突变特异性扩增系统和变性高效液相色谱分析法结合DNA测序法快速产前诊断黏多糖贮积症Ⅱ型高危胎儿

目的为了快速、准确地对黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)高危胎儿做出产前基因诊断,从而及时而高效地防止病胎的出生。方法在阐明先证者病因及其父母基因型的基础上,采用已建立的突变特异性扩增系统(ARMS)特异引物直接鉴定法、变性高效液相色谱(DHPLC)快速筛检法,结合DNA序列分析法,对已孕20周的高危胎儿的艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因相应突变位点进行快速检测和鉴定。由于MPSⅡ为XR病,故又用SRY引物对胎儿进行性别鉴定,以避免可能出现的母血污染而导致的误诊。结果所怀胎儿未获得母源性的c.1344delA突变,是1例基因型完全正常的女胎。后经随访和复检,证实所生小孩的基因型、表现型都与产前诊断结果完全一致。结论 ARMS特异引物直接鉴定法、DHPLC快速筛检法结合DNA序列分析法是快速、准确产前诊断MPSⅡ高危胎儿的有效方法。其中,所建立的ARMS和DHPLC方法,既快速特异,又简便经济,可在一天之内送报结果 ,特别适用于已明确病因的高危胎儿的早期诊断以及正常组和患者试验组的快速鉴别。这一产前基因诊断工作的成功实施为今后继续开展本病以及其他相关遗传病的遗传咨询、基因诊断和产前诊断积累了宝贵的经验,也为今后开展...     

一罕见成骨不全IV型的基因诊断

目的对一疑似成骨不全IV型或其他类型的患儿实施基因诊断,以揭示患儿发病及频繁骨折的内在原因,为今后实施对症治疗和产前基因诊断创造必要的前提条件。方法对经症状、体征观察和x线检查初诊为成骨不全Iv型或其他类型的患儿,在抽取外周血制备DNA模板后,采用PCR、DNA直接测序法,对患儿的COLlAl基因进行突变检测,然后对所发现的突变进行分析和鉴定。结果在COLlAl基因的编码区内发现一典型的错义突变（c．823G〉C1／p．G275R）,经查HGMD数据库证实为成骨不全Iv型的致病性突变。结论先证者为一罕见的成骨不全IV型患儿,所发现的p．G275R突变为中国人群首次报道的病理性突变。     

COL2A1基因突变所致先天性脊柱骨骺发育不良的产前分子诊断

目的：对COL2A1基因（typeⅡcollagen gene）G504S突变导致的先天性脊柱骨骺发育不良（SEDC）家系的2例中期妊娠患者进行产前分子诊断。方法：分别对患者于19＋3孕周和18＋6孕周进行羊膜囊穿刺术抽取羊水,提取羊水脱落细胞DNA,对COL2A1基因的第23外显子扩增,对其产物测序。同时第1例胎儿从17＋3孕周～27＋3孕周、第2例胎儿从16＋1孕周～19＋1孕周对股骨长度进行B超动态检测。结果：COL2A1的23外显子测序结果显示第1例胎儿带有与母亲同样的COL2A1基因G504S突变。第2例胎儿COL2A1基因无突变。B超的追踪检测显示2例胎儿颅骨双顶径都与孕龄相符。第1例患病胎儿股骨增长随孕龄的增加而逐渐减慢,但孕23周前减慢不十分明显。病例2的胎儿股骨长度与孕龄相符,现继续妊娠观察。于第27＋5孕周对第1例患病胎儿行引产术后,影像学检测显示胎儿脊柱扁平、长骨明显短小,证实胎儿患有SEDC。结论：对于有SEDC风险的胎儿进行基因检测非常重要,可以在B超诊断前了解胎儿基因型并明确诊断。B超对胎儿股骨长度的动态检测有助于SEDC的诊断。     

致死性侏儒症Ⅰ型高发突变发生机制浅析

致死性侏儒症(thanatophoric dysplasia,TD)是重型短肢畸形病中相对常见的致死性遗传性骨病,分为TD-Ⅰ和TD-Ⅱ 2型,它们都是由于FGFR3基因发生致死突变所致.TD-Ⅰ型存在多种致病性突变,其中以c.742C＞T/p.R248C突变最为常见.本病为常染色体显性遗传(autosomal dominant,AD),杂合突变即可致死,但为何表型、基因型正常的父母会生出带有p.R248C突变的患胎并且是纯合突变的死胎？如果是新生突变,又为何会接连数胎生出同样的患胎？p.R248C高发突变的机制是什么？本文重点围绕这些问题,从“FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)基因和FGFR3受体(Fibroblast growth factorreceptor 3)的结构和功能,TD-Ⅰ型p.R248C高发突变的发生机制,正常父母生出纯合致死突变的可能机制”几方面进行剖析,指出:①FGFR3基因及其受体蛋白结构和功能的特殊性是高发突变发生的物质基础;②位于IgⅡ和IgⅢ结构域连接区的氨基酸是极性很强的亲水氨基酸,很容易与带电离子结合而影响α螺旋结构,故易受外来理化因素的攻击、诱变而发生改变;③正常父母生出纯合致死突变,推测有两种可能:一种是夫妇一方的生殖腺已带有该高发突变,当胎儿从亲代遗传了一次突变后,只需在另一位点上再发生一次新生突变即可产生;另一种是夫妇双方的生殖腺都是该突变的嵌合体,当两者结合在一起,就有可能产生纯合突变.此外,还对未来发展趋势进行了展望.本文旨在探讨c.742C＞T/p.R248C高发突变和纯合突变发生的机制,进而为其今后的诊断和防治工作提供理论依据.     

致死性侏儒症p.R248C突变热点的快速检测和三例TD-Ⅰ型高危胎儿的快速产前诊断

目的 针对致死性侏儒症Ⅰ型(thanatophoric dysplasia type Ⅰ,TD-Ⅰ)FGFR3基因的突变热点“p.R248C”,建立快速特异的酶切鉴定法(restriction endonuelease testing,RE)和扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)/RE法,并应用于后续3例疑似TD-Ⅰ高危胎儿的快速产前诊断,以及时防止患胎出生,同时为今后的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)打下良好基础.方法 首先,针对突变热点p.R248C突变前后的序列特点,选择合适的内切酶“AfeI”,建立酶切鉴定法.其次,没计双错配碱基特异引物结合Apa LI酶切,建立ARMS/RE双重特异鉴定法.对阴性和阳性结果均再用普通引物扩、测的结果进行验证. 结果 用AfeI酶切FGFR3基因exons (6-7)普通引物的PCR产物(535 bp),正常对照及非p.R248C突变的TD病例均能被切成255 bp和280 bp 2个片段,而胎1～胎3均切出255 bp、280 bp和535 bp 3个片段.用特异引物E7(p.R248C)扩增,正常对照和非p.R248C突变的TD病例均扩增阴性,无法进一步做酶切鉴定;而p.R248C突变均扩增阳性,当再用Apa LI酶切PCR产物(365 bp)时,胎1～胎3均切出22 bp和343 bp 2个片段.通过引物扩、测结果显示:胎1～胎3均是p.R248C杂合突变. 结论 该法快速特异、准确可靠,可用于p.R248C突变热点的快速检测及含该突变高危胎儿的快速产前诊断.该法还可用于含p.R248C突变TD-Ⅰ型家系的PGD.胎1～胎3都是TD-Ⅰ患胎,建议尽早终止妊娠.     

COL2A1基因新发突变导致先天性脊柱骨骺发育不良的遗传分析及产前诊断

摘要:目的?对1例先天性脊柱骨骺发育不良(SEDC)患儿进行基因检测和蛋白质功能预测，确定其致病原因，为家系遗传咨询及产前诊断提供依据。方法?应用高通量测序法对先证者454个骨病相关基因进行检测，对检出的可疑基因突变进行Sanger测序检测，对父母进行验证并对胎儿进行产前诊断。结果?该患儿检出COL2A1基因c.3589G>A(p.Gly1197Ser)杂合错义突变，其父母均未携带该突变，先证者为新发变异，家系中胎儿产前诊断结果提示胎儿未携带与先证者相同的变异。Polyphen2、Mutation Taster软件对其蛋白质功能预测的结果为有害。结论?COL2A1基因c.3589G>A变异是该SEDC家系先证者的致病原因。     

假肥大型肌营养不良症产前基因诊断的临床应用

目的 建立规范的假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)产前基因诊断程序。方法 利用DMD基因内18个缺失热点的PCR引物,6个DMD基因内(CA)n短重复序列(STR)引物以及性别决定基因SRY引物,多重聚合酶链反应检测羊水胎儿脱落细胞、先证者和双亲外周血有核细胞基因组DMD基因,通过胎儿性别确定、基因缺失检测和基因连锁分析确定胎儿DMD基因状态。结果 在4例先证者基因缺失家系的产前诊断中,2例男胎DMD基因缺失与先证者相同,1例女胎为基因缺失携带者,1例男胎未发现缺失;在4例有2个或2个以上患者又先证者未检出缺失的家系产前诊断中,发现获得风险染色体的男胎与女胎各1例,余1例女胎和1例男胎均未携带风险染色体。检测结果的可靠性经流产胚胎和已出生胎儿DNA分析、DMD临床症状监测得到部分证实。结论 胎儿性别基因诊断、DMD基因缺失检测结合基因连锁分析的方法,在严格控制检测范围、规范的检测程序和有效的质量控制下,能准确地对DMD／BMD进行产前基因诊断,是目前预防患儿出生最有效的实验室检测方法之一。     

1例成骨不全患者Ⅰ型胶原基因突变的检测

目的对1例成骨不全(OI)患者Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)进行基因突变检测,为研究中国人群的OI基因突变特点提供线索。方法患者具有OI典型的蓝巩膜、易骨折、牙本质发育不全等临床表现,临床诊断为OI,提取患者外周血基因组DNA,对所有启动子区、外显子及外显子-内含子边界区进行DNA测序,通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)法进一步验证,以患者的父母、妹妹及200例体检健康者作为对照。结果 DNA测序结果显示,OI患者COL1A1基因45号外显子发生单核苷酸替代突变(c.3263 GA,p.Gly1088Glu),而患者的父母、妹妹及200例健康对照者未发现相同的突变位点。同时PCRSSP也证明了此位点的杂合性。结论 c.3263 GA突变位点是一个OI患者COL1A1基因的新突变位点,与OI临床表型具有一定相关性。     

一种罕见的同义突变导致的β-地中海贫血的基因诊断和表型分析

目的:对血常规和血红蛋白电泳筛查结果提示疑为β-地中海贫血携带者的孕妇及其丈夫进行β-地中海贫血基因诊断,鉴定其表型并对胎儿进行产前基因诊断。方法:采用聚合酶链式反应-反向点杂交(PCR-RDB)方法及DNA测序方法分析并鉴定孕妇及其丈夫的外周血和孕妇的羊水样本的β-珠蛋白基因突变。结果:检测到孕妇本人为常见的β-珠蛋白基因IVS-Ⅱ-654(C>T)位点杂合突变,其丈夫携带一种罕见β-珠蛋白基因CD29(c.90C>T)位点杂合突变,产前基因诊断出胎儿基因型为βIVS-Ⅱ-654/βCD29。结论:本研究在中国人群中确切基因鉴定出β-珠蛋白基因CD29(c.90 C>T)突变,此突变类型虽为同义突变但其携带者表现为β+-地中海贫血表型。考虑遗传风险应对此类同义突变给予重视,尤其对指导遗传咨询和产前基因诊断有重要意义。     

皮埃尔·罗班序列征胎儿的产前超声表现

目的 观察皮埃尔·罗班序列征(PRS)胎儿产前超声表现。方法 回顾性分析15胎产前超声诊断并经引产证实的PRS胎儿产前超声所见和基因检查结果。结果 产前超声诊断4胎单纯PRS、11胎合并其他结构畸形;15胎均见不同程度小下颌及舌后坠,下颌面部角(IFA)为26°~49°,5胎下颌明显后缩;14胎见继发腭裂,漏诊1胎单纯软腭裂。之后8胎接受染色体检查,其中7胎未见异常,1胎检出7p22.3p14.3区域至少31.53 Mb片段重复、3p26.3926.1区域至少3.27 Mb片段杂合缺失;4胎同时接受基因检测,其中2胎为COL2AI基因杂合变异,1胎TCOF1基因杂合突变,1胎MSX2基因杂合变异。结论 PRS胎儿产前超声表现包括小下颌、舌后坠及腭裂,且多合并其他结构畸形。     

双错配碱基ARMS结合RE法快速检测FGFR3基因的突变超热点

目的建立快速简便、特异灵敏的鉴定FGFR3基因c．1138G〉A突变超热点的基因诊断方法,为软骨发育不全（ACH）的产前基因诊断或植入前遗传学诊断（PGD）创造条件。方法针对突变率高达95％以上的FGFR3基因的突变热点c．1138G〉A,设计双错配碱基的ARMS特异引物,对已经临床确诊的先证者家系及正常对照和非c．1138G〉A突变的患者对照,分别用普通引物和特异引物进行PCR扩增和直接鉴定,然后对扩增产物进行DNA序列分析及sfcI酶切鉴定。结果用普通引物扩增,对照组和先证者均扩增阳性。sfcI酶切后,对照组仍为一条513bp的带,而患者切出205bp、308bp和513bp三条带;而用ARMS特异引物扩增,则先证者扩增阳性,而对照组扩增阴性,阳性者酶切后产生27bp和418bp两条带。这一切都与预期的结果完全吻合。结论该法快速、特异、准确性高,结合DNA序列分析和酶切鉴定（RE）,可用于ACH高危胎儿的快速产前诊断。     

汉族人Ⅰ型胶原α1链Sp1结合位点基因多态性与骨质疏松症的相关性研究

目的：探讨位于汉族人Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)第1个内含子内Sp1结合位点G→T碱基突变的基因多态性。了解该位点多态性与骨质疏松的关系。方法：从150例随机人群抽取的汉族人的外周血中提取白细胞基因组DNA，用PCR扩增其COL1A1基因片段，产物用限制性内切酶进行酶切消化过夜，电泳鉴定基因型。结果：150例研究对象基因型经测定均为SS型，没发现Ss或ss基因型。结论：汉族人Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)Sp1结合位点不存在G-T突变或极其稀少，汉族人骨质疏松与Sp1结合位点多态性不存在必然的关联性。     

玉林市220例夫妇同型地中海贫血的孕妇羊水及脐血产前胎儿基因诊断结果分析

地中海贫血（地贫）是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致的遗传性溶血性贫血,夫妇同型地中海贫血胎儿患重型地中海贫血的风险高,对玉林市220例夫妇同型地中海贫血的孕妇羊水及脐血产前胎儿基因诊断进行统计分析。1资料与方法1．1对象     

ABO血型基因分型技术用于胎儿产前血型鉴定

在新生儿溶血病、脐血移植或亲子鉴定中 ,有时需要作胎儿产前血型鉴定 ,而 ABO血型是最具临床意义的血型系统。笔者采用 ABO基因分型技术 ,成功地用于羊水 ABO血型鉴定 ,现报告如下。材料与方法1　研究对象　例 1 ,女 ,妊 2产 1 ,第 1胎男性 ,3岁 ,AB型 ,患地中海贫血 ;第 2胎妊娠 8个月 ,计划分娩时采集脐血对第 1胎作造血干细胞移植。申请产前鉴定胎儿 ABO血型。例2 ,女 ,妊 2产 1 ,第 1胎男性 ,6岁 ,A型 ,患急性淋巴细胞白血病 ,经化疗后缓解 ;第 2胎妊娠 9个月 ,计划分娩时采集脐血对第 1胎作造血干细胞移植 ,申请产前鉴定胎儿 A…     

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A（hemophilia A,HA）FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR（inversion-PCR,I-PCR）方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。     

1个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系的TRAPPC2基因突变分析

目的确定1个迟发性脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)家系的致病基因。方法收集先证者及家系的临床资料,提取先证者及亲属外周血DNA,用高通量测序技术对先证者的COL2A1、COL1A1、MATN3、TRAPPC2、FGFR3等189个骨骼相关基因的外显子编码区测序,对发现的致病突变进行Sanger测序验证,并对家系其他成员进行该突变的检测。结果在先证者TRAPPC2基因第5外显子上发现了1个移码突变c.271_275del CAAGA半合子缺失,为X-SEDT的致病性突变,同时发现患者母亲为该突变的携带者,而患者父亲和妹妹未检测到该突变。结论用靶向二代测序和Sanger测序结合的方法确定了1个X-SEDT家系的移码突变c.271_275del CAAGA半合子缺失,为临床遗传咨询提供了分子依据。     

马凡综合征FBN1突变的一个家系分析及产前诊断

目的对一马凡综合征(Marfan's syndrome,MFS)个例进行原纤维蛋白-1基因(FBN1)突变分析并对该家系的1例MFS孕妇进行产前诊断。方法提取先证者及其家族成员外周全血基因组DNA,先证者羊水细胞DNA和培养后羊水细胞的RNA。用PCR和DNA双向测序技术检测存在于FBN1外显子中的潜在突变。RT-PCR扩增RNA检测所发现突变的相应外显子并进行基因测序。结果发现该先证者FBN1基因外显子23错义突变c.2785AC(p.Thr929Pro),其患MFS的父亲和哥哥发现同样突变。该家族其他表型正常的成员该位点未发现突变。胎儿羊水细胞的DNA与羊水培养细胞RNA均未发现该位点的突变。结论 FBN1错义突变c.2785AC(p.Thr929Pro)为该家族的致病原因,该MFS孕妇的胎儿未遗传该FBN1的致病突变。     

1个Danon病家系的分子诊断及产前诊断

摘要:目的对1 个Danon病家系进行基因突变检测,并对该家系中的1例高危胎儿进行产前诊断。方法采集该家 系先证者和其他家庭成员的外周血标本,利用Sanger测序检测该家系其他成员是否存在先证者的溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)基因 突变(c.257_ 258delCC)。获得胎儿母亲基因检测结果后采集羊水标本,并对高危胎儿进行产前诊断。结果该家系多 名成员存在LAMP2基因c.257_ _258delCC突变,胎儿携带与先证者相同的LAMP2基因e.257_ 258delCC 突变。结论利用Sanger测序技术可对Danon病家系进行分子诊断,并成功对1例胎儿进行了产前诊断。     

软骨发育不全患者的FGFR3基因诊断

目的建立软骨发育不全(ACH)患者的FGFR3基因检测方法。方法用PCR扩增和测序技术对临床上疑似ACH的14例患者的FGFR3基因突变进行测序。结果 FGFR3基因的外显子10测序结果显示,14例疑似ACH患者中10例检出FGFR3基因1138位G→A突变。对4例未检出突变的样本进行FGFR3基因的全部外显子测序,有2例样本检出FGFR3基因882位T→C杂合突变,最后确定其为已知的单核苷酸多态性(SNP)位点(rs2234909)。对4例样本中的1例进行了后续检查,证实该受检者不是ACH患者。结论 FGFR3基因的突变检测有助于疑似ACH患者的明确诊断,对遗传咨询具有重要意义。     

东南亚缺失型α地中海贫血的聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断

目的　针对东南亚缺失型α地中海贫血 (- - SEA)建立一种快速、简便的聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术 ,并初步应用于高危胎儿的产前诊断。方法　采用跨越断裂点的PCR设计方案 ,其中一对引物用于扩增 - - SEA缺失基因 ,另一对引物设计在 - - SEA、-α3 .7、-α4 .2 的公共缺失区域 ,用于扩增正常的α珠蛋白基因 ,两对引物在单管中反应。用该方法对 8例高风险Bart’s水肿胎进行产前诊断。结果　 - - SEA缺失基因的扩增产物为 740bp ,正常等位基因的扩增产物为 10 5 2bp。进行产前诊断的 8例高风险Bart’s水肿胎 ,检出正常胎儿 3例 ,- - SEA杂合子 3例 ,HbBart’s水肿胎儿 2例。结论　该法快速、准确 ,可作为常规方法用于临床样品的分子筛查及Bart’s水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断。