抗淋病奈瑟菌外膜蛋白I多克隆抗体的制备及其ELISA双抗夹心法的建立

目的 制备抗淋病奈瑟菌外膜蛋白I多克隆抗体,建立检测外膜蛋白I的双抗夹心法。方法 以淋病奈瑟菌及其外膜蛋白I作为抗原,分别免疫健康雄性家兔及雌性BALB/C小鼠,制备兔抗淋病奈瑟菌和鼠抗外膜蛋白I多克隆抗体,并采用 ELISA法检测抗体效价。结果与讨论 经ELISA证明兔抗淋病奈瑟菌多抗可与淋病奈瑟菌外膜蛋白I呈高效价反应,以此建立的ELISA双抗夹心法检测外膜蛋白I可获满意结果。     

抗淋病奈瑟菌外膜蛋白I多克隆抗体的制备及其ELISA双抗夹心法的建立

目的 制备抗淋病奈瑟菌外膜蛋白I多克隆抗体,建立检测外膜蛋白I的双抗夹心法。方法 以淋病奈瑟菌及其外膜蛋白I作为抗原,分别免疫健康性家兔及雌性BALB/C小鼠,制备兔抗淋病奈瑟菌和鼠抗外膜蛋白I多克隆抗体,并采用ELISA法检测抗体效价。结果与讨论 经ELISA证明兔抗淋病奈瑟菌多抗可与淋病奈瑟菌外膜蛋白I呈高效价反应,以此建立的ELISA双抗夹心法检测外膜蛋白I可获满意效果。     

兔抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备、纯化并鉴定兔抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65的多克隆抗体。方法日本大耳兔多次免疫重组蛋白AP65．间接ELISA法检测抗体效价，用饱和硫酸铵法和nprotein Asepharose4FF柱纯化多克隆抗体，Western blot检测免疫反应性。结果第3次加强免疫后，间接ELISA法检测血清效价达到1：25600，用硫酸铵法纯化多克隆抗体纯度为56％，而后采用亲合层析柱nprotein Asepharose 4FF再次纯化。纯度达到80％。Western blot鉴定兔抗重组蛋白AP65多克隆抗体能识别重组蛋白AP65。结论成功制备了高效价、高纯度的抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65多克隆抗体。     

Em18重组抗原特异性抗体的制备及对循环抗原检测的初探

目的 用Em18重组抗原ReEm18制备特异性抗体,建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中的循环抗原.方法 ReEm18经亲和纯化,免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,分别制备单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗).用获得的单抗和多抗建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中Em18循环抗原.结果 免疫兔血清抗ReEm18抗体效价达1∶204 800以上.经ReEm18和多房棘球蚴病(AE)患者血清及健康人血清阻断ELISA试验双重筛选融合细胞,共获得14株抑制率＞50%的特异性阳性细胞克隆.将特异性单抗和多抗自由组合进行双抗体夹心ELISA,结果以9号单抗与多抗的配对检测抗原为最优,检测ReEm18的灵敏度达3 ng/m1.用建立的双夹心ELISA方法检测血清,11份AE血清中6份为阳性.结论 获得针对ReEm18的特异性单抗和多抗,建立了敏感的双抗体夹心ELISA方法,血清学初步检测结果表明AE血清中存在可检测的Em18循环抗原.     

鼠抗人肥大细胞羧肽酶截短体抗体的制备与鉴定

目的 建立检测人肥大细胞羧肽酶(hMCCP)的双抗体夹心ELISA法,以hMCCP截短体免疫小鼠,制备鼠源性多克隆抗体.方法 PCR法扩增hMCCP-N118基因片段,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌Rosseta(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用Ni2 -NTA凝胶亲和层析纯化目的 蛋白.用纯化重组蛋白免疫小鼠,制备抗hMCCP-N118抗体.间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 hMCCP截短体在大肠杆菌中高效表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗hMCCP-N118抗体,效价达1∶6 400,该抗体能特异结合hMCCP.结论 成功地制备了效价高、特异性好的鼠抗hMCCP截短体抗体.     

兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体。方法用经Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白(rMSHA)免疫日本大耳兔,收集免疫兔血清。Western Blot检测重组蛋白的免疫原性;ELISA测定该抗体的效价。结果兔抗rMSHA抗体能与重组蛋白发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶25 600。结论成功地制备了兔抗rM-SHA抗体,该抗体能够识别原核表达的重组蛋白rMSHA,为研制霍乱弧菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

水疱性口炎病毒纯化抗原制备多克隆抗体的检测结果分析

目的水疱性口炎病毒纯化抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,免疫学方法检测其结果分析比较。方法纯化的抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,采用双向琼脂扩散试验,间接ELISA方法和中和试验测定效价。结果兔抗VSV多克隆抗体最高效价双向琼脂扩散试验为1∶32,间接ELISA法为1∶640,中和试验为1∶256。结论试验结果分析比较表明,建立纯化抗原制备的兔抗VS多克隆抗体,中和试验特异性好、敏感性高,可做为VSV的血清学检测和流行抗学调查抗供技术保障。     

抗人胃癌相关蛋白GCRG213多克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的 制备胃癌相关蛋白GCRC213的多克隆抗体. 方法在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗GCRG213的抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和止常组织中的表达. 结果在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为29 400的thioredoxin/GCRG213融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备兔抗GCRG213抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1:256 000.Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG213蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织. 结论兔抗GCRG213抗体的成功制备,为进一步研究GCRG213的牛物学功能及其在胃癌发牛发展中的作用奠定了基础.     

夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原的研究(英文)

目的建立以多抗为捕获抗体和单抗为检测抗体的夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原。方法利用杂交瘤技术制备抗旋毛虫单抗;旋毛虫抗原免疫家兔,分离纯化兔血清,制备兔抗旋毛虫多抗。多抗作为捕获抗体包被酶标板,单抗为检测抗体,选择适宜多抗和单抗浓度,建立夹心ELISA方法,再利用亲和素和生物素的高结合力连接起标记了生物素的抗体和DNA片段,将抗原抗体特异反应的免疫技术同无限扩增DNA片段的基因检测技术结合,利用PCR反应对DNA片段的扩增能力,提高检测灵敏度。结果制备了兔抗旋毛虫多抗,间接ELISA法筛选出与多种寄生虫抗原无交叉反应的单抗F4C6,夹心ELISA检测旋毛虫抗原最低浓度为0.05μg/ml,免疫PCR方法检测最低浓度为0.1ng/ml。结论首次建立夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法,检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法104倍。     

淋病奈瑟菌候选外膜蛋白的免疫原性及膜定位的初步研究北大核心CSCD

目的对淋病奈瑟菌FA1090全基因组外膜蛋白进行免疫原性和膜定位的初步分析,以评价其作为候选疫苗的潜力。方法采用基因合成的方法构建重组质粒,转化感受态细胞,利用大肠杆菌表达系统对重组蛋白进行诱导表达,通过镍柱层析法纯化重组蛋白;用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,通过间接ELISA检测抗体效价初步评价蛋白的免疫原性及其在外膜的定位。结果构建了15个重组质粒,获得了相应的纯化蛋白,通过免疫小鼠获得了免疫血清。免疫原性分析蛋白WP_003689500.1诱导小鼠产生相应IgG抗体的能力较强,膜定位分析显示有4个蛋白在外膜表达的可能性较高。结论蛋白WP_003689500.1诱导产生的抗体效价较高,与全细胞抗原的结合能力较强,可作为淋病奈瑟菌候选疫苗。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.     

单增李斯特菌P60单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备并筛选单增李斯特菌P60特异性单克隆抗体,初步建立其快速检测方法。方法 以体外表达并纯化的李斯特菌P60蛋白为抗原免疫Balb/c 小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗李斯特菌P60的McAb,鉴定其抗体亚型,并对单抗的腹水效价、稳定性及亲和力进行分析。用纯化的单克隆抗体包被酶标板,结合生物素化处理的P60多克隆抗体,夹心ELISA筛选单增李斯特菌特异性单抗,并以重组P60为标准品,建立标准曲线。结果 获得了4株可稳定分泌P60单克隆抗体的杂交瘤细胞株。ELISA检测表明,筛选的6C2单克隆抗体株可特异性与单增李斯特菌(4b)P60反应。结论 建立的夹心ELISA方法可对单增李斯特菌进行特异性鉴别和定量检测。     

淋病奈瑟菌全基因组中外膜蛋白的筛选及其表位分析

目的利用生物信息学软件从淋病奈瑟菌全基因组数据中筛选外膜蛋白候选抗原,并对候选抗原进行T细胞和B细胞表位分析,为淋病奈瑟菌疫苗和分子诊断制剂的研制奠定基础。方法对淋病奈瑟菌标准菌株FA1090基因组数据库中推定的2 002个编码蛋白,用SingnalP和PrediSi软件预测信号肽。在具有信号肽的蛋白序列中以TMHMM和Phobius软件为主预测跨膜螺旋结构并构建ORF-TMH外膜蛋白库;利用PSORTb和Cell-Ploc软件进行蛋白表达的亚细胞定位分析,得到ORF-SCL外膜蛋白库。综合"双库"的结果,筛选最有可能表达在淋病奈瑟菌外膜的候选外膜蛋白抗原库。利用BLASTp筛除同源性较低的外膜蛋白;运用ABCpred和BepiPred分析B细胞表位;运用NetCTLpan和SYFPEITHI分析CTL表位;运用SYFPEITHI和NetMHCIIpan分析Th表位。结果预测有信号肽的蛋白序列共350个,"双库"筛选出30个最有可能表达在淋病奈瑟菌外膜的蛋白。通过同源性分析、T细胞表位和B细胞表位分析,得到26个蛋白序列为最有潜力的候选疫苗抗原。结论从淋病奈瑟菌标准菌株FA1090全基因组数据中反向筛选出26个最有可能成为外膜蛋白的候选抗原,为淋病奈瑟菌疫苗的研究奠定了基础。     

抗HIV-1 gp41单克隆抗体的制备及意义

目的为HIV-1感染的检测和研究提供依据。方法以基因工程重组抗原HIV-1 gp41蛋白免疫BALB／c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备抗gp41蛋白的单克隆抗体（mAb）,用ELISA法鉴定所得mAb的Ig亚类、效价及特异性。单抗经饱和硫酸铵（SAS）纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测gp41蛋白的最佳配伍单抗,分别包被ELISA板及作为酶标mAb,建立双mAb夹心ELISA法。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了12株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验,选出2株mAb：7D4和9G2-HRP建立了双mAb夹心ELISA法,检测HIV-1 gp41抗原的灵敏度是1μg/L。结论获得12株效价高的抗HIV-1 gp41的mAb,建立了特异性强、灵敏度较高的检测HIV-1 gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

抗极低密度脂蛋白受体多克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗极低密度脂蛋白受体的多克隆抗体，以极低密度脂蛋白受体配体结合域上特定片段的合成肽免疫新西兰家兔，收集免疫前后动物的血清，通过酶联免疫吸附法及免疫印迹法对血清中抗体进行分析和鉴定。结果发现，已获得高效价的抗极低密度脂蛋白受体血清，可利用免疫印迹法检测人、鼠组织和细胞中的天然极低密度脂蛋白受体及其亚型的蛋白。此结果提示，抗极低密度脂蛋白受体多克隆抗体的制备为从蛋白水平研究极低密度脂蛋白受体提供了有效的工具。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及应用于致病性钩体免疫血清的检测

目的选取钩端螺旋体黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于致病性钩体检测的纯化重组蛋白。方法用PCR法扩增黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因,与表达载体pET-30a连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,免疫印迹(WB)鉴定活性后用电洗脱法进行纯化。将纯化的重组蛋白用间接和夹心ELISA法应用于22株兔免疫血清的检测,检测结果与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较。结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,WB结果显示重组蛋白具有免疫活性。纯化的重组蛋白对15株钩体标准致病株兔免疫血清全部检出,对7株腐生性钩体株兔免疫血清全部未检出,与MAT检测结果相符。结论黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于致病性钩体血清抗体的检测,为研制致病性钩体抗体检测试剂奠定了基础。     

弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备 纯化 及其在亚细胞定位中的应用

目的 制备并纯化弓形虫微线蛋白16（TgMIC16）兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法 利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹（Western blotting）分别检测抗体效价和抗体特异性。用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维（HFF）细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光（IFA）检测TgMIC16 在感染细胞中的定位。结果 间接ELISA 结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1∶512 000;Western blotting 结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体。结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位。     

淋球菌疫苗相关抗原研究的最新进展

世界范围内出现了淋病奈瑟菌对一线治疗抗菌药物低敏或耐药的情况,同时淋病患病率呈逐年上升的趋势,这些都促使研究人员越来越重视淋球菌疫苗的研发。目前尚未成功研制出能有效防治淋病的疫苗,但最新的研究首次发现一种针对脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡的疫苗能大幅降低淋病的发病率。菌毛蛋白、转铁蛋白、脂寡糖、奈瑟菌表面蛋白A和外膜囊泡,是目前淋球菌疫苗制备研究的热点。综述将介绍该领域的研究进展。     

猪FMDV受体整联蛋白β1亚基LBD多克隆抗体的制备和初步应用

目的表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β1亚基配体结合域β1LBD,制备兔抗β1LBD多克隆抗体检测β1p-CHOK1细胞β1亚基的表达。方法利用PCR方法扩增整联蛋白β1LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后与pGEX-4T-1原核表达载体相连,构建的pGEX-β1LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA和Western blot方法分别鉴定抗体的效价和特异性,并用制备的抗体以间接免疫荧光抗体法对β1p-CHOK1细胞中β1亚基的表达进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析显示阳性菌经诱导后表达一Mr约为42000的GST-β1LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β1LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性,间接免疫荧光显示β1p-CHOK1细胞β1亚基表达于其细胞表面。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗猪源整联蛋白β1LBD多克隆抗体,为深入研究猪源整联蛋白β1在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。     

抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定

目的 研制抗弓形虫水通道蛋白(TgAQP)的特异性多肽抗体,并应用于检测弓形虫ME49株中水通道蛋白的表达和亚细胞定位。方法 根据TgAQP氨基酸序列设计B细胞抗原多肽,并将合成的多肽与KLH偶联作为免疫原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA、Western blot和免疫荧光的方法对所得抗体进行鉴定。结果 选定并合成抗原表位多肽,与KLH偶联作为免疫原制备多克隆抗体;经ELISA测定其多肽抗体效价达1∶40 000; Western blot表明制备的抗体能特异地识别天然弓形虫中29.9 kDa处的条带,与预测的TgAQP相对分子量大小相符;免疫荧光检测到抗血清识别的蛋白定位于弓形虫胞质中。结论 制备了抗弓形虫水通道蛋白多肽的多克隆抗体,为进一步研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点奠定了基础。