脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的：探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间。方法：脐血CD34^ 细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液。对其有核细胞数（NC）、表面抗原以及集落形成能力进行监测。结果：同对照组相比，扩增组的NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增，扩增高峰分别为第10d和第6d；其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多。第6d，CD34^ 细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍，第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍。而D组（含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L）扩增的细胞中CD34^ 及CD34^ CD38^-含量最高。提示E组细胞分化较D组明显。结论：体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题，但扩增中应注意其过度分化，扩增时间以6-10d为宜。     

脐血CD+34细胞体外扩增新进展

造血干细胞(hematepoietic stein cell，HSC)是各种血细胞和免疫细胞的始祖，具有极重要的生理功能。脐带已经成为近年来研究的热点，但单份脐血中造血干细胞理论上不少，但实际上数量往往不足以支持成人的造血重建，需要体外加以扩增。影响脐血CD34^ 细胞体外扩增的因素有很多，现就几种关键因素对脐血CD34^ 细胞体外扩增作用的研究新进展综述如下。     

人脐血CD34+细胞体外DEXTER基质细胞培养的动态观察

目的 动态观察人脐血CD34^ 细胞DEXTER基质细胞培养的情况。方法 应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD34^ 细胞，按照DEXTER法行脐血基质细胞培养，观察不同时间、不同细胞因子组合基质细胞的生长状态。结果 SCF及SCF BFGF组合可促进基质细胞集落的生成，脐血基质细胞在生长情况、组成成分、细胞形态等方面与骨髓基质细胞有不同的生物学特性。结论 脐血CD34^ 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成，有望成为新的基质细胞来源。     

脐血单个核细胞和CD34+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞(MNC)和CD34+富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性.实验发现CD34+富集细胞具有很高的扩增潜力,通过3周培养总细胞扩增了(883.2±322.4)倍,而MNC仅扩增了(53.3±6.2)倍.对比细胞集落生成和CD34+细胞的扩增发现,MNC的集落密度由最初的(270.9±54.9)CFCs/105cells上升至第7天的(1 496.3±417.7)CFCs/105cells,CD34+细胞百分比则由最初的(0.99±0.18)%上升至第7天的(4.4±1.9)%,而CD34+富集细胞在培养过程中,虽然集落总数和CD34+细胞总数始终呈上升趋势,但是其集落密度和CD34+细胞百分比则始终呈下降趋势.在两种起始细胞培养中,CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)在集落中的含量逐渐增加,BFU-E(爆式红细胞集落形成单位)含量则逐渐降低.在3周的短期培养中,MNC可以得到更多的集落形成细胞(CFC)和CD34+细胞.     

脐血CD34^＋细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法 用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD34^ 细胞,从CD34^ 细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD34^ 细胞百分率和ＣＦＣ（包括ＣＦＵ－ＧＭ和ＢＦＵ－Ｅ）。结果 Ａ组（加rhSCF、rhIL-3、rhG-CSF、rhＴＰＯ）与Ｂ组（加rhFL、rhＩＬ－3、rhG-CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显差异。Ｃ组（加rhSCF、rhCSF与rhFL有明显的协调效应;培养７d时开始增多,培养１４d进入高峰。培养２１d开始下降。培养２８d明显下降。结论 Ｃ组能明显扩增人脐血造血细胞,培养７－１４d造血细胞达高峰。为移植最佳时间。     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

多种细胞因子组合对脐血CD34+细胞的体外扩增

目的 探讨不同细胞因子组合在无血清、无基质条件下对脐血干／祖细胞的调控作用。方法 将SCF、Flk2／Flt3配体(FL)、TPO、IL-6及IL-6受体的可溶性形式(sIL-6R)进行不同组合扩增脐血CD34^ 细胞。结果 ①SCF FL ／-TPO组合能有效快速扩增脐血CD34^ 、CD34^ Thy-1^ 、CD34^ CD33^ 及长期培养启始细胞(LTC—IC)；②该组合同时加入IL-6及sIL-6R后，脐血干／祖细胞显著增殖；单独加入IL-6(不含sIL-6R)时，早期CD34^ 细胞和LTC—IC含量无明显增加，而且CFU-Mix、BFU—E的扩增不如CFU—GM明显；③通过细胞凋亡早期膜变化标记FITC—Annexin—V检测细胞凋亡率，加入Flt3L和／或IL-6 sIL-6R后Annexin-V阳性细胞由15．2％～19．1％降至2．8％～3．5％。结论 在SCF TPO Flt3L IL-6 sIL-6R组合的无基质、无血清悬浮体系中，脐血既能产生大量定向祖细胞，又能保持一定数量的早期造血细胞，这一体外培养体系具有重要的临床意义。     

体外扩增对脐血CD34+细胞粘附特性和趋化功能的影响

目的 探讨在体外扩增过程中,脐血(UCB)干／祖细胞(HSPC)的粘附特性和趋化功能的变化。方法 从新鲜UCB标本中纯化的CD34^ 细胞接种于无血清无基质悬浮扩增体系,分别于培养7、10和14d从扩增细胞中再次纯化CD34^ 细胞,比较扩增前后CD34^ 细胞的几种与归巢密切相关的功能特性,包括归巢相关粘附分子(CAM)的表达,粘附功能和趋化功能。结果 (1)表达各种粘附分子的CD34^ 细胞亚群的数量在扩增过程中明显增加(15～72倍),而且扩增后CD34^ 细胞表面粘附分子CD44、CDlla、CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或升高,CD62L、CD54和CD31的表达则有不同程度的下调;(2)在前10d的扩增中,CD34^ 细胞与FN间的自发粘附率和SDF-1诱导粘附率均呈上升趋势,0、7和10d分别为28％和63％、60%,和70％、63％,和90%,;(3)扩增1周后,CD34^ 细胞的体外迁移能力无明显变化。结论 所建立的短期培养体系可以支持扩增1周的UCB HSPC保持原有粘附和趋化功能,而继续扩增则可能在某种程度上不利于细胞这些能力的保持。     

小鼠脾集落形成期基质细胞在体外扩增脐带血CD34^＋细胞中的作用

目的：研究来源于小鼠脾脏的基质细胞在体外扩增脐血CD34^ 细胞中的作用;方法：取γ射线照射后小鼠脾集落形成期的脾细胞经人重组单核细胞集落刺激因子（rhM-CSF)的激发培养,获得贴壁脾基质细胞,经丝裂霉素处理后作为滋养细胞,与多种造血细胞生长因子共同应用,体外扩增经免疫磁珠阳性选择法纯化的人脐血CD34^ 细胞,用体外集落形成及流式细胞仪分析扩增细胞的集落形成能力和表型。结果：1）rhM-CSF能有效地刺激小鼠脾基质细胞的生长;2）所获的小鼠脾基质细胞具有支持脐血CD34^ 细胞的集落形成能力,与多种造血细胞生长因子共同应用后,能有效地扩增CD34^ 细胞,扩增2周后的细胞数达100倍,且仍具有多向分化能力。结论：rhM－CSF能刺激小鼠脾集落形成期基质细胞的增殖,该类基质细胞具有有效支持人脐血CD34^ 细胞的体外扩增作用。     

脐血CD34+细胞体外扩增的实验研究

目的：探讨用体外扩增脐血造血干细胞进行成人脐血移植的可能性。方法：从１５份新鲜脐血标本中纯化ＣＤ３４＋细胞，将其接种于含２０％的胎牛血清（ＦＢＳ）的ＩＭＤＭ培养基中，分别加入由Ｆｌｔ３配体（Ｆｌｔ３　ｌｉｇａｎｄ，ＦＬ）、干细胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ，　ＳＣＦ）、血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，　ＴＰＯ）及白细胞介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１，ＩＬ－６）组成的三组细胞因子组合（Ａ组：ＦＬ＋ＴＰＯ；Ｂ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ；Ｃ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ－６）培养扩增１４ｄ。结果：①各组对各阶段造血细胞均有扩增效果，其中Ｂ、Ｃ组优于Ａ组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；②　经体外１４ｄ的培养扩增后，单份脐血可产生足够量的造血干细胞用于成人脐血移植。结论：脐血ＣＤ３４＋细胞经体外扩增可用于成人脐血移植。     

成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34 细胞体外扩增作用. 方法: 分离培养成人MSCS作为滋养层,联合SCF, IL-11和GM-CSF分别组成对脐血CD34 细胞的不同扩增体系,培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34 细胞扩增倍数的变化. 结果: MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34 细胞含量均具有明显的扩增作用,分别扩增了114.2±2.4, 40.5±8.6, 11.3±0.4 倍. 结论: 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34 细胞的体外扩增作用.     

人CD34+脐血干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的:探讨人脐血来源的CD34 干细胞治疗脊髓损伤的可行性,为脊髓功能障碍性疾病的临床治疗打下基础.方法:用密度梯度离心及免疫磁珠法分离出人CD34 脐血干细胞,在含有B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人重组干细胞因子(rhSCF)的营养液中培养,用核荧光染色剂Hoechst33258标记细胞;制作大鼠脊髓横断模型,造成大鼠下肢瘫痪,在脊髓损伤3 d移植荧光标记的CD34 脐血干细胞,观察移植后的动物行为变化、脊髓组织形态学变化等.结果:脊髓损伤大鼠移植CD34 脐血干细胞5～6 d可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,10～15 d后可出现爬行,3～4周后后肢活动活跃;对照组瘫痪的肢体未见恢复.脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量神经胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性的细胞,移植区Hoechst33258荧光标记阳性细胞增生.结论:移植的CD34 脐血干细胞可在移植部位增殖,并使脊髓横断大鼠运动功能恢复,有望成为治疗脊髓损伤的有效手段.     

缺氧脐带间充质干细胞对脐血CD34＋祖细胞免疫反应的影响

目的：探讨脐带来源的缺氧间充质干细胞（MSCs）是否能有效抑制脐血CD34＋祖细胞免疫排斥反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌。方法：从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测其表面标志;将缺氧处理后的脐带MSCs加到脐血CD34＋祖细胞、外周血单个核细胞（PBMc）共培养体系中,96h后收集上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结栗：脐带MSCs不表达CD40、CD80、CD86、HLA—DR、CD34;缺氧的脐带MSCs能抑制共培养体系中淋巴细胞IFN-γ的分泌（与对照组比,P〈0．05）,同时促进IL-10分泌（与对照组比,P〈0．05）,但与非缺氧脐带MSCs组相比,IFN-γ的分泌量增多,IL-10的分泌量减少。结论：缺氧脐带MSCs能抑制脐血CD34＋祖细胞的免疫排斥反应,抑制IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,但与非缺氧脐带MSCs相比,免疫调节功能下调。     

人脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统

目的探讨人脐血CD34+造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(no obese diabetic/severecombined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠模型上造血重建的作用。方法利用密度梯度离心法,从新鲜脐血中分离出单个核细胞,利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,移植后3、7、10、14 d分别用断尾法取小鼠外周血,血常规计数外周血动态变化情况;移植后4、6、8、10周,取其外周血,运用PCR法检测外周血中人特异性Alu基因的表达情况。结果免疫磁珠分选得到的CD34+细胞浓度达91.2%,照射后小鼠骨髓腔内有核细胞和巨细胞数量明显减少或消失,达到清髓目的。移植后第3天移植组小鼠外周血各系细胞均明显低于正常组(P<0.01),移植后第7天,移植组小鼠外周血象开始恢复,明显高于阴性对照组[白细胞:(3.90±0.53)×109/L vs(1.30±0.18)×109/L,血红蛋:(139.8±5.0)g/L vs(79.8±11.0)g/L,白血小板:(253.0±17.5)×109/L vs(52.0±6.9)×109/L,(P<0.01)],移植后第10天,移植组小鼠外周血象恢复到辐照前水平,与正常组无差别。移植4周后,PCR方法在小鼠外周血中可检测到人特异Alu基因序列,未移植组小鼠照射后2周内全部死亡。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合模型。NOD/SCID小鼠经照射后,不破坏骨髓造血微环境及造血基质,可用于异基因细胞移植模型。人脐血CD34+细胞移植入NOD/SCID小鼠,其造血系统能有效重建。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑素(内抑素)基因转染人脐带血CD34^ 造血干细胞的方法及检测。方法：用逆转录病毒载体pLNCX，将人内抑素基因导人人脐带血CD34^ 造血干细胞。应用PCR及Western bolt方法检测人内抑素基因的转染和表达。结果：PCR证实，转染内抑素基因的人脐带血CD34^ 造血干细胞基因组中有550bp人内抑素特异性片段，Western bolt分析示人内抑素基因在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论：人内抑素基因可转染到人脐带血造血干细胞中并稳定表达。