胶质细胞源性神经营养因子促进中脑源神经干细胞增殖和向多巴胺能神经元分化

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对中脑源神经干细胞(mNSCs)增殖、分化能力和表达垂体同源盒家族因子3(Pitx3)、孤儿核受体相关因子1(Nurr1)和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的影响。方法:取E14.5d大鼠中脑组织体外培养原代mNSCs,增殖培养传三代后进行分化实验;使用免疫荧光方法检测培养分化的mNSCs表达Pitx3、Nurr1和TH蛋白。结果:在GDNF作用下,体外培养的mNSCs克隆球直径增大,数量增多;分化的神经元中Pitx3、Nurr1和TH蛋白表达增加(P0.05)。结论:在体外培养条件下,GDNF有促进mNSCs增殖和向多巴胺能神经元分化的作用。     

转录因子Pitx3和Nurr1在中脑多巴胺能神经元终末分化中的表达特点

目的:探讨转录因子垂体同源盒家族因子3(Pitx3)和孤儿核受体相关因子1(Nurr1)在多巴胺(DA)能神经元终末分化中的表达特点。方法:采用免疫荧光方法检测体外培养的中脑源性神经干细胞(mNSCs)诱导分化后和大鼠胚胎发育至出生腹侧中脑Pitx3、Nurr1和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果:(1)体外培养的mNSCs诱导分化48 h的Map-2阳性细胞不表达Pitx3、Nurr1和TH;分化7 d的TH阳性细胞均表达转录因子Pitx3和Nurr1;(2)在大鼠腹侧中脑黑质(SN)、腹侧被盖区(VTA)和中缝背核(DRN)可见大量TH与Pitx3(或Nurr1)共表达的神经元;(3)Pitx3和Nurr1阳性细胞主要分布于E16.5、P0大鼠SN、VTA和DRN区,其中Pitx3阳性细胞还少量分布于腹侧中脑非DA能神经元区域,Nurr1阳性细胞在腹侧中脑分布范围较Pitx3更广泛。结论:转录因子Pitx3、Nurr1在中脑DA能神经元的终末分化和生存维持中起重要作用。     

垂体同源盒家族因子3和孤儿核受体相关因子1基因在帕金森病模型大鼠腹侧中脑表达显著下调

目的:探讨垂体同源盒家族因子3(Pitx3)和孤儿核受体相关因子1(Nurr1)基因在帕金森病(PD)模型大鼠腹侧中脑的表达变化。方法:(1)采用免疫荧光方法检测PD模型组、成年正常组和假手术组大鼠腹侧中脑TH、Pitx3/TH和Nurr1/TH阳性细胞并计数;(2)分别采用半定量RT-PCR和Western Blot方法检测Pitx3和Nurr1基因在PD模型组、成年正常组和假手术组大鼠腹侧中脑转录和翻译水平的变化。结果:(1)免疫荧光检测显示PD大鼠模型组腹侧中脑多巴胺能神经元数目显著减少;(2)半定量RT-PCR和Western Blot检测显示PD大鼠模型组腹侧中脑左侧Pitx3和Nurr1表达显著下调,其中Pitx3表达下调更明显。结论:Pitx3和Nurr1基因的持续表达与腹侧中脑多巴胺能神经元的生存维持密切相关,为探索PD的病因诊断及基因治疗提供可能的新途径。     

大鼠中脑发育早期Nurr1时空模式及与TH表达的相关性

目的:观察孤儿核受体相关因子1(Nuclear receptor-related factor1,Nurr1)在大鼠胚胎中脑发育过程中的时空表达模式及与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的相关性。方法:制备大鼠胚胎E12.5、E13.5、E14.5d中脑脑片,行Nurr1/TH的免疫荧光双标记。在荧光显微镜下分别计数每个视野下TH、Nurr1单标神经元和Nurr1/TH双标神经元的数量,用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果:Nurr1/TH双标神经元在E12.5d时较少,随着发育时间的推移逐渐增加,至E14.5d时TH阳性细胞中几乎均有Nurr1的表达。结论:本研究结果进一步从形态学的角度提示转录因子Nurr1在胚胎发育过程中对中脑多巴胺(dopamine,DA)能神经元的发育起重要作用。     

PD模型大鼠黑质中Nurr1和TH的表达变化及其意义

为探讨孤儿核受体(Nurr1)在多巴胺能神经元损伤修复过程中对特异性表型酪氨酸羟化酶(TH)的影响,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠一侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病(PD)模型,分别应用Western blot和免疫组织化学技术观察不同时间点中脑黑质中Nurr1、TH蛋白表达的变化及其相关性。结果显示,Nurr1蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中即明显下降,7d后开始逐渐上升,14d接近正常水平,28d明显升高;TH蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中无明显变化,7d开始下降,14d达最低,28d开始上升。上述结果提示,在6-OHDA损伤黑质-纹状体通路后,Nurr1的表达先下降后上升,其表达变化早于TH,可能在PD模型大鼠的损伤修复中发挥重要作用。     

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。     

移植BDNF修饰骨髓间充质干细胞对帕金森病模型大鼠TH表达的影响

目的:观察移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)对帕金森病模型大鼠TH表达的影响。方法:采用电穿孔法将pIRESneo-EGFP-BDNF转染至骨髓MSCs;通过脑内注射6-OHDA制备PD大鼠模型,随机分为Sham组,PD组,MSCs组,BDNF组,经侧脑室移植MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓MSCs,术后2、4、8周,腹腔注射阿朴吗啡诱导PD大鼠旋转行为,移植BDNF修饰骨髓MSCs在大鼠脑组织内的迁移,采用免疫组化及Western blot方法测定各组大鼠中脑黑质TH蛋白表达的变化。结果:移植术后2、4、8周MSCs组和BDNF组大鼠与PD组比较旋转次数明显减少(P<0.05),以BDNF组较MSCs组比较改善更为明显(P<0.05),移植细胞干预PD模型大鼠8周后中脑黑质TH表达,BDNF组较MSCs组、PD组明显增高(P<0.05),移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓MSCs可以在PD大鼠脑内存活,并迁移至远处。结论:经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰的骨髓MSCs通过提高中脑黑质TH的活性,能够明显改善PD模型大鼠的行为能力。     

胶质细胞源性神经营养因子对培养的胚鼠脑室下区神经干细胞表达Pitx3及酪氨酸羟化酶的影响

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对培养的胚鼠脑室下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)表达Pitx3、酪氨酸羟化酶(TH)的影响。方法:取胚鼠SVZ组织,进行细胞培养。分为GDNF NSCs共培养组和NSCs单独培养对照组。用Pitx3、TH、Pitx3/TH免疫荧光单标和双标及Nestin免疫组化法进行检测。结果:共培养组5 d时形成神经球,10 d时球体积不断增大,12 d后开始贴壁生长,并向四周伸出突起并开始分化。对照组神经球明显少于共培养组。14 d共培养组Pitx3、TH、Pitx3/TH阳性细胞明显高于对照组。结论:GDNF能上调SVZ区NSCs表达Pitx3和TH,诱导NSCs向多巴胺(DA)能神经元分化。     

pitx3和nurr1基因在不同年龄大鼠不同脑区的表达变化

目的:探讨正常不同年龄SD大鼠不同脑区pitx3、nurr1基闪的表达变化.方法:使用RT-PCR、免疫印迹法和免疫荧光方法检测pitx3、nurr1基因在正常不同年龄SD大鼠不同脑区转录与翻译水平的表达.结果:RT-PCR、免疫印迹法检测显示,pitx3、nurr1基因在各年龄组火鼠中脑、大脑皮质、海马、纹状体、嗅球和下丘脑均有表达,其中在海马和中脑表达较高;在各年龄组中新生组表达最高,并随着年龄的增长表达呈下凋趋势;免疫荧光检测E16.5 d组和新生组的中脑和海马区观察到有大量Pitx3或Nurr1单标细胞和Pitx3/TH或Nurrl/TH双标细胞.结论:pitx3、nurr1基凶的表达小仅与中脑多巴胺能神经元,而且可能与儿茶酚胺类神经元的发育和生存维持有关;老年期pitx3、nurr1基因表达下降可能与脑老化和神经退行性变疾病.如帕金森病和老年性痴呆等有关.     

胚胎神经上皮干细胞脑内移植治疗大鼠帕金森病

背景：研究表明胚胎干细胞移植可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能,增强神经的可塑性,诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。 目的：观察胚胎神经上皮干细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠及移植细胞的迁徙情况。 方法：将绿色荧光蛋白转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞分别移植到帕金森病大鼠的黑质、纹状体和侧脑室内,移植后检测移植细胞的存活、迁徙与分化;利用高效液相色谱法检测实验动物脑内多巴胺神经递质的含量;对比实验动物旋转行为的改变,评估胚胎神经上皮干细胞移植对帕金森病大鼠的治疗作用。 结果与结论：移植细胞存活良好且分化出了酪氨酸羟化酶阳性细胞,向黑质纹状体环路迁徙趋势明显;脑内多巴胺含量增加,动物旋转行为改善明显。表明移植到帕金森病大鼠脑内的神经上皮干细胞多向黑质纹状体环路迁徙,且可增加脑内多巴胺神经递质的含量治疗帕金森病。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

大鼠胚胎中脑腹侧细胞和大脑皮质神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的比较

体外培养的大鼠胚胎中脑腹侧(VM)细胞和大脑皮质神经干细胞(NSCs)分别移植入帕金森病(PD)模型大鼠毁损侧纹状体。移植后2,4,8周采用脑微透析术结合高效液相色谱(HPLC)动态监测毁损侧纹状体内多巴胺水平,同期观察大鼠的旋转行为。移植后8周采用免疫组化法检测植入细胞的存活及分化情况。结果显示:移植后4,8周VM移植组多巴胺水平明显高于NSCs移植组或对照组,同期VM移植组较其余两组旋转行为有显著改善,而NSCs移植组与对照组多巴胺水平及旋转行为无显著差异。VM移植组较NSCs移植组植入的细胞易存活和分化。以上结果提示,大鼠胚胎VM细胞移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎大脑皮质NSCs。     

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的 探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响.方法 应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型.将PD大鼠随机分为3组,每组8只.假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1 基因的NSCs进行移植.细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达.移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P＞0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个.结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能.     

GDNF-pretreatment enhances the survival of neural stem cells following transplantation in a rat model of Parkinson's disease

Cell transplantation has been shown to be an effective therapy for central nervous system disorders in animal models. Improving the efficacy of cell transplantation depends critically on improving grafted cell survival. We investigated whether glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)-pretreatment of neural stem cells (NSCs) enhanced grafted cell survival in a rat model of Parkinson's disease (PD). We first examined the neuroprotective effects of GDNF on oxygen-glucose deprivation (OGD) in NSCs. Cells were pretreated with GDNF for 3 days before subjecting them to OGD. After 12 h of OGD, GDNF-pretreated NSCs showed significant increases in survival rates compared with PBS-pretreated NSCs. An apoptosis assay showed that the number of apoptotic cells was significantly decreased in GDNF-pretreated NSCs at 1 h and 6 h after OGD. A PD rat model was then established by unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA, 9 μg) into the medial forebrain bundle. Two weeks after 6-OHDA injection, GDNF-pretreated NSCs, PBS-pretreated NSCs, or PBS were injected into PD rat striatum. The survival of grafted cells in the striatum was significantly increased in the GDNF-pretreated NSC group compared with the control groups. GDNF pretreatment increased survival of NSCs following transplantation, at least partly through suppression of cell apoptosis.     

环孢菌素A结合神经干细胞移植对6-OHDA大鼠PD模型的作用

目的:观察环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)结合神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植对于6-OHDA大鼠PD模型的作用。方法:SD大鼠随机分为四组:(1)正常组;(2)模型组;(3)NSCs组;(4)NSCs+CsA组。APO诱导旋转测试、悬挂实验、自发实验观察行为学改变,高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量。移植术后1、2、4周,ELISA检测纹状体TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4的含量,免疫组化观察移植部位细胞的变化。结果:与模型组相比,移植组大鼠的旋转次数减少(P0.05),悬挂评分提高(P0.05),自发总活动度增加(P0.05),纹状体DA含量升高(P0.05),且NSCs+CsA组优于NSCs组(P0.05)。移植组的TNF-α、IL-1β三个时间点均低于模型组,且NSCs+CsA组抑制TNF-α、IL-1β的作用强于NSCs组(P0.05);移植组的IL-4、IFN-γ三个时间点均高于模型组(P0.05),但NSCs+CsA组的IFN-γ低于NSCs组(P0.05)。细胞的存活增殖迁移状态在2周时较好,4周时较差。与NSCs组相比,NSCs+CsA组的迁移细胞形态瘦长,4周时EGFP活细胞较多(P0.05)。GFAP+细胞数:NSCs+CsA组NSCs组;小胶质细胞数:模型组NSCs组NSCs+CsA组。结论:NSCs移植可改善PD大鼠行为障碍,增加纹状体DA含量,有利于营造良好的脑内微环境,加用CsA可提高其疗效。     

嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。