胎盘间充质干细胞牙向分化的体外研究

目的探讨胎盘间充质干细胞牙向分化的可能性。方法双酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化法获得SD大鼠胎盘间充质干细胞,免疫细胞化学鉴定其表型、成脂成骨诱导鉴定其多向分化能力。SD大鼠胎鼠牙胚细胞条件培养基诱导胎盘间充质干细胞14 d,免疫细胞化学检测DSP和DMP-1,RT-PCR及凝胶电泳检测DSPP和DMP-1基因。结果胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD31、C34和CD45。成骨和成脂诱导后形成钙结节以及脂滴。牙向诱导后的胎盘间充质干细胞形态无明显改变,表达成牙本质细胞特异性相关蛋白-DMP-1、DSP和特异性基因-DMP-1和DSPP。结论胎盘间充质干细胞具有牙向分化的潜能。     

皮肤真皮来源多能干细胞筛选与鉴定

目的:克隆培养SD大鼠皮肤真皮多能干细胞,并对其生物学特性进行检测,以期为组织工程再生牙齿探寻一种可靠的成体干细胞.方法:采用贴壁细胞培养法和有限稀释法培养出生1d的SD仔鼠掌趾部皮肤真皮成纤维细胞,分别检测其克隆形成能力、增殖能力和多向分化能力,并对其进行分子标志分析.结果:培养获得的SD大鼠皮肤真皮成纤维细胞,其中7株单克隆来源的细胞具有较强的克隆形成能力、较高的细胞群体倍增能力;同时,这部分细胞高表达细胞表面分子标志物CD44和CD90;成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可见细胞内出现脂滴.结论:利用贴壁细胞培养法和有限稀释法培养皮肤真皮成纤维细胞,可获得具有类似间充质干细胞的生物学特性的真皮多能干细胞.本实验成功培养并获得了单克隆来源的真皮多能干细胞,为后续实验奠定了基础.     

釉基质蛋白（EMPs）对大鼠牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）对大鼠牙髓干细胞（rat Dental Pulp Stem Cells,rDPSCs）体外增殖分化能力的影响。方法：酶消化培养法获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化大鼠牙髓干细胞,形态学观察,计算细胞克隆形成率。乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs进行诱导,利用四唑盐比色法（MTD检测和分析诱导后细胞增殖活性的变化。检测诱导后培养液中的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）。免疫组化染色和RT-PCR方法检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein,DSP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrixprotein 1,DMP—1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein,DSPP）的mRNA表达。结果：大鼠牙髓干细胞呈集落状生长,在体外具有一定的克隆形成能力。EMPs对大鼠牙髓干细胞的增殖有促进作用,并呈现剂量和时间依赖性。200gg／ml EMPs组可显著促进大鼠牙髓干细胞的增殖。EMPs作用组能显著提高大鼠牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性。经细胞因子刺激后细胞表达DSP、DMP-1蛋白和DSPP mRNA。结论：EMPs在大鼠牙髓干细胞增殖和向成牙本质细胞分化方面具有积极的作用。     

脂肪来源干细胞诱导分化为成牙本质样细胞的体外培养研究

目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs)向成牙本质样细胞分化的可能性.方法:SD仔4只,处死后取腹股沟处脂肪组织.采用细胞体外共培养的方法,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,观察脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.结果:大鼠脂肪来源干细胞在诱导培养基中生长良好.培养7 d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1).结论:含有多种细胞因子的TGC-CM能提供较好的微环境,诱导大鼠脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化,能为组织工程牙体再生提供种子细胞来源和微环境选择.     

口腔组织病理学

口腔黏膜上皮细胞及成纤维细胞与PGA的生物相容性研究，槟榔碱诱导体外培养的血管内皮细胞凋亡研究，表皮生长因子对MDPC-23细胞增殖和ALP活性的影响，bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响，体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化，牙本质涎磷蛋白反义核酸对体外培养牙胚发育、矿化的影响．     

条件培养液诱导牙龈间充质干细胞分化的体外实验研究

目的:建立牙龈间充质干细胞(GMSCs)与根端牙胚条件培养液(APTG-CM)的直接共培养体系,检测其体外分化情况。方法:有限稀释法获得单克隆来源的GMSCs,在体外多向诱导分化,检测ALP活性及基因表达(OCN、BSP、ALP、COL-1、CP23)情况。结果 :有限稀释法获得的GMSCs可诱导向成骨、成脂肪方向分化。经APTG-CM诱导后,细胞增殖活性和ALP活性均升高;OCN、BSP、ALP、COL-1、CP23基因表达增高。结论:GMSCs经诱导后具备矿化能力;APTG-CM可诱导GMSCs分化,有利于将GMSCs运用于牙周组织工程的研究。     

骨髓基质细胞矿化诱导条件优化的研究

目的:探讨骨髓基质细胞在不同矿化诱导条件下的生物学特性,优化最佳矿化条件。方法:采用普通矿化液诱导组、BMP诱导组和矿化液BMP联合诱导组,体外诱导兔骨髓基质细胞,以含10%胎牛血清的DMEM作为对照组。倒置相差显微镜观察细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖情况,组化方法检测ALP活性,免疫组织化学方法检测I型胶原合成情况。结果:与对照组相比,实验组骨髓基质细胞增殖力均有所抑制,而ALP活性增强,I型胶原呈强阳性表达。其中矿化液BMP联合诱导组诱导产生的成骨细胞表型最为显著。结论:联合应用矿化液和BMP能在较短的时间内有效诱导BMSC分化为成骨细胞。     

cbfa1反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育与矿化的影响

目的:采用反义核酸技术,用特异的与cbfa1mRNA互补的AS ODN抑制cbfa1在体外培养牙胚的翻译,利用电镜及ALP、OC等指标观察其对牙齿发育及矿化的影响,探讨其在牙齿发育中的作用。方法:设计合成cbfa1反义核酸,应用所建立的牙胚体外培养系统,用电镜观察小鼠牙胚被cbfa1反义核酸阻断表达后发育的情况,并且检测ALP、OC表达量的变化。结果:在缺乏cbfa1的情况下,与对照组相比,形成的基质较薄,且基质中胶原纤维排列稀疏,粗细不等,方向杂乱,ALP、OC表达量均有明显变化。结论:cbfa1可能是通过调控ALP和OC等靶基因的表达参与了牙齿发育矿化过程。     

瘦素对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨瘦素(leptin)对体外培养的牙髓干细胞增殖、分化的影响.方法 体外培养牙髓干细胞,采用MTT法及流式细胞技术检测不同浓度瘦素对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶、Yon Kossa染色及矿化相关蛋白(DSP、OCN)的免疫组化染色来检测瘦素对牙髓干细胞分化的影响.结果 瘦素对牙髓干细胞增殖没有显著作用,但是对牙髓干细胞的ALP活性呈浓度依赖性促进.Von Kossa染色可见矿化结节形成,DSP及OCN表达阳性.结论 瘦素可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化.     

体外诱导培养大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达

目的:观察体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和I型胶原蛋白合成的变化。方法:原代培养法获得大鼠牙乳头细胞,在条件培养基中进行诱导培养,在不同时间进行钙结节染色,ALP染色和定量测定,ELISA法和RT-PCR法测定细胞I型胶原蛋白的量和mRNA表达水平。结果:体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞形成含钙化物的细胞结节,体外培养至12d的诱导组细胞ALP高于对照组(P<0.05),细胞内I型胶原表达量高于对照组(P<0.05),且I型胶原mRNA表达水平上调(P<0.05);培养15d后诱导组细胞分泌的I型胶原高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠牙乳头细胞在体外分化的过程中碱性磷酸酶活性明显增高,矿化能力增强,并不断合成和分泌I型胶原形成胞外基质。     

成釉细胞微环境对胚胎干细胞特性的影响

目的研究胚胎干细胞诱导后成牙分化的可行性。方法使用成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞分化,观察诱导后细胞形态学变化以及体外检测基因表达和免疫表型分析。结果成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞后,拟胚体的外周有鹅卵石样的细胞,类似于上皮样的细胞生成。同时,诱导组细胞中可检测CK14、AMBN及AMGN mRNA的表达,DMP1和DSPP表达阴性,进一步免疫表型分析显示,诱导组胚胎干细胞表达CK14、AMBN及AMGN阳性。结论利用成釉细胞无血清条件培养液分泌的信号分子在体外模拟上皮的微环境,使得胚胎干细胞实现了向牙源性上皮细胞方向的表型转化。     

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞体内外增殖、矿化能力的影响

目的:研究血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)在体内外对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)和牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、矿化的干预效应,以期找到PL应用于这两种细胞的最佳方式。方法:在矿化诱导培养体系中按一定体积比加入PL,分别作用于体内、外复合HA-TCP支架材料三维生长的SCAP和PDLSCs,扫描电镜(SEM)以及组织学观察细胞生长、分化情况。结果:体外三维培养模式下,PL能够促进SCAP和PDLSCs的增殖以及矿化细胞外基质的形成,并利于在支架材料上形成完整的细胞膜片(cell sheet)样结构,以上效应对于PDLSCs作用更为显著。而在体内移植模式下,经50 mL/L、10 mL/L PL培养体系预培养的SCAP能形成包含成牙本质细胞样细胞、牙本质样基质和牙髓组织的牙本质牙髓复合体样结构;而PDLSCs经50 mL/LPL干预后,可分化为成牙骨质细胞样细胞,并生成牙骨质样基质、牙周膜样组织。结论:一定体积浓度比的PL能促进SCAP和PDLSCs在体内外的增殖以及成骨、成牙本质分化。     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

Effect of F68, F127, and P85 Pluronic Block Copolymers on Odontogenic Differentiation of Human Tooth Germ Stem Cells

Introduction

The major challenge in dental pulp engineering is to make a successful combination of stem cells and biomaterials with the aim of providing the differentiation of stem cells into odontogenic cell types. Among biomaterials, some types of pluronics have been reported to increase bone formation of stem cells. The effect of these pluronics on odontogenic differentiation has not been addressed yet. This study aimed to examine the effect of pluronics F68, F127, and P85 on odontogenic differentiation of stem cells derived from third molar tooth germs of young adults.

Methods

Human tooth germ stem cells (hTGSCs) were induced to differentiate into odontogenic cells in the presence of different concentrations of pluronics. Differentiation efficiency was assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction for determining expression messenger RNA levels and by immunocytostaining for determining the protein expression of odontogenic markers (ie, dentin sialoprotein, dentin matrix protein 1, bone morphogenic protein 2, bone morphogenic protein 7) by measuring alkaline phosphatase enzyme activity and lastly by von Kossa staining for determining mineralization.

Results

The results revealed for the first time that F68 has a great potential to boost odontogenic differentiation of hTGSCs. P85 was found to reduce cell viability during differentiation. F127 was nontoxic to hTGSCs but did not have any effect on differentiation.

Conclusions

The positive effect of F68 on odontogenic differentiation might enable more efficient pulp regeneration. Yet, the exact mechanism of how F68 alters the differentiation pattern of hTGSCs remains to be investigated in the future studies.     

大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

Tissue engineering of teeth using adult stem cells

Tooth development, a process which occurs in the developing embryo, involves the reciprocal and sequential signalling between epithelial and mesenchymal tissue of the developing first branchial arch. The oral epithelium produces the first inductive signals for odontogenesis at around E10.0, which trigger off a cascade of events that result in the formation of a tooth. We have engineered a tooth in vitro by harnessing the basic principles of odontogenesis and the inductive capability of the oral epithelium of the developing embryo. We replaced the mesenchymal portion of the developing mandibular primordium with aggregates of stem cells from embryos as well as stem cells taken from adult mice. The cell aggregates were covered with embryonic epithelium from E10.0 mouse embryos to form recombinant explants. In vitro culture of these recombinant explants resulted in the induction of early tooth marker genes in the cell aggregates, indicating that the cells were able to respond to the odontogenic signals produced by the oral epithelium. In vivo culture of explants resulted in the induction of Dspp within the cell aggregates indicating that tooth tissue was present. Three recombinant explants, where the cell aggregates consisted of adult bone marrow cells, produced teeth. To determine whether the oral cavity would be able to sustain the growth of an implanted tooth germ, E14.5 molar rudiments were implanted into the diastema region of the maxilla of adult mice. The resulting teeth appeared to be normal in size and were connected to the underlying bone. These experiments are an indication that it is possible to induce odontogenesis and engineer a tooth using adult cells of non-dental origin. They also indicate that developing tooth germs could be successfully implanted into the gingiva of patients.     

Podoplanin expression in human tooth germ tissues and cystic odontogenic lesions: an immunohistochemical study

J Oral Pathol Med (2010) 39 : 115–120
Background:  Podoplanin expression was described in mouse tooth germ and apical bud cells. The aim of this study was to analyse the podoplanin expression of human tooth germ tissues, adult teeth and odontogenic lesions immunohistochemically.
Study Design:  Nine human tooth germ biopsies and seven healthy permanent teeth extracted for orthodontic reasons were examined. Anti-podoplanin (D2-40) reactivity was investigated immunohistochemically. Five well-defined cystic odontogenic lesions (10 radicular cysts, 10 follicular cysts, three keratocystic odontogenic tumours, five ameloblastomas, and two adenomatoid odontogenic tumours) were analysed simultaneously.
Results:  Podoplanin expression was detected in the majority of epithelial and ecto-mesenchymal cells of human tooth germ tissues, odontoblasts and superficial dental pulp fibroblasts of permanent teeth. Cystic odontogenic lesions revealed positive reactions predominantly at the invasion front edge within basal epithelial layers.
Conclusion:  Podoplanin appears to be involved in the orthologic and pathologic processes of the formation of elongated cell extensions and odontoblastic fibers, in the epithelial–mesenchymal transition and local invasion during tooth germ development as well as in both reactive and neoplastic odontogenic cystic lesions.