LRIG2基因在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌细胞株生物学行为的影响

目的了解LRIG2基因在膀胱肿瘤和正常膀胱组织中的表达及其与膀胱肿瘤分级、分期之间的关系。并将携带有LRIG2基因的重组质粒载体pCMV-LRIG2转染膀胱癌细胞株BIU-87,观察对其生物学行为的影响。方法利用半定量RT-PCR技术检测38例膀胱肿瘤组织和16例正常膀胱黏膜组织内LRIG2基因mRNA表达情况。用脂质体介导的基因转染技术,将携带有LRIG2基因的重组质粒载体pCMV-LRIG2转染至膀胱癌细胞株BIU-87,检测转染前后细胞生长力、侵袭力及黏附能力的改变。结果肿瘤组织内LRIG2mRNA的表达水平显著低于正常膀胱组织,且与肿瘤的分级、分期呈负相关。转染pCMV-LRIG2组细胞生长速度较未转染组和空载体转染组明显减慢,侵袭力显著低于未转染组和空载体转染组,而黏附能力显著高于未转染组和空载体转染组。结论 LRIG2有类似于抑癌基因的作用,通过对EFG-EGFR信号转导途径发挥负反馈抑制作用,从而抑制BIU-87细胞的生长、侵袭和转移。     

抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响

质粒转染人膀胱癌BIU87细胞，用G418（800mg／L）筛选出抗性克隆。Western blot检测转染前后LRIG1和EGFR蛋白水平的变化；MTT法绘制转染前后细胞的生长曲线；Boyden小室和同质黏附实验观察转染前后细胞侵袭和黏附能力的变化。结果转染pLRIG1-GFP组LRIG1蛋白表达水平较对照组和转染空载体组明显升高，而EGFR蛋白表达水平较对照组和转染空载体组显著降低；转染pLRIG1-GFP组细胞的生长速度较对照组和转染空载体组明显减慢；转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭目的研究抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术，将pLRIG1-GFP和黏附能力显著降低（P〈0．05）。结论LRIG1是一种抑癌基因，通过参与形成EGFR的负反馈环路，对膀胱癌细胞BIU87的生长、侵袭和转移有显著的抑制作用。     

DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒转染对人膀胱癌细胞DNMTs表达的影响及其生物学效应

目的：探讨DNMT1、DNMT3b基因在膀胱癌发生发展中的作用。方法：①将DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒分别单独和共同转入人膀胱癌细胞系Nu87;②半定量RT—PCR和WesternBlot分别检测DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白水平的变化;③用MTT法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果：单独和共同转染DNMT1（或DNMT3b）mRNA、蛋白表达量明显下降,能影响BIU一87的生长曲线,使细胞增殖减慢,并使细胞周期阻滞于G1期,明显提高细胞调亡率;转染空质粒和单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。结论：联合转染DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒,可同时下调DNMT1和DNMT3b在BIU87细胞中的表达,并能在体外抑制BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生,其效果优于单独转染的重组质粒。单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的影响

目的 研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的作用.方法 将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞(pBp-PTEN-BIU87),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞(pBp-BIU87)和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况.将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU-87(pBp-PTEN-BIU87),以BIU87细胞和pBp-BIU87细胞为对照,应用Wester blot方法 检测三组细胞P110(PI3K的催化亚单位)、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况.结果 3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化,但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组.结论 PTEN是通过对PI3K-Akt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成.PTEN-PI3K-Akt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制.     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87中P13K—Akt信号通路的影响

目的研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU-87中P13K—Akt信号通路的作用。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5=并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN—BIU87），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp—BIU87）和正常BIU-87细胞为对照，用RT—PCR检测PTEN的表达情况。将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU一87（pBp—PTEN—BIU87），以BIU87细胞和pBp-BIU87细胞为对照，应用Wester blot方法检测三组细胞P110（P13K的催化亚单位）、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况。结果3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化，但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组。结论PTEN是通过对PI3K—Akt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成。PTEN—PI3K—Akt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制。     

RNAi表达载体对膀胱癌细胞Livin基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）表达载体对膀胱癌BIU-87细胞Livin基因的抑制作用。方法构建针对Livin基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染膀胱癌BIU-87细胞株，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测其对Livin mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的表达质粒在膀胱癌BIU-87细胞株中均抑制了Livin mRNA及蛋白表达。与空白载体组细胞作对照，前者产生的小干扰RNA（siRNA）在对Livin mRNA的抑制率24、48h分别为（81．28±9．21）％、（55．88±6．27）％，蛋白抑制率24h为（64．75±7．55）％。结论RNAi表达载体可以有效地抑制膀胱癌细胞Livin基因的表达。     

LRIG1基因对膀胱癌细胞侵袭力的影响

目的探讨抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87侵袭能力的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术,将pLRIG1-GFP质粒转染人膀胱癌细胞BIU87,用G418筛选出抗性克隆。用Boyden小室观察转染前后细胞侵袭能力的变化,并用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）法和Western—blot检测转染前后LRIG1和表皮生长因子受体（EGFR）的mRNA和蛋白表达水平。结果转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭能力显著降低,LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低（P〈0．01）。结论LRIG1对膀胱癌细胞BIU87的侵袭能力有显著的抑制作用。     

PTEN基因对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响

目的 研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响.方法 将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定;pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞(pBp-PTEN-BIU87),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞(pBp-BIU87)和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况,应用MTT法分别研究转染前、后膀胱癌细胞对不同浓度抗癌药物丝裂霉素(MMC)、羟基喜树碱和吡柔比星的敏感性变化. 结果 RT-PCR证实PTEN在转染的BIU-87细胞中能稳定表达.PTEN转染后,BIU-87细胞对MMC的药物敏感性明显提高.对吡柔比星和羟基喜树碱的药物敏感性无明显变化. 结论 PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对抗癌药物MMC的敏感性.     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

靶向抑制皮层肌动蛋白装配对大肠癌细胞侵袭作用的影响

目的 构建能够靶向抑制细胞皮层蛋白装配的重组质粒,观察其对于肿瘤细胞侵袭作用的影响.方法 构建重组质粒EGFP/N2/Repeat,将其和空载体质粒转染入人大肠癌细胞Lo-Vo和HCT-8,分别扩增培养,绘制生长曲线,通过boyden小室模型观察大肠癌细胞侵袭性的改变.结果 实验获得与预期一致的DNA特异性片段,经双酶切和测序证实目的 片段正确的与载体质粒连接,重组质粒经过双酶切证实构建成功.显微镜下观察重组质粒成功转染人大肠癌细胞,细胞生长曲线提示转染与未转染该基因的细胞生长曲线相同;行细胞侵袭力实验,含有EGFP/N2/Repeat的癌细胞、空质粒转染细胞和对照组细胞(未转染)穿膜数分别为LoVo组:35.27±6.70、85.47±5.50、87.47±6.39;HCT-8组:15.07±2.34、26.73±4.43、26.07±3.67,含有拮抗分子的细胞穿膜数较其余两组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01).结论 通过抑制皮层肌动蛋白装配可抑制大肠癌细胞的侵袭性.     

LRIG1, a candidate tumour-suppressor gene in human bladder cancer cell line BIU87

OBJECTIVES: To determine the effects of LRIG1 on the growth, migration and invasion of bladder cancer cells and the mechanisms underlying such effects. MATERIALS AND METHODS: The plasmid pLRIG1-green fluorescence protein (GFP) was transfected into BIU87 bladder cancer cells by Lipofectamine2000 (Invitrogen, Groningen, the Netherlands), and the cells that expressed LRIG1 stably were screened out by G418. The changes in LRIG1 and epidermal growth factor receptor (EGFR) protein levels were measured by Western blot; growth curves were estimated by the tetrazolium (MTT) assay; then cell-cell adhesion, cell-matrix adhesion and cell invasion assays were used to measure proliferation, adhesion and invasion in LGIR1-transfected and control cells. RESULTS: The LRIG1 protein level in pLRIG1-GFP transfected cells was significantly higher than that in control cells, while the EGFR protein level was significantly lower. pLRIG1-GFP transfected cells had less proliferation than control cells. Contrasting with non-LRIG1-transfected cells, the invasion and cell-matrix adhesion ability of pLRIG1-GFP transfected cells decreased markedly, and conversely the homotypic cell-cell adhesion ability was significantly higher. CONCLUSIONS: LRIG1 might act as a tumour-suppressor gene, participating in negative feedback control of EGFR expression, which inhibits bladder cancer cells from growth, migration and invasion.     

RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制

目的 探讨RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因表达后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制.方法 用携带U6启动子和LRIG2特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒载体pGenesi12-LRIG2-shRNA(siRNA)及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesi12-scramble-shRNA(scr)转染胶质瘤细胞系GL15、G418(600mg/L)筛选出稳定株,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG2和表皮生长因子受体(EGFR)表达的改变.噻唑蓝(MTT)比色法检测稳定转染对照组和实验组细胞的增殖,流式细胞仪检测对照组和实验组细胞的细胞周期改变.结果 实验组细胞LRIG2 mRNA和蛋白水平与对照组比较分别下降了68.6%和62.3%,EGFR蛋白水平下降了32.6%.MTT结果显示实验组细胞增殖率低于对照组.细胞周期分析表明对照组G0/G1期为(26.72±2.10)%,实验组为(36.58±3.29)%(P<0.05),LRIG2表达下调后GL15细胞细胞周期部分阻滞在G0/G1期.结论 GL15细胞经RNA干扰基因表达后,LRIG2 mRNA和蛋白水平明显降低,同时EGFR蛋白水平下降,从而抑制细胞增殖和使细胞周期阻滞在G0/G1期.LRIG2可通过EGFR信号系统影响胶质瘤细胞的生长.     

LRIG1基因抑制胶质瘤细胞生长的机制

目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因与表皮生长因子受体(EGFR)在人脑胶质瘤细胞中的相互作用及其对肿瘤细胞生长影响的机制.方法 用免疫共沉淀法检测人脑胶质瘤细胞系GL15中LRIG1与EGFR的相瓦作用.构建针对LRIG1基因的干扰片段及非特异性的对照片段分别转染GL15细胞系,G418(600 mg/L)筛选出稳定株,Western blot法检测LRIG1表达的改变及其对EGFR表达的影响;嚷唑蓝(MTT)比色法检测LRIG1表达下调对胶质瘤细胞增殖的影响.结果 免疫共沉淀法表明胶质瘤细胞系GL15中LRlG1与EGFR存在相互作用.成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体,转染细胞后LRIG1基因表达下降54.7%;同时干扰组细胞EGFR蛋白水平与阴性对照组比较上升了57.1%.MTT结果显示干扰组细胞增殖率高于对照组.结论 LRIG1通过与EGFR结合发挥抑癌作用,干扰LRIG1表达可削弱这种作用.导致肿瘤细胞增殖加速.     

MTUS2-AS2在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)MTUS2-AS2在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测63例膀胱癌组织和癌旁组织、膀胱癌细胞系(BIU-87、J82、T24、5637)和正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1中的MTUS2-AS2表达。以MTUS2-...     

联合RNAi膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖影响的机制

目的 观察基因芯片分析联合小型干扰(siRNA)人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TERT-Ⅲ:GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ:CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位).构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰(RNAi)装置pRNAT-TR-Ⅲ+pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析hTR和hTERT mRNA表达(以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析),端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性(测其A值),噻唑蓝(MTT)比色法检测BIU-87细胞的生长抑制(按MTT法检测转染细胞的存活率),并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录(RT)-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-ⅢTERT:0.300±0.033,P＜0.05;TR:0.430±0.028,P＜0.05).且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ:1.250±0.012,P＜0.05).联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调(ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致.     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.