人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测

目的 研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性.方法 取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418 筛选稳定表达细胞克隆;酶免疫法及RT-PCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达;制备抗CD59多克隆抗体,MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性.结果 野生型及突变型CD59质粒扩增成功,并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株;与野生型CD59 相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异.结论 CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,有望应用于肿瘤治疗.     

CD59-siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用

目的探讨针对CD59的siRNA(CD59-siRNA)对人卵巢癌裸鼠移植瘤CD59的沉默效应及其抑瘤作用。方法采用脂质体转染法将CD59干扰质粒(T组)和空质粒(V组)转染A2780细胞,获得稳定表达细胞株,将T组、V组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型,通过绘制肿瘤生长曲线、RT-PCR和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对CD59基因及蛋白的沉默效应。结果与V组和C组比较,T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01~30.41,P<0.05),CD59基因及蛋白表达减少(F=817.77、247.71,q=26.59~52.25,P<0.05)。结论特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达及卵巢癌在体内的生长。     

CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响

目的 观察CD59结合短肽(sp22)对补体介导高表达人CD59分子的PC-3细胞溶解的影响.方法 利用脂质体法将携带人野生型CD59基因的pIRES质粒(wCD59-pIRES)转染PC-3细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,荧光免疫组化技术检测细胞表面CD59分子的表达,补体溶解试验观察sp22和抗CD59单克隆抗体对补体介导的高表达CD59分子的PC-3细胞溶解的影响.结果 高表达CD59分子的PC-3细胞株构建成功;与对照组比较,sp22组转染细胞的溶解率显著升高(F=719.552,q=12.181～79.942,P＜0.05);相同浓度条件下,sp22组转染细胞的溶解率明显高于抗CD59单克隆抗体组(q=7.805～12.280,P<0.05).结论 sp22可封闭PC-3细胞表面高表达CD59分子的补体结合位点,显著增强抗PC-3细胞抗体所诱发的补体介导的抗瘤作用.     

CD59与CD55锚固蛋白对T细胞活化信号转导的作用

目的研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固蛋白CD59、CD55在脂筏介导T细胞信号转导通路中的作用。方法应用siRNA技术,构建针对CD55与CD59基因的重组载体pSUPER-siCD55、pSUPER-siCD59。实验分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染pSUPER-siCD59重组质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)及转染pSUPER-siCD55重组质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)。RT-PCR方法检测转染细胞中CD55和CD59基因mRNA的表达。噻唑蓝(MTT)比色法和激光共聚焦扫描显微镜分别检测CD55与CD59联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应以及细胞内钙离子的变化。结果与Ⅰ组比较,Ⅱ组细胞CD59和Ⅲ组细胞CD55 mRNA的表达均明显减少(F=595.14、699.06,q=45.70~47.25,P<0.05)。Ⅰ组细胞CD55与CD59联合作用后增殖能力和钙离子浓度均明显高于Ⅱ组、Ⅲ组(F=97.02、189.47,q=13.69~26.39,P<0.01),Ⅱ组低于Ⅲ组(q=5.43、6.42,P<0.05)。结论 CD59和CD55在T细胞活化信号转导通路中存在协同效应,其中CD59起到重要作用。     

CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

目的 构建CD59突变的重组体,研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase-3表达的变化.方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术,将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸,克隆入pALTER-MAX质粒,采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞.G418筛选稳定表达细胞克隆,用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株,用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase-3表达的变化.结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒.转染突变CD59后Hela细胞内caspase-3表达明显减少,与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义(t=2.846,P<0.01).结论 caspase-3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径.     

XIAP基因与耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/Taxol耐药关系的研究

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因与卵巢癌对紫杉醇耐药的相关性。方法 以5、10、20、40、80、160、320 ng/mL的紫杉醇处理卵巢癌紫杉醇敏感细胞A2780和耐药细胞A2780/T,噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的抑制率（IR）, 逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印记（Western blot）检测紫杉醇100 ng/mL处理A2780和A2780/T细胞后XIAP基因和蛋白的表达;将A2780/T细胞分为空转染组（转染空载体质粒）、小干扰RNA（siRNA）-XIAP（siRNA-XIAP）组（转染siRNA-XIAP质粒）、非特异性转染组（转染非特异性质粒）、空白对照组（不转染质粒）,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞XIAP基因和蛋白的表达,并加入含不同质量浓度的紫杉醇（0、1 000、1 500、2 000、2 500 ng/mL）,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 不同质量浓度紫杉醇处理后,A2780细胞IR随紫杉醇质量浓度的增加而增高（P<0.05）,A2780/T细胞IR无明显变化。紫杉醇100 ng/mL处理A2780和A2780/T细胞后,A2780细胞XIAP mRNA的表达低于紫杉醇未处理组（P<0.05）,A2780/T细胞中XIAP mRNA的表达与紫杉醇未处理组差异无统计学意义(P>0.05),但A2780/T细胞XIAP mRNA和蛋白表达均高于A2780紫杉醇处理组（P均<0.05）;siRNA-XIAP组XIAP mRNA和蛋白的表达均低于其他各组（P<0.05）,在紫杉醇2 000 ng/mL及2 500 ng/mL作用下,siRNA-XIAP组凋亡率高于其他各组（P<0.05）。结论 卵巢癌对紫杉醇耐药与XIAP基因的高表达有关,特异性的siRNA可通过降低XIAP的表达,促进细胞凋亡,增加耐药癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

真核表达质粒pcDNA3．1／EGR-1的构建和体外效应研究

目的 构建早期生长反应基因(early growth response gene-1,EGR-1)真核表达载体,体外观察其对卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol的影响.方法 将EGR-1基因重组于pcDNA 3.1质粒中,稳定转染A2780/Taxol细胞,流式细胞仪检测转染对A2780/Taxol细胞凋亡的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察A2780/Taxol细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR检测转染前后EGR-1及MDR1 mRNA的表达水平.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建质粒peDNA 3.1/EGR-1;RT-PCR显示,外源性EGR-1基因已整合于A2780/Taxol细胞并获稳定表达;转染使细胞凋亡明显增加(P<0.01);恢复A2780/Taxol细胞对紫杉醇药物敏感性;MDR1 mRNA表达显著下调.结论 转染EGR-1可降低A2780/Taxol凋亡的阈值和下调MDRl的表达,从而减少A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐受性.     

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的 采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系.方法 合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2.脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达.结果 测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P＜0.01,差异有统计学意义. 结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础.     

NDY1shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达

目的：构建NDY1 shRNA真核表达载体,并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据Gen‐Bank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列,设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA（shRNA）序列,插入表达载体获得重组质粒pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后,脂质体介导转染A2780细胞,经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞,采用实时定量聚合酶链反应法（RT‐qPCR）和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确,转染shNDY1后,A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降（72．89±4．83）％及（55．85±4．84）％,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论成功构建 pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1真核表达质粒,并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞,为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。     

靶向EGFR基因RNA干扰对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNA干扰技术下调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的表达,观察其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建针对EGFR基因的siRNA真核表达载体,转染入卵巢癌SKOV_3细胞中,并筛选稳定表达siRNA的转化克隆,RT-PCR及Western blot分别检测EGFR mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,克隆形成实验及MTY法检测细胞克隆形成率及细胞体外的增殖情况.结果 成功构建表达质粒pGenSil-HK、pGcnSil-EGFRI和pGenSil-EGFR2,并转染SKOV,细胞,通过G418筛选后获得稳定转染克隆,RT-PCR及Western blot分析表明转染pGenSil-EGFRI、pGenSil-EGFR2后的细胞EGFR mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制,FGFR mRNA抑制率分别为41.87%和68.07%,蛋白表达抑制率分别为45.21%和70.25%.与未转染组和pGenSil-HK组相比,pGenSil-EGFR2组细胞凋亡比例显著增加,G_1期细胞增多,而S期细胞减少(P<0.05);转染pGenSil-HK组克隆形成率为(0.82±0.03),转染pGenSil-EGFR2组克隆形成率为(0.61±0.04),二者比较差异显著(P<0.05),MTT显示细胞培养36 h后,pGenSil.EGFR2组的细胞生长均显著低于未转染组和转染pGenSil-HK组(P<0.05).结论 靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑卵巢癌SKOV_3细胞中的EGFR表达,诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布、抑制细胞增殖.     

人突变CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

①目的构建人突变CD59的真核表达系统，并筛选高表达细胞。②方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染人中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；G418筛选出阳性克隆，流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Western-blot筛选高表达CD59细胞。③结果成功构建人突变CD59的真核细胞表达系统；运用各种免疫学技术检测获得CD59高表达细胞。④结论人突变CD59在CHO细胞中高表达，为进一步研究CD59分子的功能奠定基础。     

人CD59基因突变细胞模型的建立

目的建立表达人突变CD59的细胞模型,初步研究其活性。方法以正常的CD59基因全长cDNA序列为模板,应用重叠延伸PCR法产生突变使CD59糖基化基序K41-H44突变为K41-K42,产生突变CD59基因,将其克隆于pALTER质粒中,构建出重组真核表达载体。应用脂质体介导法,与pcDNA3质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,以G418筛选阳性克隆。应用免疫化学染色及Western blot方法进一步检测突变CD59分子在转染细胞膜表面的表达。通过荧光染料释放试验,对突变CD59蛋白糖基化前后的补体限制活性进行检测。结果筛选出的阳性克隆细胞膜表面有突变CD59分子表达。将细胞的裂解物进行Western blot检测证实,在相对分子质量20000处可见1条与CD59相当的蛋白带。表达有突变CD59分子的阳性克隆细胞染料释放率低于对照组,糖基化后染料释放率明显升高。结论成功地获得了表达人突变CD59分子的细胞株。     

重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染

目的获取人突变CD59基因（HM3）并构建HM3真核表达体系,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,以获得稳定转染的细胞克隆.方法应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA,进一步构建重组质粒pALTER-HM3;与pcDNA3共转染CHO细胞,转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆,传代扩增培养并及时冻存备用.结果酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒;转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆,获得生长较好的细胞.结论重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA,合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化.     

异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。     

人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定

目的获得纯化人突变CD59（hmCD59）蛋白,制备其特异性抗体,对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDS-PAGE检测hmCD59的表达情况,表达产物经ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清,以此抗血清鉴定纯化产物。结果hmCD59在CHO细胞获得表达,ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白,hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白,为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。     

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

CD59在胃癌中的表达及其生物学意义

目的探讨CD59基因在胃癌中的表达及其生物学意义。方法以胃癌细胞系,胃癌组织和癌旁正常配对组织为材料,采用RT-PCR法和Real-Time PCR法测定CD59基因的mR-NA表达水平。结果CD59 mRNA在7株不同来源、不同分化程度的胃癌细胞系中表达水平不相同;在19对配对组织中有16对(16/19,84%)肿瘤组织表达水平低于与其配对的癌旁正常组织。结论CD59 mRNA的表达在胃癌细胞系中表现出组织特异性,其表达水平与胃癌细胞分化程度有一定关系;并且CD59 mRNA在胃癌组织中普遍低表达可能是肿瘤发生的早期事件之一,对胃癌的发生发展可能具有重要生物学意义。     

人突变CD59基因表达蛋白功能的研究

①目的构建8种突变CD59基因真核表达系统，观测突变的人CD59基因在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达及抗补体活性。②方法以荧光活化细胞分类法、免疫荧光法及免疫印迹法检测突变CD59基因转染CHO细胞表达的情况，染料释放实验检测正常突变的CD59分子糖基化前后的抗补体活性。③结果转人突变CD59基因组荧光阳性细胞百分率明显高于对照组，染料释放率低于对照组。④结论CD59突变基因可在CHO细胞表面得到有效表达，该CD59分子具有抗补体活性，但在高糖环境下易被糖基化失活而失去抗补体活性。