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RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR(Real-time PCR)检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3 d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V(Annexin V)染色并用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74%;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。 结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡。 相似文献
2.
Lentiviruses have been adapted as gene delivery vehicles. This article summarized shRNA lentiviral vector methods generally used in research laboratories. The main procedures of shRNA lentiviral vector include that (1) Target sequences screening and shRNA oligonucleotides designing, (2) insert designed oligonucleotides into lentiviral vectors, (3) using packaging cells to produce shRNA lentivirus, and (4) transducing target cells with shRNA lentivirus. 相似文献
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目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义(P〈0.001)。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。 相似文献
4.
目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。 相似文献
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目的:探讨沉默ORP-150基因对体外培养卵巢癌细胞SKOV-3的增殖、转移及侵袭的影响并初步探讨其可能作用机制.方法:运用慢病毒包装shRNA方法沉默SKOV-3细胞的ORP-150基因;研究分为3组:实验组(ORP-150 shRNA)、阴性对照组(NC shRNA)和空白对照组(CON);采用qRT-PCR和Western印迹法检测基因敲减效率,CCK8法、克隆形成试验检测ORP-150沉默对细胞增殖能力的影响,划痕试验、Transwell试验检测SKOV-3细胞侵袭迁移能力的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Western印迹法探讨ORP-150基因敲减后影响细胞表型改变的作用机制.结果:沉默ORP-150基因可以抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力以及跨膜转移扩散能力(P<0.05),但对细胞的侵袭能力无明显影响(P>0.05);敲减ORP-150基因后卵巢癌细胞凋亡明显增加(P<0.05);敲减ORP-150基因后的卵巢癌细胞可能通过Wnt信号通路及Caspase级联反应影响细胞的修复,最终抑制细胞增殖,促进凋亡发生.结论:沉默ORP-150基因可以抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖和转移,同时促进凋亡发生.这种细胞表型的改变可能是通过下调Wnt信号通路中β-catenin,同时的表达,以及抑制Caspase级联反应从而下调c-myc,cyclin D1和caspase-3蛋白的表达来实现,ORP-150基因沉默可能是卵巢癌治疗的新靶点. 相似文献
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背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。
目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。
方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。
结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。 相似文献
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目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。 相似文献
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慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性 总被引:1,自引:0,他引:1
目的: 探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。 方法: 构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。 结果: 构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con(转导空载体)组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562 -con组细胞明显增高(P<0.05)。结论: 慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。 相似文献
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目的:通过体外实验探讨沉默高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)基因对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:将携带GOLPH3 shRNA的慢病毒载体转染SGC-7901细胞,建立稳定沉默GOLPH3的细胞株LV-GOLPH3-RNAi,分别用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测GOLPH3 mRNA 和蛋白的表达。MTT法检测细胞增殖力,Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的迁移力和侵袭力。结果:稳定沉默GOLPH3的细胞株构建成功;GOLPH3 mRNA 和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与scrambled组和空白对照组相比,转染后LV-GOLPH3-RNAi组细胞的增殖力受到抑制(P<0.05),迁移力(56.7±1.5 vs 186.0±3.4、183.3±4.2,P<0.05) 和侵袭力 (33.5±3.0 vs 85.0±3.9、83.1±4.4,P<0.05) 也明显受到抑制。结论:沉默GOLPH3基因的表达可抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖力、迁移力和侵袭力,提示GOLPH3有可能成为潜在的肿瘤标志物和独立的预后因子。 相似文献
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目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。 相似文献
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目的:设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法:将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine 2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果:经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论:慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。 相似文献
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IntroductionGastric cancer is a frequently detected malignancy, and its incidence has increased over the past decades in East Asia. The present study investigated the effect of 5,7,2, 5-tetrahydroxy-8,6-dimethoxyflavone (THDMF) on gastric cancer cells and explored the underlying mechanism. The study analysed cell viability changes, apoptotic features, and metastasis potential of treatment with THDMF.Material and methodsMTT colorimetric assay was used for measurement of MKN28, MKN45, and GES-1 cell proliferation and flow cytometry for the detection of apoptosis. Transwell and wound healing assays were used to observe the invasion and migration abilities of MKN28 cells. The expression of p21, MMP2/-9, PI3K, and c-Myc proteins was detected by western blotting.ResultsThe THDMF treatment significantly (p < 0.05) reduced MKN28 and MKN45 cell proliferation without changing GES-1 cell viability. A significant increase in apoptotic cell population on treatment with THDMF was observed. Treatment of MKN28 cells with THDMF increased the percentage of cells in the G1 phase. Exposure of MKN28 cells to THDMF caused a marked decrease in invasion and migration potential in comparison to control cells. The expression of miR-145 was markedly increased in MKN28 cells on treatment with THDMF. In MKN28 cells expression of c-Myc, PI3K, p-AKT, MMP-2, and MMP-9 was suppressed markedly on exposure to THDMF. The expression of p21 protein in MKN28 cells was markedly promoted on exposure to THDMF.ConclusionsTHDMF exhibits anti-cancer effect on gastric cancer cells in vitro by activation of cell apoptosis and arrest of cell cycle. In addition, THDMF promoted miR-145 expression and down-regulation of PI3K/AKT signalling pathway in MKN28 cells. Therefore, THDMF may be utilised as a potential novel therapeutic agent for the treatment of gastric cancer. 相似文献
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目的:构建大鼠CD80基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠NRK和IEC6细胞上鉴定其沉默效率.方法:将筛选获得的大鼠CD80基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与pGCSIL-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠NRK细胞、IEC6细胞和大鼠DC细胞(树突状细胞,Dentritic cell),分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到4×10~8 TU/ml.shRNA慢病毒颗粒感染NRK和IEC6细胞后CD80基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了66.9%和63.5%.结论:成功构建了大鼠CD80基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因. 相似文献
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目的:探讨沉默CREB基因对氧糖剥夺/复氧神经元线粒体形态及细胞凋亡的影响。方法:3条靶向CREB基因的shRNA片段插入慢病毒载体pLenti Lox3.7(PLL),与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装病毒颗粒后感染原代皮层神经元,Western blot检测CREB蛋白的沉默情况;分别用Mito Tracker red、TUNEL和Western blot实验检测氧糖剥夺/复氧诱导CREB基因沉默后神经元的线粒体形态、细胞凋亡和Bcl-2、Bax的表达情况。结果:pLL-CREB-shRNA1为最有效的shRNA,其抑制皮层神经元CREB基因表达率高达80%。CREB基因沉默促进氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元线粒体向点状、片段化形态改变,同时降低Bcl-2表达、促进Bax的表达并加重细胞凋亡(P0.05)。结论:CREB-shRNA重组慢病毒载体可特异性抑制神经元CREB基因的表达,CREB基因沉默加重氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元线粒体形态改变,促进细胞凋亡。 相似文献
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目的:探讨沉默caspase-3对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法:构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染MSCs,通过real-time PCR和Western blotting 在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。采用MTS法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。Real-time PCR检测bcl-2和bax mRNA的表达。Hoechst荧光染色法检测细胞的凋亡情况。结果:Real-time PCR和Western blotting结果均表明成功建立稳定转染shRNA-caspase-3的大鼠MSCs细胞株。沉默caspase-3使MSCs的增殖率明显提高(P<0.05),且S期细胞百分比明显增多,为(52.66±0.30)%。沉默caspase-3后bcl-2 mRNA表达上调,bax mRNA表达下调,bcl-2/bax比值升高(P<0.05)。转染组的细胞凋亡率为(15.01±1.73)%,低于空载体组的(25.67±3.05)%和空白对照组的(23.67±1.16)%(P<0.05)。结论: 沉默caspase-3能调控MSCs的细胞周期,促进细胞增殖,减少细胞凋亡。 相似文献
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目的:针对雌激素受体(ER)-α36基因的特异性靶序列,构建并鉴定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒载体,研究ER-α36沉默后对胃癌细胞增殖的影响。方法:筛选确定的ER-α36基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体(GV307)连接,测序鉴定。转染293T细胞,包装产生慢病毒,感染胃癌SGC7901细胞株。荧光显微镜下观察SGC7901感染后荧光表达情况,real-time PCR和Western blotting方法检测ER-α36的表达变化。用1×10-10mol/L的17β-雌二醇处理沉默ER-α36的SGC7901细胞,用细胞计数法观察细胞增殖能力的变化及检测相关下游信号通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表达的变化。结果:阳性克隆PCR及测序证明成功构建慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,倒置显微镜下观察LV-ER-α36-RNAi慢病毒载体感染率达80%以上。Real-time PCR和Western blotting方法证实四环素(Te T)诱导下LV-ER-α36-RNAi明显抑制SGC7901细胞内ER-α36 mRNA和蛋白质的表达。与对照组相比,沉默ER-α36的SGC7901细胞增殖能力减弱,Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表达明显降低,Src蛋白活化能力减弱(P0.05)。结论:我们构建的Te T诱导靶向ER-α36的vshRNA慢病毒载体LVER-α36-RNAi,可明显沉默ER-α36的表达,为研究ER-α36蛋白的作用机理提供实验依据,ER-α36与胃癌细胞等肿瘤细胞的增殖有关。 相似文献
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目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。 相似文献
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目的观察构建has-miR-26a重组慢病毒的表达载体对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响。方法构建人MicroRNA-26a慢病毒表达载体(LV-miR-26a-GFP)并感染人急性髓系白血病细胞系NB4;分为未感染组、感染组(感染LV-miR-26a-GFP)以及阴性对照组(感染LV-GFP);用real-time RT-PCR检测miR-26a在NB4细胞内的表达水平,Western blot检测PTEN的表达;用CCK-8法绘制细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖。结果成功构建miR-26a重组慢病毒的表达载体,感染白血病细胞NB4后,能够成功过表达miR-26a。生长曲线的结果显示与感染LV-GFP阴性对照组和未感染组相比,LV-miR-26a-GFP感染组细胞的增殖速度显著增加(P<0.01),软琼脂克隆形成实验证实了感染LV-miR-26a-GFP的NB4细胞的克隆形成能力(GFP+克隆数为75+10)与阴性对照组(感染LV-GFP)相比(GFP+克隆数为26+5)显著增强(P<0.05)。在NB4细胞中过表达miR-26a后,其靶基因PTEN的表达明显被抑制。结论 MicroRNA-26a的表达可增强急性髓系白血病细胞的增殖能力,促进白血病细胞的增殖。 相似文献
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目的构建CD146原核、真核表达载体,证实融合蛋白在原核细胞的诱导表达以及在胃癌细胞内的表达和定位。方法提取人黑色素瘤细胞A875的总mRNA并进行反转。以反转录的cDNA为模板PCR扩增CD146全长编码基因,分别克隆至pCDNA3.1-myc/his以及pGEX-4T-3表达载体中。原核重组质粒鉴定后转入BL21细胞中并经了诱导表达及纯化,真核表达质粒转入胃癌MKN45细胞中,分别利用westernblot和激光共焦扫描显微技术检测了重组质粒的表达以及在胃癌细胞中的定位。结果 CD146全长基因序列克隆到原核、真核表达载体中,酶切鉴定片段为1930bp。原核诱导出了GST-CD146并进行了纯化,CD146在真核细胞中表达为113KD的糖蛋白,Westernblot检测到真核转染的myc/his-CD146表达,条带约为120KD,免疫荧光显示蛋白定位在胃癌MKN细胞膜。结论成功构建了CD146原核、真核表达载体,融合蛋白在胃癌MKN45细胞表达。 相似文献