鼠疫耶尔森菌外膜蛋白的克隆与表达

目的克隆并表达鼠疫耶尔森菌的多种外膜蛋白或外膜蛋白的定位、表达调控蛋白。方法通过PCR技术对目的基因进行扩增，其PCR产物经纯化、酶切处理后，再分别导入原核表达载体pET32a中，然后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和蛋白质芯片分析。结果获得了23个表达鼠疫耶尔森菌外膜蛋白或外膜蛋白的定位、表达调控蛋白的克隆子。全部重组蛋白质的纯度均在85％以上。结论构建了一系列重组表达质粒，为进一步研究鼠疫耶尔森菌外膜蛋白的结构与功能奠定了基础。     

青藏铁路沿线鼠疫菌表型性状及对抗生素敏感性的研究

目的检测青藏铁路沿线鼠疫菌表型性状、质粒组成、外膜蛋白种类及对抗生素的敏感性。方法采用常规糖醇发酵管法检测生化等表型性状;采用反向血凝试验、用假结核菌为复盖种子层法、用草酸镁培养基和刚果红色素培养基检测FraI、Pstl、Vwa和Pgm4种毒力因子;用Lawton最小培养基测定营养型;采用常规的动物接种试验测定毒力;采用碱裂解、酚一氯仿抽提法提取鼠疫菌质粒;鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白;采用纸片法进行抗生素敏感性试验。结果实验用的青藏铁路沿线鼠疫菌株生化性状表现为甘油＋、鼠李糖一、阿胶糖＋、密二糖一、麦芽糖＋、脱氮＋的特征;具有鼠疫菌荚膜抗原（FraI＋）、毒力抗原（Vwa＋）、鼠疫菌素I（PstI＋）、色素沉着因子（Pgm＋）4种毒力因子;营养型表现为对Trp、Thr、Leu、Arg不依赖,而对Phe、Met、Cys依赖,对Ile和Glu表现出低营养;对小白鼠的LD100在10^2～10^3个菌,LDs。为7．94-31．62个菌,对豚鼠的LD100在10^5～10^7个菌,LD50为68．14-685．49个菌;携带Mr为6×10^6、45×10^6、52×10^6、65×10^6、92×10^6]质粒;在10％的SDS-PAGE上37℃条件下的培养物可表达26条外膜蛋白带,28℃培养物可表达36条外膜蛋白;部分头孢类和喹诺酮类药物对实验菌株的敏感性效果较好,20种抗生素均较链霉素为佳。结论青藏铁路沿线的鼠疫菌属于典型的青藏高原型菌株,都是强毒力鼠疫菌,临床治疗除常规的链霉素外可选用头孢类和喹诺酮类药物,该项研究可为青藏铁路沿线的鼠疫防治提供科学的依据。     

外膜蛋白SDS-PAGE对空肠弯曲菌的分型研究

用SDS-PAGE技术检测分析不同来源的41株空肠弯曲菌外膜蛋白特征。根据外膜蛋白SDS-PAGE凝胶上六条蛋白带多少的组合和外膜蛋白主带分子量的大小可将其各分为七个和九个型;根据外膜蛋白SDS-PAGE定量聚类分析可将其分为七个型(以95％相似性为水准)。结合此三种方法可更细致地鉴别不同来源的菌株,表明外膜蛋白SDS-PAGE技术是鉴别分型细菌的有效方法。     

鼠疫耶尔森菌外膜蛋白抗原性研究

目的建立分析鼠疫耶尔森菌外膜蛋白抗原性的简便方法。方法采用DNAstarProtean和EMBOSS网络分析平台综合预测鼠疫耶尔森菌外膜蛋白YopE、YopH、YopT、YopJ、YopM的免疫原性,并通过蛋白质芯片技术对上述外膜蛋白的免疫原性进行验证。结果计算机综合预测分析显示外膜蛋白YopE抗原性最好,蛋白质芯片技术进一步证实YopE具有良好的免疫原性。结论软件预测结合蛋白质芯片检测的方法可用于筛选病原微生物抗原性蛋白。     

温度对鼠疫耶尔森氏菌CRP蛋白转录表达的影响研究

目的探究CRP蛋白对鼠疫菌刚果红染色表型的影响及温度对CRP蛋白转录表达水平的调控。方法观察鼠疫菌野生株(WT)、CRP缺失株(ΔCRP)及CRP回补株(C-CRP)在刚果红平板上的菌落表面形态。分别提取26℃下与37℃下培养的WT总RNA,采用实时荧光定量PCR法研究不同温度下crp的转录表达水平。构建含有CRP启动子区上游的Lac Z重组质粒并电转化入WT中,通过分别测定26℃下与37℃下培养的Lac Z菌株的β-半乳糖苷酶活性来比较CRP启动子活性,进一步判断不同温度下CRP的转录表达水平。结果表型实验显示CRP缺失后鼠疫菌刚果红染色能力显著降低,基因调控实验表明CRP的转录表达水平不受温度转换的影响。结论温度不是刺激鼠疫菌CRP蛋白活化并发挥基因调控作用的主要因素,碳代谢水平、p H及离子浓度可能为CRP蛋白发挥功能的诱因,研究结果为进一步研究鼠疫菌生物被膜形成中CRP蛋白的转录调控机制奠定基础。     

外膜孔道蛋白ompC、ompF的表达与大肠埃希菌耐药的相关性研究

目的 研究外膜孔道蛋白ompC、ompF引起细胞膜通透性改变与大肠埃希菌(ECO)对抗菌药物形成耐药的相关性.方法 设计复合引物对ompC全基因序列和ompF、ompA、fepA、cirA、chuA等基因序列进行扩增,回收PCR产物、钝化后测序;菌体外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳,回收的目标膜蛋白条带经胰蛋白酶消化,采用质谱仪分析蛋白成分并进行蛋白序列的测定.结果 SDS-PAGE电泳图谱和质谱分析显示,7株大肠埃希菌均有相应的外膜孔道蛋白ompC和ompA表达,无外膜孔道蛋白ompF表达;第6、7菌株的孔道蛋白ompC和ompA表达量明显减少,但有铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达;基因扩增显示7株大肠埃希菌均有ompF产物,耐药性较强的第6、7菌株还有fhuA和cirA扩增产物,但产物fhuA的相对分子质量小于ECO-klz(少54 bp).结论 持续使用抗菌药物将导致细菌外膜孔蛋白ompF低表达或不表达,外膜孔蛋白ompC氨基酸序列的改变影响相应蛋白的表达,使细胞膜通透性降低,从而增加细菌对抗菌药物的耐药性;高度耐药的大肠埃希菌伴随代偿性铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达,维持细菌的新陈代谢,保持其高水平耐药性.     

云南省家、野鼠两型鼠疫菌比较蛋白质组的初步研究

云南省存在家、野鼠两型鼠疫疫源地.已有研究证实,两型鼠疫菌具有不同的生物学特性[1],对人群的危险度也不尽相同.进一步探究二者间的差异,为制定合理的防治策略提供更多依据.蛋白质组分析是一种以双向电泳和飞行质谱鉴定为核心技术的方法,具有高通量、重复性好以及较敏感等优点.在鼠疫菌的蛋白质组分析中,有针对鼠疫菌Ⅲ型分泌系统低钙反应抗原[2,3]、鼠疫菌毒力相关蛋白[4,5]、外膜蛋白和内膜蛋白[6,7],以及针对不同生长条件下蛋白质组差异表达的分析[8].本研究旨在通过对云南家、野鼠两型鼠疫菌的比较蛋白质组分析,寻找二者之间的差异蛋白及探讨其意义.     

我国鼠疫菌的营养类型及其流行病学意义

目的 研究我国鼠疫菌的营养型及流行病学意义。方法 采用定量培养法。将鼠疫菌28℃ 17h培养物稀释成1000个／ml，分别接种于完全琼脂平碟、Lawton最小琼脂平碟和各种最小限定琼脂平碟，观察鼠疫菌对各种氨基酸的需求。结果 通过对我国10种类型鼠疫自然疫源地内258株鼠疫菌营养需求的研究证实，我国鼠疫菌的营养型有3类：基本营养依赖型、低营：养型和高营养型。结论 我国鼠疫菌的基本营养依赖型具有地理分布特征，研究结果可为鼠疫菌的分型提供依据。     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属包括 11个菌种 ,其中只有鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病 ,而其余 8个菌种只对动物致病。致病性耶尔森氏菌的外膜蛋白(yersiniaouter -membranceproteins ,Yops)一直是研究的热点。现将其研究进展综述如下。1　外膜蛋白的种类与基因定位3种对人致病的耶尔森氏菌在对外环境刺激作用反应时分泌一系列毒力因子和毒力辅助因子。现已证实这一系列毒力因子和毒力辅助因子均由大小为 70kb的毒力质粒编码(包括 11种外膜蛋白和V抗原 )。该编码质粒保守且对耶尔森氏菌毒力的发挥至关重要。鼠疫耶尔森氏…     

鼠疫耶尔森菌EV76免疫蛋白质组学初步分析

目的建立鼠疫耶尔森菌的免疫蛋白质组学研究方法 ,初步筛选鼠疫耶尔森菌特异性抗原。方法利用双向电泳技术对37℃培养的鼠疫耶尔森菌EV76株全菌蛋白进行分离,结合免疫印迹技术寻找能与鼠疫耶尔森菌免疫兔血清发生免疫反应的蛋白质,并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对阳性蛋白点进行鉴定。结果与鼠疫耶尔森菌免疫兔血清反应的鼠疫EV76株蛋白点共472个,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定出277个,对应于159种蛋白,其中,35种蛋白为耶尔森菌特有,5种蛋白[F1荚膜抗原(F1 capsule antigen)、鼠毒素(murine toxin)、鼠疫菌素(pesticin)、纤维蛋白溶解酶原激活因子(Pla)、F1抗原伴侣蛋白(F1 chaperone protein)]为鼠疫耶尔森菌特有。结论初步完成鼠疫耶尔森菌EV76株的免疫蛋白质组学分析,筛选出具有抗原活性的鼠疫耶尔森菌特有蛋白,为后续特异性诊断技术的建立和疫苗研究奠定良好的基础。     

Electrophoretic characterisation of the outer membrane proteins of Yersinia pestis isolated in north-east Brazil

The outer membrane proteins of 38 Yersinia pestis isolates from all known plague foci of north-east Brazil were analysed by SDS-PAGE. Approximately 20 bands were consistently found in all strains analysed and 11 were selected for comparative studies. Although qualitative differences among the electrophoretic profiles of outer membrane proteins of wild Y. pestis isolates were not observed, quantitative alterations were clearly noted for most of these proteins. No particular quantitative alteration of the electrophoretic profile of outer membrane proteins could be associated with the period of isolation and geographic origin of the isolates. The 64 kDa outer membrane protein was significantly expressed in higher amounts among Y. pestis strains isolated from a recent plague outbreak. The possible use of electrophoretic profiles of outer membrane proteins of wild Y. pestis isolates as a tool for epidemiological studies and for the analysis of virulence determinants is discussed.     

Relative immunogenicity and protection potential of candidate Yersinia Pestis antigens against lethal mucosal plague challenge in Balb/C mice

Yersinia Pestis outer proteins, plasminogen activator protease and Yop secretion protein F are necessary for the full virulence of Yesinia pestis and have been proposed as potential protective antigens for vaccines against plague. In the current study, we used DNA immunization as a tool to study the relative protective immunity of these proteins with a standardized intranasal challenge system in mice. While the natural full-length gene sequences for most of these Y. pestis proteins did not display a good level of protein expression in vitro when delivered by a DNA vaccine vector, the overall immunogenicity of these wild type gene DNA vaccines was low in eliciting antigen-specific antibody responses and gene sequence modifications improved both of these parameters. However, even modified YopD, YopO and YscF antigens were only able to partially protect immunized mice at various levels against lethal challenge with Y. pestis KIM 1001 strain while no protection was observed with either the YopB or Pla antigens. These results demonstrate that DNA immunization is effective in screening, optimizing and comparing optimal antigen designs and immunogenicity of candidate antigens for the development of a subunit-based plague vaccine.     

鼠疫菌、副溶血性弧菌及肺炎克雷伯菌CRP蛋白的表达及其DNA结合活性分析

目的表达有活性的鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）、副溶血性弧菌以及肺炎克雷伯菌的cAMP受体蛋白（CRP）并进行DNA体外结合活性分析,为深入研究3种CRP蛋白间的交互转录调控作用奠定基础。方法应用大肠埃希菌pET系统体外表达鼠疫菌201株、副溶血性弧菌5421株以及肺炎克雷伯菌tw518株的CRP蛋白;应用生物信息学对3种CRP蛋白进行同源性比较,并对CRP与靶DNA的结合基序（CRP consensus）进行分析预测;通过体外凝胶阻滞实验（EMSA）和DNaseⅠ足迹实验验证His？CRP与DNA的结合活性。结果成功表达出3种菌有活性的His？CRP融合蛋白,3种CRP蛋白对鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因均有结合活性。结论 3种CRP蛋白都能直接结合到鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因的启动子区,说明上述3种CRP蛋白对3种病原菌的重要毒力基因的转录可能具有交互调控作用。     

Antibodies and cytokines independently protect against pneumonic plague

Yersinia pestis causes pneumonic plague, an exceptionally virulent disease for which we lack a safe and effective vaccine. Antibodies specific for the Y. pestis F1 and LcrV proteins can protect mice against pulmonary Y. pestis infection. We demonstrate that neutralizing tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) and gamma-interferon (IFNgamma) abrogates this protection at sub-optimal levels of F1- or LcrV-specific antibody, but not at optimal levels. Moreover, we demonstrate that endogenous TNFalpha and IFNgamma confer measurable protection in the complete absence of protective antibodies. These findings indicate that antibodies and cytokines independently protect against pneumonic plague and suggest that surrogate assays for plague vaccine efficacy should consider both the level of vaccine-induced antibody and the capacity of vaccine recipients to produce TNFalpha and IFNgamma upon exposure to Y. pestis.     

不同pH值的赫氏干燥培养基对鼠疫菌生长影响观察

摘要:目的　观察不同pH值的赫氏干燥培养基对鼠疫菌生长的影响,从中筛选鼠疫菌生长的最适pH值。方法　同一批号的赫氏干燥培养基分别加入到pH值为6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2的蒸馏水溶液中,121℃30 min高压灭菌后倾注平皿。通过进行鼠疫菌强毒141标准株和鼠疫菌弱毒EV 76巴黎株菌落计数实验,观察不同pH值的赫氏干燥培养基对鼠疫菌生长的差异。结果　不同pH值的赫氏干燥培养基对鼠疫菌的生长均有影响且其差异有统计学意义（EV76χ2＝190.804,P＜0.05;141χ2＝151.742,P＜0.05）。EV76株鼠疫菌和141株鼠疫菌在pH值7.0的赫氏干燥培养基中活菌数值最大。结论　赫氏干燥培养基对鼠疫菌生长的最适pH值为7.0。     

应用Taq Man荧光定量聚合酶链反应技术检测鼠疫耶尔森菌

目的发展一种快速、敏感、特异的检测鼠疫耶尔森菌方法。方法应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术，针对pMT1质粒上的caf1基因，pPCP1质粒上的pla基因，染色体上的与色素沉着相关的hms基因和侵袭素inv基因设计TaqMan引物探针，进行荧光定量PCR检验，评价方法的特异性、敏感性；构造并应用上述引物探针的外标对照定量；构造pla的内标对照，采用多重荧光定量PCR（FAM，VIC荧光检测），发现假阴性；采用UDG抗污染、ROX参照荧光染料矫正背景噪音，提高检验能力；检验模拟鼠疫耶尔森菌强毒株和EV菌感染的动物脾脏器样本，评价该法在实际工作的应用。结果设计的引物、探针特异性良好，pla、f1、hms指标的敏感性分别是最低检出10拷贝、1拷贝、1拷贝。结论该方法能快速、灵敏、特异检出鼠疫耶尔森菌，对鼠疫监测、预防生物恐怖等方面具有重要意义。     

利用插入序列IS285对云南玉龙鼠疫耶尔森菌进行初步分析

目的了解新发现的玉龙鼠疫菌的遗传特征，分析其与中国各型鼠疫菌的亲缘天系。方法根据鼠疫菌C092株基因组DNA中的6个IS285位点设计引物，利用聚合酶链反应（PCR）对五龙鼠疫菌及我国其他各型鼠疫菌进行分析，通过SPSS软件对结果进行聚类。结果与CO92相比，我国鼠疫菌的某些IS285位点存在变异。5株玉龙鼠疫菌中有4株结果一致，另1株的一个位点发生变异。通过6个位点的PCR，可以将我国鼠疫菌聚为8类。所研究的5株玉龙鼠疫菌分别属于2种聚类，其中4株与滇西纵谷型、滇闽居民型及大部分灰旱獭菌株、全部喜马拉雅旱獭菌株聚为一类。结论对玉龙鼠疫菌的遗传特征获得初步了解，提示玉龙菌株在我国鼠疫菌传播演化过程中可能具有较重要地位．