转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗多巴胺毒性作用的研究

目的：探讨囊泡单胺转运体（vesicular monamine transporter-2,VMAT2）对多巴胺（dopamine,DA）毒性的抵抗作用。方法：采用细胞免疫荧光染色法测定VMAT2基因在转染的CHO细胞（VMAT2-CHO）中的表达;MTT比色法检测不同浓度DA作用下的野生型CHO（WT－CHO）和VMAT2-CHO细胞存活率;应用ELISA法DA检测试剂盒测定细胞内DA的水平;采用活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧的水平。结果：VMAT2-CHO细胞内有较强的特异性荧光表达,主要定位在核周区域,胞浆中也有散在的荧光; 0.25～0.4mmol/L DA作用72h, VMAT2-CHO细胞存活率显著高于WT-CHO细胞（P<0.05）;0.4mmol/L DA作用于WT-CHO和VMAT2-CHO细胞24?h,VMAT2-CHO细胞内DA为（199.33±15.155）ng/ml,显著高于WT-CHO细胞（141.4±8.784）ng/ml（P<0.01）;而细胞内活性氧（ROS）水平则由（144.490±5.295 ）U/106cells增加至WT CHO细胞的（217.895±15.885）U/106cells（P<0.01）。结论：转染VMAT2的CHO细胞对DA引起的毒性有显著的抵抗作用。     

利血平和多巴胺对大鼠嗜铬瘤细胞生长的影响

目的：研究囊泡单胺类转运体(VMAT)功能抑制在帕金森病发病机制中的作用途径。方法：用MTT法及流式细胞仪观察VMAT功能抑制对大鼠嗜铬瘤细胞(PC12)存活的影响和细胞死亡方式。结果：单独作用的VMAT抑制剂利血平对PC12细胞无毒性作用；超过一定浓度的多巴胺(0．2mmol／L)对PC12细胞有毒性作用；利血平协同多巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同样浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加。随着多巴胺浓度的增加脂质过氧化物丙二醛(MDA)亦相应增加。受药物毒性作用的PC12细胞主要以凋亡途径死亡。结论：VMAT功能抑制触发的多巴胺内源性毒性可能通过氧化应激诱发凋亡和坏死而发挥毒性作用。     

囊泡单胺类转运体功能抑制对PC12细胞凋亡的影响

目的：研究帕金森病黑质多巴胺神经元的死亡机理。方法：用四甲基偶氮唑盐（MTT）法及流式细胞仪观察囊泡单胺类转运（VMAT）功能抑制对大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞凋亡的影响。结果：单独作用的VMT抑制剂和利血平对PC12细胞无毒性作用，超过一定浓度的多巴胺（0．3mmol/L）对PC12细胞有毒性作用，利血平协同钦巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同伴浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加，致使较低浓度的多巴胺（0．15mmol/L）就可降低PC12细胞生存率，结论：VMAT功能抑制引发了多巴胺的内源性毒性，进而诱发多巴胺神经元的凋亡，可较好地解释帕金森病的发病机理。     

囊泡单胺类转运体功能抑制对PC12细胞的毒性及抗氧化剂的干预

目的：研究囊泡单胺类转运体(VMAT)功能抑制对大鼠嗜铬瘤(PC12)细胞产生的内源性毒性及抗氧化剂的保护作用。方法：用流式细胞仪观察VMAT功能抑制以及不同干预方法对PC12细胞存活的影响和细胞死亡方式。结果：单独加入VMAT抑制剂利血平对PC12细胞无毒性作用；利血平协同多巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同样浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加。加入还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTF)和脉冲1号使PC12细胞的生存率明显提高。结论：VMAT功能抑制触发了多巴胺内源性毒性可诱发细胞凋亡，具有抗氧化作用的制剂有细胞保护作用。     

囊泡单胺类转运体功能抑制在帕金森病发病机制中作用的研究

帕金森病（PD）发病机制有多种学说，近年的科学研究从帕金森病黑质多巴胺能神经元选择性受损出发，发现黑质纹状体系统自身的多巴胺递质囊泡转运体（VMAT２）受到抑制而触发的多巴胺内源性毒性可能在帕金森病发病机制中起了关键的作用犤１，２犦。２０００～２００２年，本课题组通过研究加入VMAT特异性抑制剂利血平（RE）后犤３犦，cDNACHO细胞（转PC１２细胞含VMAT２基因的转基因中国仓鼠卵细胞）和野生株中国仓鼠卵细胞（wtCHO细胞）的死亡方式及多巴胺毒性在大鼠嗜铬瘤细胞（PC１２）细胞的作用途径，探讨了PD的发病机制…     

利血平对多巴胺所致PC12细胞程序性死亡的影响

目的 :探讨帕金森病黑质多巴胺神经元的死亡机制。　方法 :用MTT法及流式细胞仪检测和观察囊泡单胺类转运体 (VMAT)抑制剂利血平对多巴胺所致的毒性作用和细胞程序性死亡的影响。　结果 :利血平 ( 10 0 0nmol/L)作用于大鼠嗜铬细胞瘤 (PC12 )细胞 96h ,对细胞无毒性效应 ;多巴胺 ( 0 .4mmol/L)作用于PC12细胞 4 8h即出现毒性效应 ;利血平 ( 10 0 0nmol/L)与多巴胺能够明显增强多巴胺 ( 0 .4mmol/L)的毒性效应 (P <0 .0 1) ,二者的协同毒性效应还具有时间依赖性。当多巴胺浓度 ( 0 .2mmol/L)较低时 ,协同毒性效应在药物作用 96h才显现出来。同时毒性效应主要是通过诱导细胞程序性死亡来实现的。　结论 :VMAT功能下降加重或触发多巴胺的内源性毒性 ,诱导多巴胺神经元的程序性死亡 ,可能参与帕金森病的发病机制。     

双氢青蒿素对人骨髓增生异常综合征细胞凋亡的影响及机制研究

目的研究双氢青蒿素（DHA）对人骨髓增生异常综合征（MDS）细胞凋亡的作用及机制,并进一步探讨其与化疗药物联合使用的协同疗效。方法以MDS细胞株SKM-1为对象,分别加入不同浓度DHA、固定浓度DHA和不同种类凋亡抑制剂、固定浓度DHA和不同种类化疗药物[阿扎胞苷（5-AZ）或阿糖胞苷（Ara-C）]。采用细胞增殖和毒性检测（CCK-8）法检测不同处理组细胞存活率,采用碘化丙啶染色法检测细胞生存状态,采用流式细胞术测定细胞内活性氧（ROS）水平。结果DHA对SKM-1细胞增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性。凋亡抑制剂可逆转DHA对SKM-1细胞增殖的抑制作用。与单独使用化疗药物相比,DHA联合5-AZ或Ara-C处理细胞,SKM-1细胞存活率明显降低。随着药物浓度增高,细胞凋亡率增高,ROS水平增高;DHA联合5-AZ或Ara-C处理细胞,细胞ROS水平进一步增高,凋亡效果更明显。结论DHA可诱导SKM-1发生细胞凋亡,且呈浓度依赖性;与5-AZ和Ara-C联合使用可产生协同增效作用。     

6-羟多巴胺及囊泡单胺类转运功能抑制对PC12细胞凋亡的影响

目的探讨6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)及囊泡单胺类转运体(vesicular monoamine transport-er,VMAT)功能抑制对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞细胞凋亡的影响。方法不同浓度6-OHDA(25、50、100、200μmol/L)及VMAT功能抑制剂利血平(50、100、400、1 600nmol/L)与6-OHDA(100μmol/L)作用于PC12细胞,于不同时间点(12、24、36、48h)用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并用Western blot法检测PC12细胞Bcl-2蛋白及Bax蛋白活性。结果加入不同浓度的6-OHDA时PC12细胞凋亡随6-OHDA浓度增加显著上升,并且引起Bcl-2蛋白表达抑制,Bax蛋白表达上升,具有时间依赖性。加入利血平后,相应的细胞凋亡增多,Bcl-2蛋白表达降低明显,Bax蛋白表达增多,差异有统计学意义。结论研究提示6-OHDA能诱导PC12细胞凋亡,并呈剂量及时间依赖性,其作用机制涉及到VMAT功能抑制触发了6-OHDA的内源性毒性,抑制Bcl-2蛋白的表达,促进细胞内Bax的表达,进而诱发多巴胺能神经元的凋亡。     

氯化锰致PC12细胞损伤的研究

探讨氯化锰（MnCl2）对PC12细胞的损伤作用。方法：构建MnCl2诱导的PC12细胞模型，用MTT法检测细胞存活率，用荧光分光光度法检测乳酸脱氢酶（LDH）和活性氧（ROS）生成量，用化学比色法测定细胞内丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：MnCl2诱导的PC12细胞存活率明显下降，并与诱导时间和浓度呈正相关；MnCl2使PC12细胞LDH外溢量和ROS生成量显著增加，同时细胞内MDA含量增加，SOD活性下降。结论：MnCl2可导致PC12细胞的氧化损伤。     

NF-κB抑制剂干预前后软骨藻酸对PC12细胞存活率的影响

目的研究核转录因子κB（NFκB）抑制剂（PDTC）干预前后软骨藻酸（DA）对PCI2细胞存活率的影响。方法免疫荧光细胞化学法测定软骨藻酸对PCI2细胞NFκB蛋白的影响;MTT法检测PCI2细胞的存活率。结果随着DA染毒剂量的升高,PCI2细胞NFκB表达均升高（P〈0．05）;PDTC干预后,PCI2细胞存活率均升高。结论DA可诱导PCI2细胞NFκB表达增加;PDTC具有一定的保护作用,可明显提高PCI2细胞的存活率。     

CHO细胞中VMAT2的鉴定及应用

目的鉴定转染囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)基因在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)细胞中VMAT2的表达情况。方法采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR、免疫电镜的方法,分别从形态学、分子生物学和微观亚细胞结构角度来确定VMAT2的表达。结果免疫荧光染色显示VMAT2-CHO表达明亮的绿色荧光;逆转录聚合酶链反应电泳显示VMAT2-CHO出现180 bp的阳性条带;VMAT2-CHO细胞中免疫胶体金颗粒分布在细胞核周膜性结构上。结论转染VMAT2基因的CHO细胞可以稳定且大量表达VMAT2,有望成为研究VMAT2功能与帕金森病关系的单一的细胞模型。     

Neurotoxic effect of rotenone on dopaminergic neuron PC12 in vitro

Objective： To investigate the mechanism of oxidative stress in rotenone neurotoxicity to dopaminergic neuron PC12. Methods： High differentiated PC12 cells as dopaminergic neurons were treated by different concentrations of rotenone. The morphology was observed with inverted phase contrast microscope and transmission electron microscope. Cell viability and proliferation inhibition were assessed by MTT. SOD and MDA were detected with biochemical assay. And the specific fluorescent probe （DCF-DA） was used to examine ROS in PC12 cells. Results： After treated with rotenone for 24 h, most of the PC12 cells became smaller and rounder. The process of axon was reduced, shortened or broken in a time and concentration dependent manner. The mitochondrial structure and metabolism were changed. Endoplasmic reticulum expanded and the free ribosome increased. Compared with the control group, cell proliferation inhibition increased and cell viability decreased. SOD increased and MDA decreased. The intensity of fluorescence was more obvious in PC12 cells treated by rotenone compared with control group. Conclusion： Rotenone is neurotoxic to cultured dopaminergic neuron PC12. Rotenone might exert this effect through the metabolism of oxidative stress on the pathogenesis of the neuron.     

齐留通减轻小鼠小胶质细胞介导的鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用

目的：观察5 脂氧酶选择性抑制剂齐留通对小胶质细胞介导的鱼藤酮神经毒性的影响。方法：以鱼藤酮预处理的小鼠小胶质BV2细胞条件培养液培养PC12细胞,通过MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放分析PC12细胞损伤和活性变化,Hoechst/碘化丙啶荧光双染检测PC12细胞死亡,并评估齐留通对小胶质细胞介导细胞毒性的作用。结果：1、3、10 nmol/L鱼藤酮对PC12细胞无直接毒性,但是其预处理的BV2细胞条件培养液间接诱导PC12细胞形态改变、活性下降,LDH释放和细胞死亡明显增加;001、1 μmol/L齐留通能有效减轻小胶质细胞介导的鱼藤酮细胞毒性作用。结论：5 脂氧酶抑制剂齐留通能减轻小胶质细胞介导的鱼藤酮神经毒性,提示5 脂氧酶通路在小胶质细胞炎症诱导的神经细胞死亡中有重要作用。     

半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的关系。方法:鱼藤酮及CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特处理PC12细胞后,以MTT方法检测PC12细胞活性变化;以Western blotting检测鱼藤酮处理前后,PC12细胞CysLT1受体的表达变化;不同浓度鱼藤酮处理24 h及3μmol/L鱼藤酮处理不同时间,以免疫细胞化学方法观察CysLT1受体分布变化。结果:鱼藤酮(0.3～30μmol/L)可诱导PC12细胞损伤,孟鲁司特(1、5μmol/L)可显著减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤。1～10μmol/L鱼藤酮作用PC12细胞24 h及3μmol/L鱼藤酮处理3 h和24 h,均可诱导CysLT1受体蛋白水平表达升高。鱼藤酮能浓度和时间依赖性引起CysLT1受体从细胞核移位到细胞浆。结论:CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤。     

帕金森病细胞模型的建立及鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性作用

目的：建立帕金森病细胞模型,研究鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性作用及机制。方法：PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元,加入不同浓度鱼藤酮（0、10、25、50、75和100 nmol•L^-1）,观察细胞形态改变;鱼藤酮处理PC12细胞24、48和72 h,MTT法检测细胞活性;免疫组化和免疫荧光法观察α-synuclein 在胞内聚集情况;AO/EB双染检测细胞凋亡。结果：神经生长因子（NGF）诱导后PC12细胞形状不规则,突起增多变长,细胞间连接增多;染毒后细胞突起结构逐渐消失,细胞体积变小、形态变圆。50 nmol•L^-1鱼藤酮作用24 h后PC12细胞活力开始低于对照组（P<0.05）,随着浓度增大,细胞活力进一步下降,呈浓度依赖性（P<0.01）;随着作用时间延长,细胞活力亦逐渐下降,不同时间组间比较差异有显著性(P<0.01)。免疫组化结果显示,胞浆中出现棕色的类圆形α-synuclein染色阳性颗粒;免疫荧光显示,胞浆中有α-synuclein标记的强绿色荧光的蛋白聚集。染毒细胞逐渐呈现出早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞状态。结论：鱼藤酮对多巴胺能神经元有毒性作用,可形成类包涵体样蛋白聚集并诱导细胞凋亡。α-synuclein 代谢异常及细胞凋亡可能在鱼藤酮所致的帕金森病发病机制中发挥重要作用。     

Ⅱ型单胺囊泡转移体在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的构建稳定表达Ⅱ型单胺囊泡转移体（VMAT2）的SH-SY5Y细胞系。方法构建VMAT2真核表达载体，利用脂质体转染神经母细胞瘤SH-SY5Y，选择筛选后挑取单克隆扩大培养，通过Western-blot及免疫荧光的方法鉴定蛋白质在细胞中的表达，并通过免疫双荧光技术对VMAT2在细胞系中的分布进行定位。结果Western-blot及免疫荧光结果显示该蛋白在挑选的细胞系中有高效表达。免疫双荧光结果显示表达的蛋白定位在大密度核心囊泡（LDCV）。结论该细胞系的成功构建为研究VMAT2在帕金森氏病（PD）发病机制中的作用奠定良好的基础。     

Delta4的功能性研究及与其他Notch配体的比较

目的：探讨Delta4基因在Notch传导机制中的作用。方法：构建pTracer．CMV．Delta4．FLAG载体，瞬时转染COS7细胞、稳定转染CHO细胞，筛选高表达Delta4的稳定CHO细胞系。用Luciferase分析，观察并比较Delta4对Notch1—CHO及Notch2-CHO两个宿主细胞的信号功能活性，与Deha1、Jagged1及Jagged2比较，从而对此基因定性并获知其信号功能活性水平。结果：Western—blot证实pTracer．CMV．Delta4．FLAG可瞬时转染COS7细胞及稳定转染CHO细胞，并根据Delta4蛋白表达条带的强弱筛选高表达Delta4-CHO细胞系。Delta4对Notch1及Notch2均具有信号功能活性，且对后者的活性功能水平大于前者。对Notch1，Delta4的功能活性略低于Jagged2，但高于Deha1及Jagged1；对Notch2，Delta4的功能活性低于Delta1、Jagged1及Jagged2，但亦具有较强的活性水平。结论：建立的Delta4-CHO细胞系功能稳定，Delta4为Notch1及Notch2的配体，且对Notch2的活性水平高于Notch1。     

吲哚美辛对喉癌Hep-2细胞增殖与iNOS活性的影响

目的：探讨吲哚美辛对喉癌细胞增殖与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性的影响,为喉癌的预防和治疗提供理论依据。方法： Hep-2细胞培养于含吲哚美辛（30、60、125和250 μmol•L^-1）的培养基中,分别培养24 h和48 h;用MTT方法检测吲哚美辛组细胞增殖的抑制率,用台盼蓝染色法检测吲哚美辛组细胞活力的抑制作用,并与溶剂对照组进行比较;吲哚美辛（125、250和500 μmol•L^-1）与脂多糖（LPS,10 μmol•L^-1）同时处理细胞16　h,同时设只加LPS对照组,采用酶法和分光光度法检测细胞培养上清液中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活性。结果：与对照组比较,不同浓度的吲哚美辛（30、60、125和250 μmol•L^-1）组Hep-2细胞增殖的抑制率均显著增加（P<0.05）。相同浓度的吲哚美辛,随作用时间延长,Hep-2细胞增殖的抑制率显著降低（P<0.05）;与对照组比较,不同浓度的吲 哚美辛（30、60、125和250 μmol•L^-1）随剂量增加,Hep-2细胞活力的抑制程度均显著增加（P<0.05）。相同浓度的吲哚美辛,随作用时间延长,Hep-2细胞活力的抑制程度显著降低（P<0.05）;与LPS对照组比较,吲哚美辛在125、250及500 μmol•L^-1浓度时, LPS诱导的细胞培养上清液中iNOS的活性显著降低（P<0.05）。结论：吲哚美辛在30～250 μmol•L^-1浓度范围内显著抑制Hep-2细胞的细胞增殖与细胞活力,明显降低LPS诱导的细胞 iNOS的活性升高。