HSV-tk与p53基因对涎腺多形性腺瘤细胞的杀伤作用

目的　观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因、野生型p53基因(wt-p53)联合杀伤人涎腺 多形性腺瘤细胞的效果。方法　采用腺病毒介导的HSV-tk基因、wt-p53基因联合转染人涎腺多形性腺瘤细胞,逆 转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测转染后的基因表达;四唑盐比色(MTT)法测定tk与p53基因治疗后对肿瘤细 胞的杀伤作用及旁观者效应,并采用相差显微镜观察基因治疗后肿瘤细胞的形态学变化。结果　单独转染wt-p53 及HSV-tk/GCV基因5 d后,涎腺多形性腺瘤细胞的存活率分别为54%和38%;两者联合转染5 d后,细胞的存活率 降至20%,两者差异有显著性(P<0.05)。结论　HSV-tk、wt-p53基因联合应用对涎腺多形性腺瘤的杀伤作用强于 此两基因单独应用的杀伤作用。     

自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用

目的：探讨HSV-TK／GCV系统对MEC-1细胞的体外作用。方法：用脂质体介导将含有HSV1-TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC-1，经G418筛选，挑选阳性克隆，用PCR及RTPCR检测目的基因的整合及mRNA转录；分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应；用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC-1／TK的形态学变化。结果：PCR及RT-PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出404bp的特异性基因片段，将此G418抗性克隆命名为MEC-1／TK；IC50MEC-1／TK为0．7μg／m1，而MEC-1为1000μg／m1以上；当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合，TK阳性细胞只占10％时，即有90％的细胞被杀死；形态学观察表明，经GCV作用，MEC-1／TK细胞变圆、脱壁、漂浮，部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征，TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多。结论：HSV-TK／GCV系统在体外能明显杀伤MEC-1细胞，对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高1000倍以上，并显示较强的旁观者效应；GCV可诱导部分MEC-1／TK细胞发生凋亡。     

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统治疗舌癌的实验研究

目的　探讨腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpessimplexvirusthymidinekinase,HSV TK) /丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)自杀基因系统对舌鳞癌细胞系的治疗作用。方法　RT PCR检测重组腺病毒感染Tca8113舌鳞癌细胞系后TK基因的表达情况 ;MTT法检测HSV TK/GCV系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果　AdCMVHSV TK可在舌癌细胞中表达TK基因并具有高转染率 ;HSV TK/GCV系统对舌癌细胞具有杀伤作用 ,杀伤呈时间和剂量依赖性 ;但该系统的旁观者效应差。结论　HSV TK/GCV自杀基因系统对舌鳞癌细胞系具有一定的杀伤作用     

腺病毒介导HSV-TK/GCV与IL-2基因对人涎腺腺样囊性癌的抑制作用

目的探讨腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,HSV-TK/GCV）与白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）基因联合应用对涎腺腺样囊性癌的抑制和杀伤作用。方法将0.2 ml细胞浓度为2×107/ml的涎腺腺样囊性癌高转移细胞株（salivary adenoid cystic carcinoma cell line withhigh tendency of lung metastasis,ACC-M）的细胞悬液接种于20只裸鼠皮下,建立涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型。随机将20只荷瘤裸鼠分为A组：HSV-TK/GCV和IL-2联合基因治疗组（TK（IL-2组）;B组：HSV-TK/GCV组（TK组）;C组：空病毒组（EGFP组）;D组：ACC-M组;每组5只。分别于瘤体内注射TK（IL-2;TK;EGFP和无菌生理盐水。注射48小时后,对A、B、C组裸鼠每日腹腔注射GCV,D组每日腹腔注射生理盐水,连续10天。最后一次给药后第二天处死裸鼠,观察各组裸鼠的肿瘤体积和瘤重的变化,计算肿瘤生长抑制率;对移植瘤进行组织病理学观察;应用流式细胞仪检测移植瘤的细胞凋亡情况。结果在A组和B组中,ACC-M的生长均受到显著抑制。治疗后体积数减少,与ACC-M组比较差别有极显著性（P〈0.01）。A组和B组抑瘤率分别为91%和76%;光镜下观察A组和B组均出现了明显的细胞凋亡;流式细胞仪检测A组和B组有明显的凋亡峰出现,凋亡率分别为30.55±0.23和13.53±0.32;C组凋亡率为10.07±0.31,D组凋亡率为8.34±0.41%。除C、D组之间差别无明显性外,其余各组之间差别均有极显著性（P〈0.01）。A组和B组的细胞S期比例明显增加,G2/M期比例明显降低。结论 HSV-TK/GCV联合IL-2基因对ACC-M移植瘤有明显抑制作用,抑瘤效果优于单独应用HSV-TK/GCV系统。     

涎腺多形性腺瘤恶变机制的研究进展

涎腺多形性腺瘤是最常见的涎腺上皮性肿瘤,多次复发或病程长者可恶变为恶性多形性腺瘤.涎腺多形性腺瘤的恶变是多因素、多基因变异的综合病变过程.研究发现,细胞遗传学改变、癌基因、抑癌基因、黏附分子及细胞外基质蛋白在涎腺多形性腺瘤的恶变过程中均有一定的作用.本文就多形性腺瘤恶变机制的研究进展作一综述.     

涎腺疾病

Genistein对唾液腺腺样囊性癌细胞株SACC-83的体外抗增殖作用；HSV-tk与p53基因对涎腺多形性腺瘤细胞的杀伤作用；腮腺良性肿瘤切除的改良术式；抑癌基因PTEN在腮腺肿瘤中的突变与缺失；基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在涎腺多形性腺瘤生物学行为中的意义；涎腺透明细胞癌10例临床病理分析；……[编者按]     

Gli2基因在涎腺多形性腺瘤中的表达及其意义

目的:探讨Gli2基因在涎腺多形性腺瘤和正常涎腺组织中的表达水平及其在多形性腺瘤发生发展中的作用。方法:收集20例腮腺多形性腺瘤组织和20例相对应的瘤旁正常腮腺组织,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测Gli2基因mRNA的表达水平,分析其表达变化,并探讨Gli2基因在涎腺多形性腺瘤发生发展中的作用及其临床应用价值。结果:与正常腮腺组织相比,多形性腺瘤组织中Gli2基因mRNA的表达水平升高。结论:多形性腺瘤中Gli2 mRNA的高表达可诱导肿瘤细胞持续增殖,提示Gli2基因可能在涎腺多形性腺瘤的发生发展中具有重要作用。     

野生型p53对涎腺多形性腺瘤细胞突变基因的修复

目的检测涎腺多形性腺瘤基因突变方式及野生型p53对突变基因的修复。方法留取4例涎腺多形性腺瘤新鲜标本，进行原代细胞培养。采用野生型p53基因转染培养细胞，通过逆转录聚合酶链反应检测转染后的基因表达。提取转染后各例细胞DNA及对应的肿瘤组织DNA，分别进行PCR反应扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳及核酸序列测定分析。结果PCR-单链构象多态性分析显示，3例出现异常电泳带。核酸序列测定结果显示，第6外显子的第203号密码子点突变；第8外显子的第272至290号密码子之间出现碱基缺失和碱基插入。野生型p53转染后的细胞DNA序列分析显示，p53第6和第8外显子的5个突变位点均恢复正常。结论涎腺多形性腺瘤发生过程中具有较高频率的p53基因突变，突变方式多样，涉及多个密码子；外源性野生型p53可有效地修复涎腺多形性腺瘤细胞中突变的p53基因位点。     

HSV-TK/GCV联合IL-2治疗舌癌移植瘤的机制探讨

目的:观察HSV-TK联合IL-2对舌癌细胞的生长抑制作用,并探讨HSV-TK与IL-2联合应用对舌癌抑制和杀伤的机制.方法:建立舌癌Tca8113移植瘤动物模型,采用HSV-TK联合IL-2对移植瘤进行体内转染,观察肿瘤生长情况.使用RT-PCR检测HSV-TK基因和IL-2基因的表达情况;应用流式细胞仪检测移植瘤的凋亡情况;采用免疫组化法检测移植瘤中CD4和CD8蛋白的表达情况.结果:移植瘤体积生长曲线表明TK组(C组)及TK联合IL-2 组(D组)肿瘤的生长明显受到抑制.TK组抑瘤率为40.1%,TK联合IL-2组抑瘤率为80.2%.RT-PCR检测目的基因HSV-TK基因和IL-2基因已整合入肿瘤细胞中且稳定表达.流式细胞仪检测A组(对照组)和B组(病毒组)凋亡峰不明显,而C组和D组凋亡峰明显.对照组、病毒组、TK组、TK联合IL-2组凋亡率分别为(6.77±1.31)、(7.08±1.28)、(13.22±3.28)、(28.90±6.50).除对照组、病毒组无明显差异(P＞0.05),其他任2 组之间比较均有显著性差异(P＜0.01).在TK联合IL-2组,肿瘤细胞周围有大量CD4和CD8阳性的淋巴细胞浸润.结论:HSV-TK和IL-2治疗后可显著抑制Tca8113移植瘤的生长.HSV-TK与IL-2基因联合应用,其治疗效果较单独应用HSV-TK明显提高.HSV-TK可明显杀伤Tca8113移植瘤细胞,而IL-2可以诱导机体抗肿瘤免疫反应.     

基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在涎腺多形性腺瘤生物学行为中的意义

目的 研究涎腺多形性腺瘤中基质金属蛋白酶(MMP)-2、9及其组织抑制剂(TIMP)-1、2的表达变化与其生物学行为的关系。方法 用免疫组化SP法和明胶酶谱法分别检测9例普通型和14例生长活跃型多形性腺瘤中MMP-2、9及TIMP-1、2的阳性表达及细胞定位，分析其中酶原与活性酶的含量比例。结果 MMP-2及MMP-2／TIMP-1、MMP-2／TIMP-2的比值在生长活跃型多形性腺瘤中的表达高于普通型，活性MMP-2、MMP-9酶原和活性酶在生长活跃型多形性腺瘤中的表达明显高于普通型，涎腺良性肿瘤与普通型多形性腺瘤间、涎腺恶性肿瘤与生长活跃型多形性腺瘤间差异无统计学意义。结论 涎腺生长活跃型多形性腺瘤与涎腺恶性肿瘤有相似的MMP-2、9和TIMP-1、2表达特征，而普通型多形性腺瘤中MMP-2、9和TIMP-1、2的表达与涎腺良性肿瘤相近。检测MMPs、TIMPs有助于判断涎腺多形性腺瘤的生物学行为。     

HSV-tk/GCV系统对ACC-M细胞作用的体外试验

目的：为研究ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统对涎腺腺样囊性癌细胞株（ＡＣＣ－Ｍ）细胞的体外杀伤作用。方法：采用ＭＴＴ法和细胞计数法对ＧＣＶ在不同剂量和不同作用时间时细胞的生存率进行研究。结果：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ－Ｍ细胞，杀伤呈时间依赖性和剂量依赖性，这种作用有比较明显的旁杀伤效应，旁杀伤效应的强弱与细胞间的接触程度呈正比关系。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ细胞，可望用于ＡＣＣ的治疗。     

全反式维甲酸提高HSV-TK/GCV系统治疗舌鳞癌旁观者效应的研究

目的：探讨全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA)对单纯疱疹病毒胸苷酸激酶（herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)／丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV)系统治疗舌鳞癌旁观者效应的增强作用及机制。方法：应用免疫细胞化学、流式细胞仪等技术，对ATRA诱导舌鳞癌细胞系（Tca8113)细胞间隙连接蛋白基因（Cx43的表达进行分析；采用析因分析法分析ATRA对HSV－TK／GCV系统旁观者效应的影响。结果：舌鳞癌细胞经10^-7mol/L-10^-5mol/L ATRA处理后Cx43蛋白的表达明显提高；阳性细胞计数率由处理前的5．17％上升至30．53％（10^-5mol/L ATRA)，经t检验处理组与非处理组间差异有显著性（P＜0．01）；舌鳞癌细胞经ATRA处理后增强了HSV－TK／GCV系统的旁观者效应，两者间存在交互作用（P＜0．05）。结论：ATRA可显著提高HSV－TK／GCV系统的旁观者效应，该作用可能通过诱导Cx43蛋白的表达而实现。     

Synthetic radiation‐inducible promoters mediated HSV‐TK/GCV gene therapy in the treatment of oral squamous cell carcinoma

Oral Diseases (2010) 16 , 445–452 Objective: To investigate the therapeutic effect of herpes simplex virus thymidine kinase (HSV‐TK) gene mediated by synthetic radiation‐inducible promoters in the treatment of oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro and in vivo . Methods: The plasmids pcDNA3.1(+)E6‐HSV‐TK were constructed, in which the HSV‐TK genes were mediated by synthetic radiation‐inducible promoters. The recombined plasmids were transfected into the Tca8113 cells and golden hamster buccal carcinoma, respectively. Low‐dose radiotherapy was used to upregulate the HSV‐TK genes expression. HSV‐TK mRNA was assayed by RT‐PCR. Apoptosis and proliferating cell nuclear antigen were detected respectively by in situ end‐labeling and immunohistochemical method. Results: Compared with control group, the comparative survival rate of Tca8113 cells in HSV‐TK/GCV/IR group was markedly decreased and the golden hamster buccal carcinoma in HSV‐TK/GCV/IR group was obviously suppressed. Up‐regulation of HSV‐TK gene expression was found in the Tca8113 cells and in the golden hamster buccal carcinoma resulting from exposure to low‐dose irradiation. The apoptosis indexes in Tca8113 cells or golden hamster buccal carcinoma with irradiation were markedly higher than those without irradiation. At the same time, the proliferation indexes in Tca8113 cells or golden hamster buccal carcinoma with irradiation were markedly lower than those without irradiation. Conclusion: The results indicate that the synthetic radiation‐inducible promoters can serve as a molecular switch to adjust the expression of HSV‐TK gene in the treatment of OSCC, and low‐dose induction radiation can significantly improve therapeutic efficiency.     

涎腺腺样囊性癌自杀基因治疗的实验研究

为 检测单纯疱疹病毒胸革激酶基因／无环鸟苷自杀基因治疗系统对高转移性涎腺腺样囊性癌细胞的体内治疗作用。方法 将肿瘤细胞接种于裸鼠两肋下,腹腔给予线日５０ｍｇ＝ｋｇ体重,２次／ｄ,连用１４ｄ。结果 实验组均不致瘤,而对照组均致瘤。用 原注射治疗移植瘤,可明显抑制肿瘤生长,抑制作用有较明显的旁杀伤效应,但远处旁杀伤效应不十分明显,结论ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ地体积较小的肿瘤有较发的作用,而对体积较大的 欠     

8-Br-cAMP提高HSV-TK/GCV自杀基因系统旁观者效应的研究

目的 探讨8-Br-cAMP对单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）/丙氧鸟苷（GCV）系统旁观者效应的增强作用及机理。方法 应用FCM、透射电镜检测8-Br-cAMP对口腔鳞癌细胞（Tca8113）、间隙连接蛋白43（Cx43）及间隙连接的诱导分化作用;采用析因分析法分析8-Br-cAMP对HSV-TK/GCV系统旁观者效应的影响。结果 口腔鳞癌细胞经 10-4mol/L 8-Br-CAMP处理后:FCM检测显示 Cx43表达阳性的细胞由治疗前的（4.8 ± 0.26）％上升到（21.3±0.65）％,两组比较P<0.001;透射电镜显示细胞超微结构出现分化,细胞间出现间隙连接;MTT检测显示增强了HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应,两者间存在协同关系。结论8-Br-cAMP可诱导分化口腔鳞癌细胞并显著提高HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应。     

TK基因重组质粒的构建及在ACC-2细胞中的表达

目的：克隆胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因，构建质粒表达载体pIRES—TK，并利用该载体转染ACC-2细胞，建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞克隆。方法：通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX—TK中扩增出TK基因全长序列，将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中，构建重组表达载体pIRES—TK，用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞，经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株，提取该细胞株的总RNA，用RT—PCR检测TK基因的表达。结果：PCR扩增出1128 bp大小的片段，测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致；阳性重组质粒pIRES—TK经XhoI和Mull双酶切后获得2692 Bb和1128 bp的片段；RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361 bp的预期片段。结论：成功扩增了TK基因的DNA片段；成功构建了质粒表达载体pIRES—TK；建立了稳定表达TK基因的ACC～2细胞株，为TK／GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础。     

腺病毒介导CD/5-FC系统治疗舌癌的实验研究

目的:探讨胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对舌癌细胞株的治疗效果。方法:应用透射电镜、RT-PCR检测含CD基因的重组腺病毒(AdCMVCD)对舌癌细胞株Tca8113的转染及表达情况,MTT法检测AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应,FCM检测该系统对舌癌细胞周期的影响。结果: AdCMVCD可转染入舌癌细胞的胞核并表达CD基因;AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞具有强杀伤作用和旁观者效应;FCM检测结果显示舌癌细胞S期比率显著升高(P<01001),G2+M期比率下降为0(P<01001),G1/G0期的改变不明显(P>0105)。结论:AdCMVCD/5-FC自杀基因系统对舌癌细胞株具有强的杀伤作用,杀伤作用具有细胞周期 (S期)特异性。