ATP损耗是MPP^＋引起α-synuclein转基因线虫多巴胺能神经元死亡和虫体死亡的主要原因

目的揭示环境神经毒素MPP~ 对线虫的毒性影响并探讨其毒性机理。方法以人源α-synuclein转基因线虫作为动物模型,用MPP~ 处理该线虫,观察MPP~ 对线虫多巴胺能神经元和其生存能力的影响。通过供给OP50以提高线虫体内ATP的水平,对比分析ATP水平、蛋白质异常沉积等重要指标,探讨二者在MPP~ 引起的转基因线虫的病变中所起的作用。结果MPP~ 能够引起线虫多巴胺能神经元和线虫虫体的死亡;尽管进食OP50也会引起α-synuclein的沉积,但进食OP50能够提高体内ATP的水平并缓解MPP~ 的毒性。虽无直接证据证明α-synuclein沉积对神经细胞的影响,但结果提示,在该转基因线虫中,与蛋白质的异常沉积相比,MPP~ 导致的ATP损耗是其毒性作用的最主要诱因。结论MPP~ 可以引起α-synuclein转基因线虫多巴胺能神经元的死亡和虫体的死亡,其毒性的主要原因是ATP损耗而不是α-synuclein的异常聚集(沉积)。     

鱼藤酮诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的探讨鱼藤酮对多巴胺能神经元内泛素化-αsynuclein聚集的影响及其细胞损伤作用。方法应用鱼藤酮处理经NGF诱导的神经元样分化的PC12细胞株(多巴胺能神经元)与N2a细胞株(非多巴胺能神经元)4、8、16、24 h以及用利血平预处理PC12细胞4 h再加入鱼藤酮处理16 h;采用免疫荧光双标记方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化-αsynuclein聚集,以MTT法和流式细胞术分别检测PC12细胞活力及凋亡率。结果单用鱼藤酮处理16 h后,PC12细胞株与N2a细胞株相比较,免疫荧光双标记显示PC12细胞内泛素化-αsynu-clein发生明显聚集,并且鱼藤酮对PC12细胞株的作用具有时间依赖性,而N2a细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显。利血平耗竭PC12细胞内多巴胺后再经鱼藤酮处理,PC12细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显;经不同浓度鱼藤酮处理后,细胞活力呈剂量依赖性下降;与对照组相比,经20 nmol/L鱼藤酮处理4、16、24 h后细胞存活率分别为(81.6±12.3)%、(59.8±6.7)%和(52.2±7.4)%(P<0.01)。鱼藤酮处理后出现早期凋亡细胞,随着处理时间的延长细胞凋亡率逐渐上升(P<0.01)。结论鱼藤酮选择性作用于多巴胺能神经元,使细胞内泛素化-αsynuclein发生聚集,而且这种变化具有时间依赖性,最终导致细胞发生凋亡,然而鱼藤酮对非多巴胺能神经元作用不明显。同时,鱼藤酮诱导泛素化-αsynuclein发生聚集的作用与神经元的特性存在密切关系。     

帕金森病发病机制中α-synuclein的研究进展

帕金森病(PD)一种常见的神经系统变性疾病,在其路易氏体(LB)中发现有大量的α-synuclein及其片断。研究α-synuclein的生理特点、致病机制及其影响因素将会对PD发病机制的认识和治疗提供理论依据。     

MPP+重新启动多巴胺能神经元细胞周期的作用及机制

目的研究1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP )重新启动多巴胺能神经元细胞周期的作用及机制。方法使用MPP 处理神经元样分化的PC12细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,流式细胞仪检测早期凋亡细胞和细胞周期分布,免疫细胞化学检测ERK/MAPK通路活化水平。结果经MPP 处理后,细胞活力呈浓度依赖性下降,经25、50、75、100、150 mmol/L MPP 处理24 h后细胞存活率分别下降至对照组的(97.32±2.41)%(、67.69±3.03)%、(56.00±3.12)%、(47.23±2.55)%、(40.00±2.46)%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。经75 mmol/L MPP 处理后出现早期凋亡细胞,随处理时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,其处理4、8、16和24 h后细胞凋亡率分别为(7.26±3.43)%、(8.34±3.55)%(、20.04±2.64)%和(28.46±2.35)%(P<0.01)。同时细胞周期中G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多(P<0.01),细胞内ERK1/2通路活化。结论MPP 可通过活化ERK1/2通路重新启动多巴胺神经元的细胞周期,并诱导多巴胺能神经元凋亡。     

α-synuclein和帕金森病的关系研究进展

近年来,大量研究显示SNCA基因突变等多方面的原因可导致α-synuclein异常聚集,而其和家族型和散发型帕金森病有密切关系,但是具体机制还不清楚.病理性的α-synuclein是路易小体和路易轴突的主要成分,而后两者在脑内的沉积是帕金森病的标志.帕金森病相关基因突变引起α-synuclein的聚集,其低聚物和聚集物可能干扰正常细胞功能和促进多巴胺神经元变性.本文综述了近年来关于病理性α-synuclein参与帕金森病病理生理过程及相应干预措施的研究进展以及针对α-synuclein的治疗.     

α-synuclein片段NAC对多巴胺能神经元的神经变性作用

目的 :探讨α 突触核蛋白的非淀粉样成分 (NAC)对多巴胺能细胞的毒性作用。方法 :PC12细胞经不同浓度的NAC处理 48h后 ,观察细胞形态改变 ,MTT法测定细胞活力 ;TUNEL和Annexin V法流式细胞仪检测调亡 ;硫磺素S染色研究蛋白聚集。结果 :NAC处理 48h后 ,PC12细胞突起样结构消失 ;与对照组比较 ,NAC >2 5 μmol·L使细胞活力明显下降 (P <0 0 5 ) ,并诱导出现凋亡及蛋白聚集。结论 :ANC对多巴胺能细胞有毒性作用 ,并引起蛋白聚集。     

泛素-蛋白酶体抑制剂诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的 探讨多巴胺(DA)神经元诱变剂对细胞内泛素化α-synuclein聚集的影响及其细胞损伤作用.方法 应用MPP+、特异性泛素-蛋白酶体系统(UPS)抑制剂lactacystin及H2O2处理神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞株与N2a细胞株16 h后,采用免疫荧光双标记的方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化α-synuclein聚集,比较三种诱变剂对这两种细胞株作用的差异.在PC12细胞中加入不同终浓度的lactacystin处理24 h,MTT方法检测PC12细胞活力.10μmol/Llactacystin处理PC12细胞不同时间,流式细胞术检测PC12细胞的早期凋亡率.结果 经三种诱变剂处理后,MPP+和lactacystin选择性地诱发PC12细胞内泛素化α-synuclein聚集且以lactacystin的作用更为显著,N2a细胞则无明显的泛素化α-synuclein聚集.H2O2作用于PC12细胞的效应与MPP+相近,但仅引起N2a细胞内少量泛素化α-synuclein聚集.经lactacystin处理后的PC12细胞活力呈剂量依赖性下降;5 μmol/L、10μmol/L和20 μmol/L lactacystin处理24 h后细胞存活率分别为79.5%±2.1%、49.3%±3.2%和31.2%±2.8%(与对照组相比,均P＜0.01).流式细胞术显示lactacystin处理后PC12细胞早期出现凋亡细胞,并且随着处理时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加.结论 特异性UPS和线粒体呼吸链抑制剂选择性作用于DA神经元,诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集,终使细胞发生凋亡,而以氧化应激为主要损伤途径的诱变剂的作用则不具有选择性.     

内质网应激IRE1α/XBP-1通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用

目的 探讨内质网应激1型跨膜蛋白激酶α (IRE1α)/X盒结合蛋白1 (XBP-1)通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法 利用内质网应激诱导剂Thapsigargin观察小鼠原代成纤维细胞中IRE1α/XBP-1通路活性。利用IRE1 α抑制剂KIRA8探究IRE1 α/XBP-1通路在原代中脑多巴胺能神经元变性死亡中作用。结果 相比于未处理组细胞,Thapsigargin处理后原代成纤维细胞中内质网应激IRE1 α/XBP-1通路明显上调。Thapsigargin处理可显著降低原代中脑多巴胺能神经元的存活率,而KIRA8处理可显著改善Thapsigargin导致的多巴胺能神经元存活率降低。结论 内质网应激通过IRE1 α/XBP-1通路介导多巴胺能神经元的变性死亡。     

TH和GDNF双转基因工程细胞对多巴胺能神经元的保护作用

目的将人的外源基因TH和GDNF共同转染SH-SY5Y细胞,建立一种可同时高效稳定表达TH和GDNF的工程细胞,探讨其在帕金森病(PD)基因治疗中的作用。方法将人GDNF和TH的cDNA构建于表达载体PcDNA3.0和PcDNA3.1,形成重组真核表达载体PcDNA3.1/hGDNF、和PcDNA3.0/hTH,同时转染至SH-SY5Y细胞系,利用RT-PCR鉴定筛选出高效稳定表达阳性克隆,将此工程细胞与大鼠原代多巴胺(DA)能神经元共培养,免疫细胞化学检测观察DA能神经元的数目和生长状态。结果成功建立了可同时高效稳定表达人TH和GDNF双基因的工程细胞,并且该细胞可防止DA能神经元退变死亡,有助于DA能神经元抵抗MPP+的毒性损伤。结论人TH和GDNF双转基因工程细胞对DA能神经原有防治兼顾的保护作用。、     

α-硫辛酸对帕金森病大鼠脑内多巴胺能神经元的保护作用及其机制探讨

目的观察α-硫辛酸(LA)对鱼藤酮致帕金森(PD)大鼠模型黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法健康成年雄性Wistar大鼠背部皮下注射鱼藤酮制备PD大鼠模型,药物治疗组同时给予大鼠腹腔注射LA。采用分光光度法检测大鼠脑内丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH),Western blot检测大鼠中脑黑质及纹状体酪氨酸羟化酶(TH)的表达变化。结果与对照组相比,鱼藤酮组大鼠纹状体中MDA明显增高(P<0.01)而GSH含量明显降低(P<0.01),TH蛋白在黑质和纹状体与对照组比较明显降低(P<0.05);LA干预后与鱼藤酮组相比MDA明显降低及GSH明显增高(P<0.05),TH蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论氧化应激在PD发病中起着非常重要的作用,LA能有效减轻PD大鼠脑内氧化应激损伤、保护脑内多巴胺能神经体系,同时改善PD样症状。     

雷公藤内酯可减轻MPP+诱导的大鼠多巴胺神经元损伤

目的以小胶质细胞激活为特征的神经炎性反应作为帕金森病（Parkinson’s disease,PD）一种重要的致病原因,正受到越来越多的关注。本文的目的是研究1-甲基-4-苯基-毗啶（l-methyl-4-phenylpyridinium,MPP^＋）所诱导的偏侧PD大鼠模型中小胶质细胞的激活,观察雷公藤内酯作为一种小胶质细胞抑制剂对多巴胺神经元的保护作用及其对MPP^＋所导致的大鼠行为学异常的改善效果。方法通过黑质区域显微注射MPP^＋制作偏侧PD大鼠模型。分别在基线、MPP^＋注射后第1、3、7、14、21天时通过测定黑质区域OX-42的免疫荧光强度评定小胶质细胞的激活程度,测定酪氨酸羟化酶的表达情况评定存活多巴胺神经元的数量;通过阿朴吗啡诱导的旋转行为、前肢跨步及触须引发的不对称放置试验得分测评行为学表现。结果黑质区域MPP注射导致小胶质细胞的激活、多巴胺神经元进行性死亡以及行为学缺陷的不断加重。雷公藤内酯可以显著抑制小胶质细胞的激活,部分阻止MPP^＋对多巴胺神经元的毒性,改善行为学异常。结论上述结果显示雷公藤内酯对MPP^＋诱导的偏侧PD大鼠模型多巴胺神经元具有保护作用,其机制可能与抑制小胶质细胞的激活有关,这为PD免疫抑制治疗提供了实验依据。     

MPP~+重新启动多巴胺能神经元细胞周期的作用及机制

目的研究1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)重新启动多巴胺能神经元细胞周期的作用及机制。方法使用MPP+处理神经元样分化的PC12细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,流式细胞仪检测早期凋亡细胞和细胞周期分布,免疫细胞化学检测ERK/MAPK通路活化水平。结果经MPP+处理后,细胞活力呈浓度依赖性下降,经25、50、75、100、150 mmol/L MPP+处理24 h后细胞存活率分别下降至对照组的(97.32±2.41)%(、67.69±3.03)%、(56.00±3.12)%、(47.23±2.55)%、(40.00±2.46)%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。经75 mmol/L MPP+处理后出现早期凋亡细胞,随处理时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,其处理4、8、16和24 h后细胞凋亡率分别为(7.26±3.43)%、(8.34±3.55)%(、20.04±2.64)%和(28.46±2.35)%(P<0.01)。同时细胞周期中G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多(P<0.01),细胞内ERK1/2通路活化。结论MPP+可通过活化ERK1/2通路重新启动多巴胺神经元的细胞周期,并诱导多巴胺能神经元凋亡。     

MPP+对培养中脑多巴胺能神经元的影响

目的通过观察MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺及胆碱摄取能力、多巴胺含量变化及细胞形态的改变等,研究MPP+对中脑多巴胺能神经元功能的影响,探讨利用MPP+建立体外PD细胞模型的可能性及实际意义.方法用孕14天Wistar大鼠,氯胺酮麻醉后取胚胎,按本室常规方法分离培养中脑多巴胺能神经元,培养至第7天后将不同浓度的MPP+加入培养有神经元的培养基中,使其终浓度分别为0.1μM,1μM,10μM.分别测定不同时相点[3H]多巴胺和[3H]胆碱摄取能力及细胞内多巴胺含量变化,并进行TH免疫细胞化学染色.结果MPP+浓度为0.1μM、1μM和10μM时,其[3H]多巴胺摄取力分别是为6.2±0.7、5.9±0.5、5.4±04,较之对照组100±1.7的结果看,MPP+对中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显抑制作用(P＜0.05);而[3H]胆碱摄取力其值为98±3.1,较之对照组100±2.4,差异不显著,说明MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取力无抑制作用(P＞0.05).另一个有趣的结果是胶质细胞的存在对MPP+的作用有明显影响,未抑制胶质细胞组其作用明显强于抑制胶质细胞组(P＜0.05);同时MPP+使中脑多巴胺能神经元细胞内多巴胺含量明显减少(P＜0.05);TH阳性细胞明显减少(P＜0.05).结论MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显的抑制作用,不仅使多巴胺的摄取降低,而且细胞内的多巴胺含量也显著减少,TH免疫组化染色结果也支持这一结果.MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取能力无明显抑制作用.     

二苯乙烯苷对A53T α-突触核蛋白转基因小鼠运动功能和黑质多巴胺能神经元的影响

目的 研究二苯乙烯苷(TSG)对A53T突变型α-突触核蛋白(α-syn)转基因小鼠运动功能和病理变化的影响.方法 6月龄A53Tα-syn转基因阳性小鼠分为模型组(Tg+)、模型+TSG小剂量组(50 mg/kg)、模型+TSG大剂量(100 mg/kg)组.同窝转基因阴性小鼠随机分为对照组(Tg-)、对照+TSG大剂量组(100 mg/kg)组.给药组每天灌胃给予TSG,共9个月,至15月龄;对照组和模型组每天灌胃给予等容积蒸馏水.应用爬杆试验和筑巢试验检测小鼠的运动能力;应用免疫组织化学方法检测小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)标记的神经元.结果 与转基因阴性的对照组小鼠比较,模型组小鼠在爬杆试验中的潜伏期延长,筑巢行为评分减低,黑质致密部的TH阳性神经元数量减少.TSG灌胃给药9个月能够明显缩短模型小鼠在爬杆试验中的潜伏期,增高筑巢行为评分,增加黑质致密部TH阳性细胞数量.结论 TSG能够明显改善A53Tα-syn转基因小鼠的运动功能,增高黑质多巴胺能神经元数量,提示TSG可能有利于治疗帕金森病等突触核蛋白相关疾病.     

钙蛋白酶在MPP~+诱导的多巴胺能神经元损伤中的作用

目的观察钙蛋白酶在MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤中的作用,探讨帕金森病的发病机制。方法使用神经生长因子诱导PC12细胞神经元样分化,然后使用MPP+处理神经元样分化的PC12细胞,制作帕金森病细胞模型。使用免疫印迹法检测细胞内总钙蛋白酶和活化的钙蛋白酶的表达水平,使用钙蛋白酶活性检测试剂盒观察钙蛋白酶活化水平,使用钙蛋白酶抑制剂ALLN和MDL28170抑制钙蛋白酶活性后采用MTT法检测其对细胞活性的影响,用流式细胞术观察细胞凋亡变化。结果神经元样分化的PC12细胞经MPP+处理后总的钙蛋白酶水平保持稳定,但活化的钙蛋白酶表达水平逐渐增高,钙蛋白酶活性也逐渐增高,MPP+处理12 h后达到高峰。ALLN和MDL28170能够显著抑制钙蛋白酶活性,并减轻MPP+诱导的PC12细胞损伤。钙蛋白酶抑制剂也能够明显抑制MPP+诱导的细胞凋亡。结论钙蛋白酶参与MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤,可能是帕金森病新的治疗靶点。     

鱼藤酮致鼠黑质脑片多巴胺能神经元损伤的实验研究

目的 探讨低剂量鱼藤酮对乳鼠中脑黑质脑片多巴胺能神经元的毒性作用及依达拉奉的保护作用.方法 取Wistar乳鼠中脑黑质脑片进行培养,酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色观察多巴胺神经元毁损情况,western-blot测定各组脑片α-突触核蛋白(α-Synuclein)含量,扫描电镜观察脑片超微病理结构变化.结果 黑质脑片多巴胺神经元的数目随鱼藤酮浓度及培养时间的增加而明显减少,多巴胺神经元的超微病理显示氧化应激性损害,α-Synuclein的含量随鱼藤酮浓度的增加而升高,依达拉奉 鱼藤酮组较鱼藤酮组能够减少多巴胺能神经元的凋亡并使α-Synuclein的表达量减少.结论 成功利用黑质脑片器官型培养体系建立了帕金森病(Pakinson's disease)模型;低剂量鱼藤酮导致选择性多巴胺神经元的凋亡,并导致α-Synuclein的含量增加,自由基清除剂依达拉奉对此有保护作用.     

PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元死亡中作用

目的 探讨PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法 利用小鼠原代培养成纤维细胞,应用Western blot和免疫荧光染色法,观察内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin)对PERK通路的激活,利用小鼠原代培养中脑多巴胺能神经元,应用TH免疫荧光染色法对存活的中脑多巴胺能神经元进行计数,以观察PERK抑制剂GSK2606414对长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡的影响。结果 在Thapsigargin处理后的原代成纤维细胞中p-PERK、p-eIF2α、ATF4水平均显著升高,Thapsigargin诱导中脑多巴胺能神经元死亡,PERK抑制剂GSK2606414可显著减少长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡。结论 内质网应激激活PERK通路;长时程内质网应激导致中脑多巴胺能神经元死亡,抑制PERK通路的激活可以缓解长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元死亡,PERK通路参与了长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元变性死亡。     

帕金森病α-触核蛋白基因表达和转基因动物的研究进展

α－触核蛋白是帕金森病(ＰＤ)等露易小体疾病的特征性病理变化中的主要成分之一。已经证实它的异常聚集和突变与ＰＤ的发病机制有关。α－触核蛋白的基因表达和转基因动物的研究,为此提供了一定的证据,也提示α－触核蛋白在ＰＤ发病机制中发挥重要的作用。     

TNF-α对PTZ点燃大鼠海马Glu能神经元和GABA能神经元的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子-α在癫痫中的作用机制。方法:应用免疫组织化学的方法研究TNF-α对戊四氮致癫痫大鼠海马Glu能神经元和GABA能神经元的影响。结果:大鼠海马谷氨酸能神经元的改变;戊四氮致癫痫组明显高于正常对照组,TNF-α干扰组明显高于戊四氮致癫痫组和正常对照组。大鼠海马GABA能神经元的改变;戊四氮致癫痫组明显低于正常对照组,TNF-α干扰组明显低于戊四氮致癫痫组和正常对照组。结论:TNF-α可以通过增强海马谷氨酸能神经元的活性和降低GABA能神经元的活性而促进癫痫的发生和发展。     

RNA干扰介导的MN9D细胞中α-synuclein表达抑制及其对细胞活力的影响

目的使用载体介导的RNA干扰（RNA nterference,RNAi）方法抑制MN9D细胞中的α-synuclein基因表达,并检测其对细胞增殖和活力的影响。方法在α-synuclein的开放读码区选择两段19个核苷酸的片断,并选择一段与小鼠基因无同源性的阴性对照序列,分别设计合成单链寡核苷酸,退火融合成双链寡核苷酸。将双链寡核苷酸克隆入pENTR／Hl／TO质粒载体,鉴定正确后,转染MN9D细胞,通过筛选获得稳定的细胞克隆。使用RT-PCR、Real-timePCR、免疫细胞化学染色和Western blot方法检测细胞内的α-synuclein的表达水平,鉴定RNAi的效率。利用生长曲线和MTT法分别检测比较各组细胞的增殖和活力。结果转染pSH2／α-SYN的细胞与正常和转染pSH／CON的MN9D细胞相比,α-synucleinmRNA及蛋白水平均明显减少;而转染pSHl／α-SYN的细胞α-synucleinmRNA及蛋白水平与两组对照细胞没有明显差别。抑制α-synuclein表达不影响细胞增殖,但可以降低细胞活力。结论结果表明,SH2／α-SYN是有效的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列,通过载体介导的RNAi方法可以有效抑制MN9D细胞中的α-synuclein表达,这为进一步研究α-synuclein蛋白的生理功能及其在帕金森病（Parkinson’s disease,PD）发病中的作用提供了良好的细胞模型;α-synuclein在维持MN9D细胞活力中起到重要作用,α-synuclein功能缺失会导致细胞直接或间接的损伤。