阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用

目的 原核表达、纯化淋球菌MlaA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。方法 构建原核表达载体pET-28a-MlaA,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,经IPTG诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并进行Western blot鉴定。以纯化的重组蛋白作为抗原,与佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价,用Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)和流式细胞术(FCM)检测MlaA多克隆抗体的反应性和特异性。结果 Western blot显示,pET-28a-MlaA转化BL21后表达相对分子质量为35×10³的淋球菌MlaA重组蛋白。ELISA检测MlaA免疫小鼠血清抗体效价为1∶8 000～1∶32 000。Western blot、IFA和流式细胞术检测制备的抗体能识别淋球菌变性和非变性MlaA蛋白。结论 成功表达并纯化淋球菌MlaA重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,将制备的抗体血清作为一抗对淋球菌及其他不同类菌株进行Western Blot检测后发现,制备的多克隆...     

阴道毛滴虫黏附蛋白65基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定

目的通过构建原核表达载体,获得阴道毛滴虫黏附蛋白65基因重组融合蛋白。方法分离并纯化培养阴道毛滴虫临床分离株,提取其总RNA,经RT-PCR扩其全长序列基因,T-A克隆测序后,连接表达载体PET-28a(+)。在E.coli(DE3)Plyss宿主菌中用不同浓度IPTG诱导目的蛋白的表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯AP65,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗阴道毛滴虫全虫多抗鉴定其免疫反应性。结果克隆ap65基因与GenBank公布基因同源性高,在1mmol/LIPTG诱导下,AP65产量可占细菌总蛋白量的23%,提纯后蛋白纯度达到90%以上,且重组蛋白AP65能与兔抗阴道毛滴虫全虫抗体发生特异性结合。结论成功地构建了阴道毛滴虫ap65基因的原核表达系统,重组蛋白且有良好的免疫反应性,可为疫苗抗原的筛选及单克隆抗体的制备奠定基础。     

鼠抗人肥大细胞羧肽酶截短体抗体的制备与鉴定

目的 建立检测人肥大细胞羧肽酶(hMCCP)的双抗体夹心ELISA法,以hMCCP截短体免疫小鼠,制备鼠源性多克隆抗体.方法 PCR法扩增hMCCP-N118基因片段,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌Rosseta(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用Ni2 -NTA凝胶亲和层析纯化目的 蛋白.用纯化重组蛋白免疫小鼠,制备抗hMCCP-N118抗体.间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 hMCCP截短体在大肠杆菌中高效表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗hMCCP-N118抗体,效价达1∶6 400,该抗体能特异结合hMCCP.结论 成功地制备了效价高、特异性好的鼠抗hMCCP截短体抗体.     

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度>90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。     

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。     

兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体。方法用经Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白(rMSHA)免疫日本大耳兔,收集免疫兔血清。Western Blot检测重组蛋白的免疫原性;ELISA测定该抗体的效价。结果兔抗rMSHA抗体能与重组蛋白发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶25 600。结论成功地制备了兔抗rM-SHA抗体,该抗体能够识别原核表达的重组蛋白rMSHA,为研制霍乱弧菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的 原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TPx),并纯化TPx蛋白及制备兔多克隆抗体。方法 通过全基因合成的方法PCR扩增TPx基因。将扩增的TPx基因克隆至原核表达质粒pET30a载体中,构建重组质粒pET30a-TPx并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,12%SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化,Western blot鉴定TPx重组蛋白的纯化效果。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,制备TPx多克隆抗体,ELISA测定纯化抗体的效价。结果 成功构建重组质粒pET30a-TPx,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的TPx重组蛋白,相对分子质量约为22.43×10³,纯化后的带有His标签的TPx重组蛋白能被兔抗血清识别。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,获得TPx多克隆抗体,其ELISA效价为1∶1 126 400,抗体纯度为85...     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.