异基因脂肪源Flk1^＋CD31^-CD34^-细胞移植后形成稳定的嵌合体并诱导免疫耐受

目的研究器官移植中脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性。方法以CM-D iI荧光染料示踪脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞的体内分布情况,并以PCR方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定;以皮肤移植实验观察脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞可进入并较长期(30d)存在于异基因小鼠免疫器官内;在细胞移植组小鼠脾脏中可检测到供者来源T细胞占受者脾细胞的6.68%;脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠供者来源皮肤移植物存活(90d,未处理组平均为10d。结论异基因脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌合体,并诱导特异性免疫耐受的产生。     

异体脂肪源间充质干细胞移植后稳定嵌合体的形成及免疫耐受的诱导

目的研究器官移植中脂肪源F1k1＋CD31—CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性。方法以CM—DiI荧光染料示踪脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞的体内分布情况，并以PCR方法检测Y染色体的存在以进-步鉴定；以皮肤移植实验观察脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞可进入并较长期（30d）存在于异基因小鼠免疫器官内；在细胞移植组小鼠脾脏中可检测到供者来源T细胞，占受者脾细胞6．68％；脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植组小鼠供者来源皮肤移植物存活〉90d，未处理组平均为10d。结论异基因脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌和体，并诱导特异性免疫耐受的产生。     

小鼠脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞促造血恢复作用观察

目的:观察小鼠成体脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞体内外能否促进造血恢复.方法:用小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞作滋养层,接种造血细胞,观察培养后1～4周造血细胞数及粒-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)的变化,并设对照组.30只经137Cs全身照射0.35 Gy的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,空白对照组尾静脉注射生理盐水,对照组注射骨髓有核细胞,实验组注射骨髓有核细胞及脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,注射后均检测外周血和骨髓有核细胞数及CFU-GM变化,PCR检测受体小鼠体内Y染色体的表达.结果:体外实验中实验组接种后2～4周造血细胞数均高于对照组(P均＜0.05),接种后1～4周CFU-GM值均高于对照组(P均＜0.05);体内实验中空白对照组小鼠移植后10 d左右死亡,实验组小鼠外周血和骨髓有核细胞数、CFU-GM从第2周起均高于对照组(P均＜0.05),第4周实验组小鼠骨髓细胞有Y染色体表达.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能促进小鼠造血恢复.     

成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞血液血管干细胞特性观察

目的:检测脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞是否具有血液血管干细胞的特性.方法:将脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞分别于血管内皮及造血细胞诱导培养体系中培养,采用RT-PCR、免疫组织化学方法检测分析其生物学特性.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在内皮细胞诱导体系中可分化为CD31 /vWF 细胞,在基底膜胶中可形成血管样结构;在造血诱导培养体系中可定向分化为表达GATA-1、GATA-2、β及γ珠蛋白的细胞,在甲基纤维素造血培养基中,这类造血细胞可定向分化为红系集落单位.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在体外可同时向血管内皮细胞和造血细胞分化,具有血液血管干细胞的特性.     

成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞观察

目的:体外定向诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化.方法:首先将成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、bFGF及EGF等因子的培养基(诱导液1)中诱导6 d,接着更换诱导培养基,用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基(诱导液2)诱导细胞向胰岛样细胞分化,诱导前后用RT-PCR法检测细胞nestin、神经元素3(ngn3)、胰岛素启动因子1(IPF-1)、胰岛素、胰高血糖素基因的表达;免疫组织化学法检测nestin、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素抗原的表达;放射免疫分析法检测细胞胰岛素分泌情况.结果:成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞经诱导液1诱导6 d后可分化成nestin 的祖细胞;继续用诱导液2诱导6 d后变圆的细胞逐渐增多,并聚集成团,免疫荧光结果证实经2阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素,放射免疫分析结果表明诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素.结论:成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞具有胰腺干、祖细胞的固有特征,极有可能作为种子细胞用以糖尿病的细胞治疗.     

非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷小鼠体内成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞的多向分化

目的:探讨成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞用于移植的可能性.方法:将男性成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞按106个/只剂量经尾静脉输入10只6～8周龄、接受亚致死剂量射线照射的非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内(实验组),对照组10只输注等体积的RPMI 1640培养基,2个月后处死动物,检测植入情况.结果:在实验组小鼠体内,脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞不仅有助于造血重建及体内微血管损伤的修复,参与血管新生,还能分化为消化道上皮细胞;而对照组小鼠则在2周内全部死亡.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞极有可能成为一种理想的种子细胞用于移植.     

异基因骨髓间充质干细胞逆向嵌合体诱导小鼠皮肤移植耐受研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导移植免疫耐受的可行性,建立小鼠异种逆向嵌合皮肤移植模型.方法 以GFP-C57BL/10雄鼠为BMSCs供者,选择免疫缺陷型BALB/C-nu/nu雌鼠为BMSCs受者,移植BMSCs,建立骨髓嵌合模型;通过RT-PCR检测Y染色体性别决定区基因(SRY)、免疫组化检测GFP蛋白表达量,确定嵌合产生的最佳时间.实验共分3组:将接受BMSCs移植一定时间后的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(实验组),将未接受BMSCs移植的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(排斥组),C57BL/10小鼠间进行同种异体皮肤移植(对照组).观察移植皮肤存活情况,检测存活皮肤的血管形成情况,以此探讨逆向嵌合皮肤移植的可行性.结果 成功建立骨髓嵌合模型,用1×106 BMSCs移植后4周,SRY基因和GFP蛋白的表达量最高,分别为1.22±0.10、458.0±3.4,与移植后1周、2周和6周比较差异均有统计学意义(P＜0.05),说明嵌合产生的最佳时间为移植后4周.实验组小鼠供者来源皮肤移植物存活＞14 d,排斥组平均为5d.结论 BMSCs移植后可形成嵌合体,并可逆向嵌合移植诱导异种小鼠皮肤移植耐受.     

重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞寿命及其成骨细胞潜能的影响

目的:观察重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的寿命及成骨潜能的影响.方法:将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因通过脂质体转染法导入成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,RT-PCR检测转染细胞hTERT mRNA的表达,TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性.Von-Kossa染色及RT-PCR检测已重建端粒酶活性的脂肪源细胞向成骨细胞分化的潜能.结果:转染hTERT的成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能稳定表达端粒酶活性.转染后第75代的细胞仍维持着自我更新及向成骨细胞分化的潜能,且无恶性转化倾向.结论:重建端粒酶活性可延长成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞寿命,并维持其自我更新及成骨潜能.     

异基因外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测

目的：建立荧光标记的多重扩增短串联重复序列（STR）结合毛细管电泳定量检测异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）供受者嵌合体的方法,并探讨嵌合体形成与免疫耐受及临床预后的关系。方法：采用PE9700扩增仪扩增15个STR位点：D8S1179、D21S11、D7S820、D3S1358、CSFIPO、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VwA、TPOX、D18S51、D5s818、FGA位点和1个性别位点Amelogenin,应用3130XL型DNA测序仪对35例异基因外周血干细胞移植患者上述位点进行基因型分析,并比较供受者移植前后的基因型,确定嵌合体的形成类型,以作为异基因造血干细胞移植中的植活证据,同时用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究。结果：（1）其中32例在15个STR位点中均至少有两个可以区分供受者的有信息位点（有3例无移植前受者标本）,35例患者均在移植后1个月时STR位点及性别位点转为供者型,形成了完全供者嵌合体（CC）,且HLA单倍体相合的15例患者也达到了100％的供者植入,并在随访过程中持久不变。（2）扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显著直线相关（P〈0．01）,最小检出DNA百分比为5％。结论：（1）用基因分析仪对STR位点进行基因型检测具有快速、无污染和自动化高、可定量及灵敏度高等优点,用于检测allo—PBSCT植活状态是可靠的。（2）诱导免疫耐受的方法可以成功地诱导CC的形成。     

异基因造血干细胞移植中嵌合体的STR-PCR定量检测

目的:研究异基因造血干细胞移植后供者单个核细胞、CD3+T细胞、CD15+粒细胞植入情况。方法:采集22例清髓性外周血干细胞移植患者移植前及移植后不同时间的骨髓标本,应用免疫磁珠进行CD3+T细胞、CD15+粒细胞分选,常规提取DNA,PCR扩增后,进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,计算供者嵌合率。结果:22例患者均在中位时间+12d(+9d～+15d)造血恢复。骨髓单个核细胞在+7d时供者嵌合率为70%,+14d供者嵌合率均超过90%,+21d和+28d供者嵌合率均超过95%以上。CD15+粒细胞在+7d时嵌合率为40%,在+14d、+21d和+28d供者嵌合率>95%。CD3+T细胞在+7d、+14d、+21d和+28d供者嵌合率分别为65%、80%、84%和90.9%。移植后早期完全嵌合组急性GVHD发生率高于混合嵌合组。结论:在+28d3群细胞均可达到供者完全嵌合状态。定量检测对判断早期植入、预测复发,指导临床干预治疗具有重要意义。     

异基因造血干细胞移植后嵌合状态的追踪监测

目的:应用荧光标记短串联重复序列(STR)复合扩增技术,探讨多个STR基因座在异基因造血干细胞移植后嵌合体状态评估中的作用.方法:对31例移植后患者进行追踪检验,分别PCR复合扩增各病例组常染色体9个STR基因座和Amelogenin基因座,扩增产物经DNA自动分析仪分离后,GeneScan扫描,Genotyper分型.结果:7例患者血由第1次检验结果与供者STR分型一致变为混合型,4例死亡,3例复发;4例患者血由第1次检验结果与供者一致变为受者自身型,均死亡;1例患者血由混合型变为与供者STR分型一致,无复发;1例患者血两次检验均为混合型,已死亡;其余18例患者血均与供者血STR分型一致,其中16例目前预后较好,2例已死亡.结论:复合扩增STR基因座具有较高的个体识别力,检测灵敏、准确、快速,在对异基因造血干细胞移植患者的植入情况进行动态检测的研究中有用,对移植物植入或被排斥、疾病复发均有预警作用,同时必须结合临床症状,及时地进行STR检测,以便于早期实施临床干预治疗.     

STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用

目的:应用短串联重复序列-聚合酶链反应(STR-PCR)半定量方法检测异基因造血干细胞移植后供者细胞比例并探讨其临床意义。方法:给30例接受移植的患者行移植后嵌合体检测,采集外周血提取DNA,对9个STR位点行聚合酶链反应扩增,扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影,再计算嵌合率。结果:30例患者均检测到供者细胞,24例达到完全嵌合(CC),6例形成混合造血(MC)。在移植后14 d,稳定植入的患者多数表现为CC。CC组的aGVHD发生率高于MC组,7例患者在复发前检测到嵌合率(donor cell,DC)下降,经相应免疫治疗后有3例达到CC。结论:监测异基因造血干细胞移植后嵌合率的动态变化过程,PCR-STR是一种简单经济的方法,可根据嵌合状态指导个体化免疫治疗,对患者的长期存活有重要意义。     

Ferumoxide标记Flk1＋＋CD31＋-CD34-人骨髓间充质干细胞及其在食蟹猴脑内移植示踪观察

目的探讨Ferumoxide-PLL标记Flk1 CD31-CD34-人骨髓间充质干细胞(hBMSC)的方法及其在食蟹猴脑实质内移植活体示踪的可行性。方法采用Ferumoxide-PLL标记hBMSC,台盼蓝染色、普鲁士蓝染色和透射电镜扫描鉴定标记效率及细胞活力。体外磁共振成像(MRI)分别扫描标记和未标记细胞,计算T2*的弛豫时间和弛豫率(R2*)变化。通过立体定向手术将标记的hBMSC移植入食蟹猴右侧基底节区,采用MRI扫描活体示踪细胞。采用免疫组织化学、普鲁士蓝和HE染色对脑组织切片进行干细胞存活、分化及病理学研究。结果Ferumoxide-PLL标记hBMSC效率为96%,普鲁士蓝染色、电镜可显示标记hBMSC细胞质内铁颗粒。1×106和5×105两组Ferumoxide-PLL标记细胞的T2*的弛豫时间分别为68.86和79.88ms,而未标记细胞分别为12.71和15.24ms。标记细胞的R2*分别为78.68和65.61/s,分别是未标记细胞(14.52和12.52/s)的5.4和5.2倍。移植后3周MRI扫描T2WI仍可发现hBMSC呈明显的低信号。病理及免疫荧光结果显示hBMSCs在移植区大量存活,移植区有大量新生血管,但未见hBMSC向神经细胞分化。结论Ferumoxide-PLL可高效标记hBMSC,能显著增加其MRI图像对比度。MRI可活体示踪干细胞。移植入食蟹猴脑内的hBMSC可大量存活并促进新生血管形成。