Expression profile of a novel germ cell-specific gene,TSCPA, in mice and human

In order to identify novel genes involved in spermatogenesis, testis cDNA samples from Balb/C mice of different postnatal days were hybridized with the whole mouse genome Affymetrix chip to screen the testis-specific genes. The characteristics of the selected genes were analyzed by RT-PCR as well as other bioinformatic tools. A novel differentially expressed testis-specific gene （GenBank Accession No： NM_029042） in the developmental stages of testes was identified, and named TSCPA. Cellular mapping prediction of TSCPA indicated that its protein was probably expressed in nuclei, and one putative domain （aa 332 377） was anchoring domain of cAMP-dependent type Ⅱ PK. The result of subcellular localization of GFP-TSCPA fusion protein in Cos-7 cells showed that TSCPA protein was expressed in nuclei. RT-PCR analysis revealed that TSCPA was expressed specifically in mouse and human testis. TSCPA gene was expressed weakly in 21-day-old mouse testis and the expression was increased gradually from 38th day to 6th month of mouse testes. No expression of hTSCPA was found in cryptorchidism and Sertoli-cell-only syndrome patients. It was concluded that the expression profile of TSCPA in human and mice indicated that TSCPA might play an important role in spermatogenesis.     

人受精促进肽受体(TCPllc)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCPll基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCPlla同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入pGEM-T easy载体并测序;采用BLAST、ClustalW及RT-PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT-PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCPlla、b相比,在基因组的5′-端存在复杂的外显子剪接现象。RT-PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc, 结合mTcp-11的功能提示,TCPll基因a、b、c这3种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

小鼠睾丸组织特异表达基因Rnf148的鉴定及其编码E3泛素连接酶的功能分析

目的 研究小鼠Rnf148基因表达的时空特异性及其环指结构域的E3泛素连接酶功能。 方法 提取不同成年小鼠组织、不同胚胎期组织和出生后小鼠睾丸组织的总RNA,通过实时荧光RT-PCR和Northern杂交分析小鼠Rnf148基因的表达谱。构建包含整个Rnf148蛋白的环指结构域与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的融合蛋白原核表达载体,在BL21细菌中诱导表达后,经GST琼脂糖凝胶纯化GST-Rnf148重组蛋白。体外泛素化反应试验检测GST-Rnf148重组蛋白的E3泛素连接酶功能。 结果 在小鼠13种不同器官组织中,Rnf148 mRNA仅存在于睾丸组织中。进一步Northern杂交验证了只在小鼠睾丸组织表达一个1.2 kb左右的Rnf148基因mRNA片段。小鼠Rnf148基因在胚胎期及出生后3周内不表达,出生后21 d开始表达,25 d后达到表达高峰并一直持续表达。实验成功诱导表达并纯化了GST-Rnf148重组蛋白,体外蛋白泛素化反应显示该重组蛋白具有E3泛素连接酶的功能。 结论 小鼠Rnf148基因特异地表达在出生3周后的睾丸组织中,Rnf148蛋白的环指结构域具有泛素连接酶活性。     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-...     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

应用基因芯片技术筛选小鼠组织细胞肉瘤L-Ⅱ转移相关基因

目的应用基因芯片技术对小鼠组织细胞肉瘤L-Ⅱ高侵袭转移瘤株和母瘤株的基因表达谱进行对比分析并筛选出差异表达基因,以期从基因水平上探讨肿瘤的转移机制。方法L-Ⅱ瘤细胞接种小鼠胁部皮下,取其肺转移灶制成细胞悬液接种另一小鼠体内,再取其肺转移灶传代,如此数代后,建立L-Ⅱ肺高转移模型,筛选出L-Ⅱ高侵袭转移瘤株。用基因芯片检测筛选前后的L-Ⅱ瘤株表达有差异的基因,并用RT．PCR对部分差异表达基因进行分析鉴定。结果用体内转移灶连续传代法筛选小鼠组织细胞肉瘤L-Ⅱ至第9代,筛选出L一Ⅱ高侵袭转移瘤株。用肿瘤转移基因芯片杂交筛选出传代前后L-Ⅱ瘤细胞的差异表达基因共21个,其中上调基因17个．下调基因4个。对其中有代表意义的基因,如Kras．2、IGF-1、MMP．10、Brms．1进行RT-PCR验证,结果证实所选基因在筛选前后瘤细胞中的表达差异均有统计学意义,与基因芯片的表达情况一致。结论小鼠组织细胞肉瘤L-Ⅱ的侵袭转移是一个涉及Kras．2、IGF．1、MMP．10、Brms-1等重要基因和其他相关基因等多个基因共同参与的复杂过程。     

人TCP11L2和鼠Tcp1112基因的定位及表达的初步研究

目的观察人TCP11L2和鼠Tcp1112基因在细胞中的表达及定位和Tcp1112基因的表达谱研究。方法用RT-PCR法从正常人和鼠睾丸组织中分别扩增得到人TCP11L2基因和鼠Tcp1112基因的开放读码框全长cDNA并定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中,构建了pEGFP-TCP11L2和pEGFP-Tcp1112融合基因表达载体,然后以脂质体介导转入MDCK细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的表达情况;RT-PCR检测鼠Tcp1112基因在组织中的表达情况。结果在转染重组真核表达载体pEGFP-TCP11L2、pEGFP-Tcp1112的MDCK细胞中,荧光主要集中在细胞核外区域,而在转染空白载体pEGFP-N1的细胞中,荧光布满整个细胞;RT-PCR检测鼠Tcp1112为多组织表达。结论人TCP11L2和鼠Tcp1112蛋白能在MDCK细胞中高效表达,表达的蛋白定位在细胞核外区域,鼠Tcp1112的多组织表达提示该基因与鼠Tcp11基因功能的不同。     

小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体。方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析。结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸。结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段。成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础。     

人受精促进肽受体(TCP11c)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCP11基因1个新的转录本TCP11c的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCP11c基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCP11a同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入p哪M—TeMy载体并516序;采用BLAST、ClustalW及RT—PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT—PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCP11a、b相比,在基因组的5′—端存在复杂的外显子剪接现象。RT—PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肤受体TCP11基因1个新的转录本TCP1c,结合mTcp-11的功能提示,TCP11基因a、b、c这3种转录本对精于发生和人受精过程可能起重要作用。     

八氯代二苯并二噁英对小鼠睾丸组织基因表达谱的影响

目的探讨八氯代二苯并二噁英（OCDD）对雄性小鼠睾丸基因表达谱改变的影响。方法20只雄性CBL/6j小鼠,随机分
为对照组（玉米油）、OCDD低剂量组（1.25×10-6 g/mL）、中剂量组（1.25×10-5 g/mL）和高剂量组（1.25×10-4 g/mL）,每天灌胃1次,
连续灌胃30 d后睾丸取材,应用基因芯片技术比较不同浓度OCDD染毒组和对照组雄性小鼠睾丸基因表达差异。结果与对照
组相比,低剂量组和对照组差异基因总数1 133个,上调659个,下调474个;中剂量组和对照组差异基因数978个,上调487个,
下调491个;高剂量组和对照组的差异基因数895个,上调424个,下调471个。结论亚慢性OCDD暴露后对小鼠的睾丸相关基
因表达造成影响,提示睾丸可能是OCDD 毒性作用的靶器官。
     

GasderminA3基因突变对小鼠毛囊β-catenin表达的影响

目的探讨GasderminA3(GSDMa3)基因突变前后β-catenin在毛囊中表达的变化。方法采用免疫组化S-P法、RT-PCR、Western blot等方法,检测出生后11d(毛囊生长期)、16d(毛囊退化早期)、18d(毛囊退化晚期)、24d(毛囊静止期)等各个时相点的GSDMa3基因突变鼠和C57BL/6(B6)鼠背皮毛囊β-catenin的表达表化。结果GSDMa3基因突变鼠和B6鼠β-catenin的表达均从11～24d逐渐减弱,但GSDMa3基因突变鼠β-catenin的表达在各个时期均强于B6鼠。在生长期,β-catenin表达于内外根鞘和毛母质细胞中,在GSDMa3基因突变鼠的表达强于B6鼠;在退化期,β-catenin主要表达于外根鞘和毛母质细胞中,在突变鼠的表达更强于B6鼠;在静止期,β-catenin主要表达在突变鼠的外根鞘细胞中,而在B6鼠的毛囊中表达很少。结论GSDMa3基因可能通过调节β-catenin的表达,影响毛囊的生长和发育。     

人巨细胞病毒感染对小鼠脑组织同源盒基因表达的影响

目的研究小鼠脑组织同源盒基因（homeobox gene,Hox）的表达状态及人类巨细胞病毒（human cytomegalovims,HCMV）感染对小鼠脑组织Hox基因表达的影响,以探讨HCMV致畸的分子机制。方法昆明系小鼠48只,随机分为实验对照组（16只）和病毒感染组（32只）,病毒感染为脑内注射。在感染后7、15、30、60d分别以病理学方法观察病理损伤,以免疫组化方法检查HCMV—LA（1ateantigen）,PCR检测小鼠脑组织中HCMV—DNA。在建立HCMV脑部感染的小鼠模型基础上,用RT-PCR测定Hox基因在病毒感染组和实验对照组小鼠脑组织中的表达,并用同位素标记的cDNA探针进行Northern-blot检测相应的表达状况。结果（1）接种HCMVAD169株的小鼠脑组织发生了病理改变,免疫组化和PCR方法在神经细胞内查到了HCMV-LA和DNA;（2）RT-PCR和Northern-blot发现：对照组的小鼠脑组织表达Hox-A9、Hox-A11、Hox-A12和Hox-A13,但不表达Hox-B13;HCMV感染后,小鼠脑组织被诱导表达Hox-B13,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,且于感染后的30d达到高峰,而Hox—A9、Hox—A11的表达下调（P〈0.05）;Hox—A10和Hox—A13的表达增强。结论HCMVAD169株可感染小鼠神经系统。HCMV感染可诱导小鼠神经系统发育基因Hox表达改变,这对研究HCMV感染致畸的分子机制提供了有价值的理论依据。     

Identification and expression of a novel human testis-specific gene by digital differential display

Background Evidence for the importance of genetic factors in male infertility is accumulating. This study was designed to identify a novel testis-specific gene related to spermatogenesis by a new strategy of digital differential display (DDD).Methods Based on the generation of expressed sequenced tags (ESTs), comparing the testis libraries with other tissue or cell line libraries by the DDD program, we identified a new contig of the ESTs which were derived from testis libraries and represented a novel gene. Multi-tissue RT-PCR was performed to analyse its tissue-specific expression. The full-length cDNA of the new gene was obtained using the BLAST program. Sequencing was performed and the result was analysed. Semiquantitative RT-PCR and Northern blot analyseis of mRNA from differential normal tissues were performed to clarify the expression pattern of the new gene. The sequence of the opening reading frame was integrated into the pQE-30 vector expressed in Escherichia coil strain M15(pREP4). With IPTG induction, the target protein was detected.Results A full-length cDNA sequence of the new gene named SPATA12 (GeneBank accession number AY221117) in human testis was identified. SPATA12 was 2430 bp in length, located in chromosome 3p21.1-3p21.2. The sequence of the opening reading frame was 676 - 1248 bp, as was confirmed by RT-PCR and sequencing. The cDNA encodes a novel protein of 190 amino acids with a theoretical molecular weight of 20417. 8 and isoelectric point of 5. 23. The sequence has no significant homology with any known protein in databases. Semi-quantitative RT-PCR and Northem-blot analyses of multiple tissues showed that SPATA12 was expressed significantly in normal human testis. The expression recombinant of SPATA12 was constructed and a high level of the histidine-tagged fusion protein was obtained.Conclusions DDD can be confirmed by SPATA12 as a novel computational biology-based approach for identification of the testis-specific expression genes. SPATA12 may function as a testicular germ cell associated gene that plays some roles in spermatogenesis. Moreover, a great amount of SPATA12 protein could be obtained by the gene recombination technique, thus providing a reliable foundation for investigating the biological function of this new protein.     

StAR基因探针的制备及应激状态下小鼠睾丸间质细胞StAR基因的表达分析

目的 制备类固醇快速调节蛋白基因(StAR)探针,观察应激状态下StAR基因在小鼠睾丸间质细胞的表达变化.方法 提取C57BL/6小鼠睾丸总RNA, 并以此为模板,通过逆转录PCR获得StAR基因片断,运用T/A克隆策略, 将扩增的StAR基因片断重组于pCR2.1-POPO 载体,经过双酶切和DNA序列鉴定后,体外转录制备地高辛标记的StAR cRNA探针.采用限制活动制备应激状态小鼠模型(实验组),运用原位杂交的方法 分析实验组和正常对照组睾丸间质细胞的StAR mRNA表达水平. 结果 成功制备StAR基因探针,实验组睾丸间质细胞的StAR mRNA 的水平较对照组明显下降(P<0.05).结论 应激状态可下调睾丸间质细胞中StAR基因的表达,从而最终使雄激素水平降低.     

人M961全长cDNA及剪接异构体的分离与克隆

目的分离、克隆人M96基因,并初步探索其在不同血细胞系中的表达。方法根据与鼠M96基因有较高同源性的人表达序列标签(EST)设计筛库引物,筛选成人睾丸及胎脑cDNA文库,采用BLAST及CLUSTALW等程序比较分析筛选到的阳性克隆;应用多细胞系杂交膜分析该基因在各细胞系的表达;用氯化血红素诱导K562细胞向红系分化,探讨该基因在此过程中的表达变化。结果从文库中筛出长度分别为1878和1382bp的M96cDNA克隆,二者为剪接异构体,其开放阅读框分别编码491及262个氨基酸,分别命名为M961和M962(GenBank接受号分别为AF072814和AF073293)。Northern杂交结果表明,在所检测的10种血细胞系中,人淋巴细胞白血病细胞系CEM的M961基因表达量最高,在有巨核及红系特点的Hel、Dami及K562白血病细胞系中M961的表达量也较高。在K562细胞分化过程中,M961基因表达略有升高。结论M961基因在某些白血病细胞系中表达量较高。