Ⅰ类穿膜蛋白。     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆？…

目的 提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核中的表达量。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ＰＥＴ２８ａ得到重组质粒ｐＥＴ／１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果 间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒ     

布氏菌544A基因片段的PCR扩增及其序列分析

利用ＰＣＲ和ＤＮＡ重组技术，成功的扩增了牛布氏菌５４４Ａ基因。回收含Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４ＡＤＮＡ片段，插入ＳｍａＩ单酶切的ｐＵＣ９载体中，进行核苷酸序列分析，证实克隆的ＤＮＡ片段长度为２２４ｂｐ，在该序列中含有单个开放新闻记者框架。将重组用Ｋｐｎ１和ＢａｍＨ１双酶切下Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４ａＤＮＡ片段标记探针，均与６种布氏菌杂交出现阳性结果。说明Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４Ａ２２４ｂｐＤＮ     

抗骨形成蛋白（BMP）单链抗体的构建

从一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体杂交瘤中扩增出其可变区基因片段，并将其分别克隆入ＰＵＣ１８、１９载体，利用双脱氧链终止法进行序列测定和计算机分析后，应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，将重链基因的Ｃ端和轻链基因的Ｎ端连接起来，构建成单链抗体。将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，在大肠杆菌ＪＭ１０９中获得初步表达。     

登革2型43株病毒包膜蛋白E基因的聚合酶链反应扩增

以我国登革２型４３株病毒ＲＮＡ为模板，采用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增Ｅ基因片段。拟扩增的Ｅ基因片段始于登革病毒编码序列５＇端的１０３６ｂｐ，止于３＇端的２３０４ｂｐ，其间含有１个ＨｉｎｄⅢ酶切位点，３＇端有１个ＳｍａⅠ位点，５＇端有１个ＥｃｏＲⅠ位点。建立了扩增大片段的实验条件并制备出了大于１２００ｂｐ以上的片段。该片段与标准分子量对比为１２９２ｂｐ左右，经ＨｉｎｄⅢ酶切，出现７８１ｂｐ和５１１ｂｐ２个片段，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和光敏生物素标记核酸探针证实制备出的１２９２ｂｐ片段为Ｅ基因片段，此片段可直接用于克隆表达。