大鼠成骨细胞的体外培养和鉴定

目的 探讨正常新生大鼠颅骨中分离培养大批成骨细胞并进行功能鉴定。方法 将新生SD大鼠处死，无菌条件下取出颅骨，剔净后剪成1mm×1mm×1mm碎块，0．1％胶原酶Ⅱ消化15min，碎骨块接种于培养瓶中培养，通过观察细胞形态学及钙化结节、碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果 用改良组织块法分离的大鼠成骨细胞，在体外培养时可维持其在体内的功能：合成碱性磷酸酶，最终能形成矿化结节。结论 用改良组织块法进行大鼠成骨细胞培养，方便易行，可分离、培养大量高纯度成骨细胞，在体外传代后仍保留其表型特征。     

改良酶消化法培养成骨细胞的研究

【目的】采用改良胶原酶法体外培养大鼠颅骨成骨细胞。【方法】取新生24 h SD大鼠颅骨,剔净后剪成碎块。依次以0.25%胰蛋白酶-0.02?TA和0.1%Ⅰ型胶原酶消化后,培养于-αMEM培养液中。倒置显微镜下观察形态学变化,钙钴染色法检测ALP活性,茜素红染色法观察矿化结节的形成。【结果】培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性。【结论】采用改良胶原酶法培养的成骨细胞操作简便,成活率高,细胞具有典型的成骨细胞形态特征,且成分较单一。     

优化组织块法体外培养新生SD大鼠原代成骨细胞与鉴定

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较。优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%。该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法。     

SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞的原代培养与鉴定

目的：建立新生SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞培养模型。方法用新生24 h SD大鼠,分离获取髁突,去尽软骨层,获得纯尽软骨下骨。采用改良贴壁组织块反复消化法培养细胞。通过相差显微镜和HE染色观察其细胞形态,并且用碱性磷酸酶染色和钙化结节染色方法进行细胞鉴定,噻唑蓝（MTT）比色法检测其增值能力。结果细胞呈多种形态,有三角形、梭形、不规则形。碱性磷酸酶染色和钙化结节染色均呈阳性,细胞接种后1～3 d内细胞增殖缓慢,第8天达到高峰,以后增长速度逐渐减慢。结论该方法获得新生SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞能在体外稳定培养,并且细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。     

New SD rat osteoblasts by modified explant culture in vitro and identification

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较.优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%.该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法.     

松质骨成骨细胞的培养和鉴定

目的:探讨理想的人松质骨成骨细胞体外培养的方法。方法:取人髂骨松质骨,剪碎,用改良的酶消化法分离培养人成骨细胞;从细胞的形态学、增殖、碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色等方法鉴定培养的成骨细胞。结果:分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。结论:改良的酶消化法分离培养松质骨可获得大量纯度较高的人成骨细胞。     

改良大鼠成骨细胞原代培养方法的实验研究

目的获得一种操作简便、细胞数量多而纯的成骨细胞原代培养方法。方法改良I型胶原酶消化获得成骨细胞的方法,并检测成骨细胞形态、碱性磷酸酶染色、矿化结节形成。结果经改良的大鼠成骨细胞原代培养方法获得的细胞数量多,形态正常,且碱性磷酸酶分泌及矿化特性正常。结论改良大鼠成骨细胞原代培养方法是一种操作简便、细胞数量多的成骨细胞原代培养方法。     

乳鼠成骨细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的 探讨建立乳鼠成骨细胞体外培养方法 的可行性及成骨细胞的生物学特性.方法 取出生后24h内乳鼠颅盖骨,采用多次复合胶原酶消化法进行消化及体外培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,进行成骨细胞HE染色,碱性磷酸酶染色,基质钙结节染色及Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色,对大鼠成骨细胞进行鉴定.结果 所培养细胞为成骨细胞,并生长良好,HE、碱性磷酸酶染色,钙结节染色及Ⅰ型胶原蛋白染色均阳性.结论 采用复合胶原酶消化法分离培养的成骨细胞具有典型成骨细胞生物学特性,且成分较单一.     

胎兔颅骨成骨细胞克隆筛选及鉴定

目的 筛选胎兔颅骨细胞原代培养中的细胞克隆,建立成骨细胞株。方法 从胎兔颅骨组织中分离培养颅肌细胞,有此基础上,运用有限稀释法行克隆传代筛选,建立成骨细胞株,并用酶组化、免疫组化及染色体染色等方法予以鉴定。结果 原代培养的颅骨细胞来源复杂,形态多样;克隆传代筛选的细胞株,细胞形态单一,碱性磷酸酶组化染色呈强阳性,骨形态发生蛋白免疫组化染色呈强阳性,钙红染色显示具有成骨能力;染色体数目形态保持相对稳     

连续外植块法培养SD大鼠成骨细胞及鉴定

目的针对目前体外培养成骨细胞方法的不足,探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法．方法采用SD大鼠胎鼠颅盖骨培养原代成骨细胞,并收集1-3次连续植块进行培养,观察细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及钙化的变化．结果连续植块培养收集的1～3次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,细胞内碱性磷酸酶染色及矿化作用均无明显的区别．结论连续植块法用于培养SD大鼠成骨细包具有简便、经济高效的特点．     

不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律分析

目的探讨不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律,以此拟描述不同年龄人类女性个体成骨细胞内雌激素受体表达的生理曲线。方法以不同月龄雌性SD大鼠为标本,二次酶消化法收集成骨细胞并培养,倒置相差显微镜观察成骨细胞形态,钙钴法碱性磷酸酶染色、上清液碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素(OCN)检测对成骨细胞进行鉴定。结果二次酶消化法获得的成骨细胞,形态呈多边形,碱性磷酸酶染色阳性细胞染色率80%,不同培养时间的成骨细胞和成纤维细胞上清液碱性磷酸酶和骨钙素含量相比较成骨组明显高于成纤维组。结论二次酶消化法可获得较多的成骨细胞,符合成骨细胞的生物学特性,可作为成骨细胞相关研究的细胞来源。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

大鼠成骨细胞与TCP/HA支架材料复合培养的实验研究

目的　为开展骨组织工程研究 ,建立成骨细胞与支架材料的体外复合培养模型。方法　取SD新生大鼠颅骨 ,组织块法培养成骨细胞 ,形态学结合免疫细胞化学鉴定其生物学特征 ,矿化液诱导后 ,茜素红染色显示钙结节形成 ;以磷酸三钙 /羟基磷灰石 (tricalcium phosphate/hydroxyapatite,TCP/HA)为支架 ,相差显微镜下观察纤粘连蛋白对细胞在支架材料上粘附的影响。结果　培养的成骨细胞呈短梭形或多角形 ,抗碱性磷酸酶单抗染色阳性 ;矿化液诱导后 2 0d茜素红染色 ,见红色着色的钙结节 ;纤粘连蛋白能促进成骨细胞在TCP/HA支架上的粘附。结论　本实验成功地建立体外成骨细胞培养方法 ,细胞外基质活性分子的加入能促进细胞与支架材料的粘附。     

致敏淋巴细胞对兔颅骨成骨细胞功能的影响

目的 研究致敏淋巴细胞对兔颅骨成骨细胞增殖、分化的作用。方法 经酶消化法从新生兔颅骨中分离成骨细胞,进行成骨细胞的碱性磷酸酶染色及成骨能力的检测。从经铬（Cr^6 ）致敏的新西兰兔外周血分离淋巴细胞并提取其培养上清液（LCM）,并分别观察在无LCM、加未经抗原（Ｃr^6 )刺激的LCM和加经Ｃr^6 刺激的LCM等3种情况下成骨细胞增殖、碱性磷酸酶和骨钙素分泌的情况。结果 从兔颅骨分离的细胞碱性磷酸酶染色阳性,在长期培养中能够形成钙化结节。致敏淋巴细胞培养介质抑制成骨细胞的增殖、促进碱性磷酸酶的分泌,抑制骨钙素的产生。经方差分析检验均具有明显的统计学差异。结论 致敏淋巴细胞能够抑制成骨细胞的功能,可导致骨形成障碍。     

改良植块法培养原代成骨细胞

目的:应用改良植块法体外培养大鼠颅骨成骨细胞.方法:将1～3天的新生SD大鼠的颅骨剪碎、接种于培养瓶底,当成骨细胞从组织块中爬出、融合成单层,消化收集成骨细胞,组织块则继续进行培养.将分批次得到的成骨细胞进行MTT,ALP活性以及钙结节计数分析.结果:利用该方法连续分次培养出的成骨细胞.经形态学及ALP鉴定符合成骨细胞的生物学特性,MTT,ALP活性以及钙结节计数无统计学差异.结论:连续植块法培养成骨细胞,操作简便,成功率高,能持续提供细胞,满足实验需求.     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的 通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础.方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片;采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用"差速贴壁法"进行纯化.通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定.结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用"差速贴壁法"可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞.     

去卵巢大鼠成骨细胞雌激素受体表达的研究

目的 观察研究去卵巢SD大鼠成骨细胞内雌激素受体(ER)表达水平的变化规律.方法 SD雌性大鼠随机分为正常对照组和去卵巢(OVX)后第5周组、第7周组;采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠颅骨成骨细胞,进行钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色,I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞.应用半定量Western blot对各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测.结果 通过ALP染色、I型胶原免疫组化及形态学观察符合成骨细胞特征.western blot显示雌激素受体表达OVX组明显低于正常组,第7周组低于第5周组.结论 随着去卵巢后时间延长,成骨细胞表达的雌激素受体下降,骨质疏松风险变大.     

大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究

目的：建立一种成骨细胞的体外培养方法,并研究不同培养时期成骨细胞的生物学特性。方法：用成年雌性大鼠松质骨为培养细胞来源,组织块培养法和胰酶消化法相结合进行成骨细胞培养,并测定成骨细胞不同培养阶段的碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性和骨钙素（ＯＣ）分泌水平。     

人胚成骨细胞的分离培养及生物特性的研究

目的 观察体外条件下成骨细胞生物学特性，为研究骨代谢提供一种体外模型。方法取人胚胎颅骨骨膜，采用酶消化法获取成骨细胞体外培养并传代。观察细胞形态，生物特性，绘制生长曲线，并经碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞以及比较冻存前3～5代与冻存后成骨细胞的特点。结果体外培养的骨膜成骨细胞形态多为梭形和多角形与成纤维细胞相似，3～5代成骨细胞生长特点稳定，具有成骨能力，冻存后成骨细胞生存率、增殖能力明显受到影响。结论自骨膜获取人成骨细胞培养方法易形，可大量培养高纯度的人成骨细胞供研究使用，冻存细胞不易作为研究对象。     

骨质疏松大鼠成骨细胞雌激素受体与颅骨IL-10表达的相关性研究

目的探讨骨质疏松sD大鼠颅骨中IL-10的表达与成骨细胞内雌激素受体表达的相关性。方法40只SD雌性大鼠用随机数字表法随机分为对照纽20只和去势（去卵巢）组20只（去势第5周组、第7周组各10只）,用双能X线吸收法测定各组骨密度,用免疫组织化学ABC法及图像分析技术观察各组颅骨组织中IL-10表达;用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠颅骨成骨细胞,并用钙一钴法碱性磷酸酶（ALP）染色法则型胶原免疫组化染色法观察、鉴定大鼠成骨细胞。应用半定量Western blot法检测各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体。结果去势组骨密度明显低于对照组（P〈0．01）;去势组骨小梁周边IL-10阳性成骨细胞数明显少于对照组（P〈O．01）,并且染色较对照组浅。ALP染色、Ⅰ型胶原免疫组化及形态学观察符合成骨细胞特征。去势组雌激素受体表达明显低于对照组,去势第7周低于去势第5周（P〈0．01）。结论雌激素受体的表达与成骨细胞IL-10表达水平成正相关。