原代人胚肺、肾细胞成功培养方法的改进

目的：培养出广泛适合于基础与临床研究的原代人胚肺、人胚肾细胞。方法：分别用不同的培养基及不同浓度的血清,以改进的方法对原代人胚肺、肾细胞进行培养。结果：经水囊引产的３月大小的胚胎肺及肾,用ＭＥＭ及１６４０加上２０％的牛血清,对细胞的贴附及增殖十分有利,细胞生长状态良好。结论：经改进后的对人胚肺细胞和人胚肾细胞的原代培养,用含２０％的小牛血清的ＭＥＭ和１６４０的培养液对细胞的生长极为有利。     

人胚细胞的体外培养

目的：为医学研究长期提供培养的人胚细胞。方法：体外培养人胚细胞，观察其生长特性、染色体数目以及冻存和复苏的条件。结果：培养的人胚肺、皮肤、肾、脾及脑组织中，肺和皮肤细胞在冻存前后增长速度较快而稳定，染色体数目为２ｎ＝４６，占８７％￣９１％；肾、脾细胞扩增缓慢；脑组织几乎不能扩增。结论：人胚肺和皮肤细胞可长期培养，可为医学研究提供二倍体细胞实验对象。     

镉诱导人胚肾细胞损伤分子机理的初步研究

目的：初步探讨镉诱导人胚肾细胞损伤的细胞分子机理。方法：采用MTT法，观察镉对人胚肾细胞损伤的影响；用流式细胞仪检测镉诱导人胚肾细胞凋亡；用分光光度计检测镉对肾细胞SOD活性的影响。结果：几种不同剂量的镉加入细胞作用24h，48h,72h后均能损伤肾细胞，抑制细胞生长；镉能诱导人胚肾细胞凋亡。并且能降低肾细胞SOD活性。结论：镉对人胚肾细胞生长有一定的抑制作用，能诱导人胚肾细胞凋亡及抑制肾细胞SOD活性。     

人胚腱细胞体外培养及其生长特性观察

目的：建立肌腱生物学研究的体外模型。方法：贴块培养人胚腱细胞。观察原代及传代腱细胞生长。形态及遗传学特征，用Vimentin及Fn免疫组化法鉴定腱细胞。结果：腱细胞生长汇合后呈平行致密排列并表现为接触抑制，传至16代仍保持稳定的遗传特征。原代腱细胞Vimentin阳性而Fn呈阴性反应。结论：培养的人胚腱细胞为研制新型人工肌腱提供了实验生物材料。     

树鼩原代细胞的分离及感染甲型流感病毒模型的构建

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细胞,测定24、48和72 h培养上清病毒载量,并观察细胞感染流感病毒后的形态变化,以确定流感病毒PR8株体外对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的感染性。结果分离到的树鼩原代细胞经传代培养纯化和形态鉴别,对树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞和犬肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒易感性比较,培养48 h时显微镜下均能观察到明显的细胞病变(CPE);培养72h时病毒滴度可分别达到2.40×10~5 TCID_(50)/mL、1.20×10~3 TCID_(50)/mL、1.74×10~4 TCID_(50)/mL和1.79×10~7 TCID_(50)/mL。结论流感病毒可有效感染树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞并有效增殖,且流感病毒对树鼩原代气管内皮细胞感染性最强,与流感病毒易感细胞MDCK相比具有统计学意义。确立了树鼩原代细胞的分离与培养方法,初步建立了流感病毒感染树鼩原代细胞的体外模型。     

川芎嗪对TGF-β1诱导人胚肾近端小管上皮细胞转分化影响的实验研究

目的利用原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞作为研究对象,探讨川芎嗪(TMP)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肾近端小管上皮细胞转分化的影响。方法采用胶原酶消化后系列网筛过滤,再用密度梯度离心分离纯化细胞的方法,进行人胚肾近端小管上皮细胞的原代培养。原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞传至第2代后分为5组,空白对照组、10ng/mL TGF-β1刺激组、5ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组、10ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组及20ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组。刺激48h后,采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、酶化学染色和免疫细胞化学方法检测细胞的转分化情况。结果 TGF-β1刺激人胚肾近端小管上皮细胞后细胞拉长呈梭形,细胞间隙加大;电子显微镜下细胞失去极性,微绒毛减少直至消失;碱性磷酸酶染色阴性;细胞角蛋白18(CK-18)表达减弱,波形蛋白(Vimentin)表达增强,并表达α平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)。各浓度TMP+10ng/mL TGF-β1刺激组细胞的上述变化均有不同程度的减弱,减弱程度与TMP浓度呈正比。结论 TMP能以浓度依赖方式阻止TGF-β1诱导的人胚肾近端小管上皮细胞的转分化。     

紫外线灭活的地方株单纯疱疹病毒2型对Hep-2细胞引起的某些改变

<正> 单纯疱疹病毒(HSV)引起人类许多疾病,近年来发现 HSV-2与宫颈癌的发生有关。Hampar 等(1961)首先发现 HSV 可在 MCH 地鼠细胞中诱导染色体畸变。其后很多作者均相继用 HSV 在体外诱导出了原代地鼠细胞、人胚肺、中国地鼠细胞、原代猴肾细胞、BHK-21细胞、人胚成纤维细胞、人胚肺二倍体细胞、兔肾细胞及人白细胞等的染色体畸变。并发现 HSV 诱导的染色体畸变多发生在 HSV 感染的早期,主要出现在 A、B、C 组染色体长臂的亚末端和末端,以及着丝点和次缢痕。表现形式有染色体和染色单体断裂、裂隙和粉碎化等。     

逐步降低牛血清浓度培养人二倍体细胞试验的探讨

目的 逐步降低新生牛血清（以下简称牛血清）浓度培养人胚肺二倍体细胞，以适应无血清培养人胚肺二倍体细胞的需要。方法 应用美国生命公司无血清培养基（以下简称无血清培养基）和日水制药株式会社MEM培养基（以下简称MEN培养基），加入相同浓度牛血清配制的生长液，同时传代培养人胚肺二倍体细胞，随着每次细胞的传代培养而同时降低牛血清的浓度，观察人胚肺二倍体细胞是否保持其原有生物性能。结果 无血清培养基，牛血清降低的极限为0．5％，MEM培养基牛血清降低的极限为l％，细胞可传代培养。结论 人胚肺二倍体细胞在两种培养基配制的生长液中传代培养后，细胞形态有显著差异。随着牛血清浓度的逐渐降低，细胞形态无显著改变，活细胞数逐渐递减，细胞生长速度变慢，生长周期延长。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

人支气管上皮细胞体外不同培养基培养效果比较

目的：比较胎牛血清培养基,小牛血清培养基对经纤维支气管镜（纤支镜）刷检人支气管上皮细胞培养存活率的差异。方法：采用不同细胞培养液,对经纤支镜刷检获得的人支气管上皮细胞进行原代培养,并通过倒置相差显微镜观察原代培养细胞,比较细胞的存活率。结果：胎牛血清培养基细胞成活率比其他培养基高。结论：胎牛血清培养液可提供较为满意的生长条件。     

IL—6对地塞米松诱导AML细胞凋亡的影响

目的：检测ＩＬ－６对原代白血病细胞的影响，探讨其在地塞米松耐药机制中的作用。方法：①不同条件下体外培养原代白血病细胞，用ＭＴＴ法了解细胞增殖情况，②用形态学观察和原位末端标记法检测不同培养条件下ＨＬ－６０细胞株的细胞调亡。结果：①ＩＬ－６可显著促进ＡＭＬ细胞增殖（Ｐ〈０．０５），对ＡＬＬ细胞则无影响（Ｐ〉０．０５），②地塞米松显著抑制ＡＭＬ细胞增殖（Ｐ〈０．０５），且这种抑制在部分病例可被ＩＬ－６     

内皮素基因在大鼠不同器官中的表达

目的：定量检测内皮素ｍＲＮＡ在大鼠心、肝、肺、肾等器官及培养的肾小球系膜细胞（ＭＣ）的表达。方法：半定量逆转录－多聚酶链反应（Ｓ＿ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交方法。结果：内皮素ｍＲ－ＮＡ在上述器官及ＭＣ中均有表达，其表达水平从高到低依次为肺、心、肾、肝。结论：内皮素基因在不同器官有着不同表达；除血管内皮细胞外，ＭＣ是产生内皮素的又一种细胞。     

IL—6介导儿童急性髓细胞性白血病细胞对地塞米松耐药的实验研究

目的：检测ＩＬ－６对原代白血病细胞的影响,并探讨ＩＬ－６是否与白血病细胞对塞米松产生耐药有关。方法：有ＲＰＭＩ１６４０培养基在不同条件下对原代白血病细胞进行体外培养,用ＭＴＴ法检测细胞增殖指数以了解细胞增殖情况,结果：①ＩＬ－６可促进ＡＭＬ原代细胞增殖（Ｐ〈０．０５）,而对ＡＬＬ原代细胞则无明显作用（Ｐ〉０．０５）;②地塞米松能抑制ＡＭＬ原代细胞增殖（Ｐ〈０．０５）;③地塞米松抑制ＡＭＬ原代细胞增     

人肾小球系膜细胞原代培养及鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、传代次数多的人肾小球系膜细胞培养方法。方法：取肾脏肿瘤手术切除后远离患病部位的正常肾脏组织、水囊引产的胎儿肾,三层筛网滤过分离,取最下层筛网上组织,用胶原酶消化,培养正常人肾小球系膜细胞。同时采用形态学观察和免疫荧光技术,对鼠抗人结蛋白,鼠抗人角蛋白进行鉴定,采用MTT、 流式细胞仪技术对不同来源肾脏的系膜细胞生长状况进行比较。结果：形态学、免疫荧光法鉴定表明培养细胞为肾小球系膜细胞,胎肾原代培养后8～10d即可传代,而成年肾脏原代培养后需15～16d方可传代。成年肾脏培养细胞至第4代细胞生长缓慢,贴壁能力减弱,出现死亡。而胎肾培养细胞则可继续培养至第7～10代。结论:三层滤网法分离人肾小球系膜细胞, 方法简单、高效,培养的原代肾小球系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特性,且进一步证明胚胎组织比成年个体肾脏原代细胞培养容易成功。     

半定量RT—PCR方法在基因表达研究中的应用

目的：定量检测Ｂ型内皮素受体（ＥＴＢ－Ｒ）基因在大鼠心、肝、肺、肾等器官及培养的肾小球系膜细胞（ＭＣ）的表达。方法：半定量逆转录－多聚酶链反应技术（ＳｑＲＴ－ＰＣＲ），并以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＥＰ印迹法作对照。结果：ＥＴＢ－Ｒ基因在上述器官及ＭＣ均有表达，而表达水平依次为肺、心、肾和肝。结论：ＥＴＢ－Ｒ在不同器官有不同水平的基因表达，说明内皮素对不同器官的效应不同；ＭＣ是内皮素在肾内发挥作用的靶细胞     

大鼠胎肝前体细胞的分离培养

目的：探索胚龄(ED)13．5d大鼠胚胎肝脏中肝前体细胞的生物学特性，为细胞移植及基因导向治疗奠定基础。方法：酶消化法分离肝前体细胞，观察不同体外培养对肝前体细胞生物学功能的影响，并用免疫组化方法鉴定分离培养细胞的分化标志。结果：肝前体细胞在原代胚胎成纤维细胞饲养层(PREF)培养，其增殖能力较无饲养层培养强，原代培养可保持未分化状态。细胞分化标志鉴定提示EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞中存在双分化能力的细胞。结论：EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞存在双分化能力的原始肝细胞，肝前体细胞可在PREF进行体外扩增。     

反义阻断hREV3基因表达对细胞生长及MNNG敏感性的影响

目的：应用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３基因对细胞生长和ＭＮＮＧ敏感性的影响。方法：酶切法构建表达反义ｈＲＥＶ３基因片段的真核细胞表达质粒;以改良的磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法建立ｈＲＥＶ３基因表达被阻断的人胚肾细胞（２９３细胞）细胞系（２９３－ｈＲＥＶ３＾－）。以细胞记数方法检测核细胞系的生长速率及不同浓度的烷化剂ＭＮＮＧ对细胞的毒作用。结果：ｈＲＥＶ３基因表达被阻断的人胚肾细胞（２９３－ｈＲＥＶ３＾     

人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

M76—1等麻疹疫苗株的分离鉴定与免疫原性研究

6例麻疹患儿血液接种原代人胚肾细胞分离出4株病毒(M76-1、M76-5、M76-6、M76-7)。经鉴定其抗原性与沪191株及列4株麻疹病毒一致。采用低温(31±1℃)培养及大剂量病毒(约3×10~(6)TCID_(50))感染法将这4株病毒从原代人胚肾细胞适应于鸡胚细胞获得成功。其中2株制成鸡胚细胞减毒活疫苗接种159名易感儿童,其临床反应轻而免疫原性良好。     

人肾细胞癌细胞的原代培养及癌基因表达初步分析

目的:研究人肾细胞癌(RCC)原代细胞生物学特性及其癌基因的表达情况。方法：应用改良的原代肿瘤细胞分离法分离培养7例人RCC原代细胞。应用染色体核型分析和免疫组化方法,分析原代细胞核型以及癌基因与抑癌基因的表达。结果：用本法培养的原代细胞比其他常规方法所得细胞既多且纯。所培养的人RCC原代细胞的癌基因表达分析发现bcl-2,c-erbB-2,c-met,表皮生长因子受体(EGFR)有轻度至中度表达,而p53没有表达。结论：人RCC原代培养及其癌基因表达检测,为应用原代RCC所开展exvivo的RCC基因治疗打下了初步的基础。