人骨髓CD34+干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用

背景：有研究证实，骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能。 目的：体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞，并检测其免疫学表型，观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：骨髓来源于健康供者。 方法：利用Percoll 梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞。采用脂质体介导转染法，选生长良好的传代细胞，以血管内皮生长因子165 基因转染人骨髓CD34+干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型。经血管内皮生长因子165 基因转染后，人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况。 结果：体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞，细胞形态呈成纤维细胞样。CD44、CD29和c-kit阳性，CD31和CD54阴性；经血管内皮生长因子165 诱导后，人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44 表达降低，CD31升高，呈现典型的内皮细胞表型，并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力。 结论：采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离，可培养扩增出高度同源的CD34+干细胞，经血管内皮生长因子基因转染后，CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型，验证了其具有向内皮细胞分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？ 目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。 结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

急性肝衰竭大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景：研究发现肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4和表皮细胞生长因子等可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,关于肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用尚未见报道。 目的：观察急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。 方法：采用密度梯度离心法从SD大乳鼠股骨、胫骨分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。采用急性肝衰竭大鼠血清诱导培养骨髓间充质干细胞,以常规培养液诱导为对照,观察细胞形态的变化,诱导培养14 d采用免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白、白蛋白的表达。 结果与结论：急性肝衰竭大鼠血清诱导培养14 d, 可见骨髓间充质干细胞发生明显的形态学改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,甲胎蛋白和白蛋白表达阳性率分别为(54.8±7.64)%和(45.9±9.68)%;对照组细胞未发生形态学改变,无甲胎蛋白和白蛋白的表达。证明了急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白。     

人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化的实验研究

目的探讨人外周血内皮祖细胞和单个核细胞分离培养、诱导向内皮祖细胞分化的方法与鉴定。方法采取人外周血抗凝,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血中的内皮祖细胞和单个核细胞,于体外以细胞因子诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,用免疫荧光法和流式细胞仪分离鉴定单个核细胞向内皮祖细胞分化的细胞特异性标志。结果外周血内皮祖细胞和单个核细胞共同培养3d大部分贴壁密集生长,培养6d梭形细胞增多,培养12d收获细胞进行鉴定。Dil标记乙酰化低密度脂蛋白摄取率为(70.00±11.21)%,AC133,CD31,CD34,血管内皮生长因子受体鄄2和血管性假血友病因子免疫荧光染色阳性。流式细胞仪分类计数,AC133、CD31、CD34和血管内皮生长因子受体鄄2阳性细胞分别为95.80%、87.60%、1.27%和96.40%。结论外周血循环中的内皮祖细胞和单个核细胞共同培养,诱导后者分化的内皮祖细胞具有祖细胞特性且诱导分化率高。     

枸杞多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向内皮谱系分化的影响

背景：枸杞多糖可促进生精细胞的增殖,诱导大鼠骨髓间充质干细胞、人脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化,枸杞多糖对骨髓间充质干细胞的生物学特性有何影响,有待深入研究。 目的：观察枸杞多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向内皮分化的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,MTT法检测细胞增殖率。用HG-DMEN+EGM-2诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内皮谱系分化,检测细胞Ⅷ因子相关抗原和荆豆凝集素表达。在培养液中加入或不加入枸杞多糖,分析枸杞多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和向内皮谱系分化的影响。 结果与结论：枸杞多糖未改变大鼠骨髓间充质干细胞形态,不影响细胞表面抗原CD29、CD45、CD106的表达,细胞Ⅷ因子相关抗原检测呈阴性反应。但明显提高了大鼠骨髓间充质干细胞的增殖率,延长细胞增殖的高峰时间。大鼠骨髓间充质干细胞用含EGM-2的内皮诱导培养基或内皮诱导培养基+枸杞多糖诱导,未加枸杞多糖诱导组大鼠骨髓间充质干细胞在第10天时已转化为具有内皮特征的细胞;而含有枸杞多糖的内皮诱导液需诱导至第12天,细胞才转化为具有内皮特征的细胞,提示枸杞多糖具有延缓EGM-2诱导的大鼠骨髓间充质干细胞向内皮谱系分化的作用。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。 目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。 方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。 结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7 d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7 d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28 d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P < 0.05),并且细胞数量可扩增达109 L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证**

背景：骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少。 目的：验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果。 方法：大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达。 结果与结论：培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长。细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底。分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达。结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定*☆

背景：当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞。 目的：通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础。 方法：绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分子CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-lectin和DiI标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能。 结果与结论：绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3~5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%;免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达。细胞能同时吞噬FITC-labeled BS-1-lectin,DiI-ac-LDL阳性率达85.3%。证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响*

背景：骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题。 目的：观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响。 方法：分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达。分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化。 结果与结论：3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P < 0.05)。用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖。提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响**☆

背景：骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性隐患。 目的：观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响。 方法：自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养。分别以下列血清微环境培养：自身血清组：分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养;同种异体血清组：分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组：分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养;DMEM组：分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率;生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达。 结果与结论：大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组。24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P < 0.01)。在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%,可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境。提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较*☆

背景：目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法：密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。 目的：在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。 方法：全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。 结果与结论：全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。 目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。 方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。 结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

兔骨髓源单个核细胞诱导血管内皮祖细胞修复尿道缺损

背景：如何解决尿道替代修复材料来源和改善新尿道的血液供应已成为尿道修复与重建研究的瓶颈问题。 目的：观察血管内皮祖细胞对尿道缺损修复后改善新尿道组织血液循环的效果。 设计、时间及地点：组织工程体内实验，于2006-01/2008-02在郑州大学第一附属医院外总实验室完成。 材料：3~5月龄雄性日本大耳白兔13只，1只用于制备骨髓源单个核细胞，剩余12只随机分为细胞修复组8只，模型组4只。 方法：无菌抽取兔两侧髂前上嵴骨髓，Percoll法贴壁分离培养单个核细胞，加入含VEGF、bFGF的培养基进行体外诱导分化，待细胞长满培养瓶底后胰蛋白酶消化传代。两组兔均建立尿道缺损模型，将脱细胞处理的无菌新鲜人羊膜修剪成1 cm2置于尿道缺损处，用0/6DG线将其两端分别与尿道残端连续缝合，形成尿道。细胞修复组将传至第3代的兔骨髓源单个核细胞浓度调整至1010 L-1，注射于新尿道两端的吻合口处，每处0.1 mL，0/6DG线间断缝合皮下组织覆盖成形后的尿道，并在近吻合口处和新修复尿道之中间处注射细胞悬液，每处0.5 mL；模型组在同样位点注射等量的空白细胞培养液。移植后4，12周制作尿道组织石蜡切片。 主要观察指标：细胞形态及鉴定结果，修复后尿道组织的血管再生情况。 结果：兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长，4 d后生长加速，呈克隆样生长；第10天出现典型的铺路石样改变，并迅速表现出条索状、草束状生长形式；所培养的细胞表型由CD34+/CD133+/CD31+逐渐转变成CD34+/CD133-/CD31+。与模型组比较，移植后第4，12周细胞修复组尿道组织内毛细血管再生数量均明显多于模型组（t=-9.034~5.985，P < 0.01）。 结论：兔骨髓源单个核细胞可在体外诱导分化为血管内皮祖细胞，且血管内皮祖细胞对改善尿道缺损修复后局部血液循环的效果非常明显。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。 目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10/12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。 方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5 d后首次换液，细胞融合率达90%时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。 主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48 h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14 d左右可达90%融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1~3 d为潜伏期，3 d后进入对数生长期，7~8 d为平台期，平均倍增时间为24.22 h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93.0%。 结论：采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景：组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。 目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成。 材料：胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者。 方法：采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养人骨髓基质干细胞。 主要观察指标：用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力。 结果：镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR。两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强。 结论：人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞★

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段，但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。 目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，并传代扩增。选择生长良好的第3，4代细胞接种于脑脊液中，通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞，分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。 结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性，CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态，并可见少量小圆细胞，表现为神经样细胞，表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性，CD45阴性，神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%)。细胞具有相似的S形生长曲线，生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖，无诱导分化作用，且细胞对生长环境有高度的适应性。