经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9与Bim表达的影响

目的 观察经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)及卵丘细胞(CCs)中生长分化因子9(GDF9)及Bim表达的影响,探讨其治疗效果及作用机制.方法 制备大鼠超排卵卵巢模型,收集COCs和CCs,分别与雌性SD超排卵大鼠空白血清和经后增殖方药物血清在体外共同培养,各分3组:空白血清组(空白组)、含药血清组(对照组)、含药血清+ GDF9受体阻断剂组(实验组),共6组.24 h后收集COCs和CCs,实时荧光定量PCR检测GDF9和Bim mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测GDF9蛋白表达水平.结果 (1)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05);对照组和实验组COCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组COCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组(P＜0.05),亦高于实验组,但差异无统计学意义(P＞0.05).(2)CCs中GDF9 mRNA表达水平在3组间的差异性比较结果与COCs中一致;对照组和实验组CCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组CCs中Bim mRNA表达水平明显低于实验组(P＜0.05);对照组CCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05).(3)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于CCs中(P＜0.05),其余组内COSs和CCs比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经后增殖方舍药血清能提高COCs和CCs中GDF9的表达水平,维持COCs和CCs中Bim的低水平表达,抑制细胞凋亡,促进卵泡发育;COCs较剔除卵母细胞的CCs更有利于GDF9 mRNA的表达.     

类多囊卵巢综合征大鼠模型的比较研究

目的复制用雄激素及人绒毛膜促性腺激素（HCG）诱导的两种类多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型，比较两种模型的差异。方法模型1组给9日龄SD雌性大鼠注射丙酸睾丸酮，模型2组给予24日龄SD雌性大鼠皮下埋植左炔诺孕酮，3d后所有模型2组大鼠皮下注射HCG9d。复制出两种类PCOS大鼠模型，分别观察两组模型的排卵情况、卵巢形态学改变、血浆雄激素（T）、雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）水平。结果模型1组与模型2组大鼠卵巢均成多囊性改变，卵泡囊性扩张，颗粒细胞层数减少、膜间质细胞增生；但模型1组大鼠卵巢体积较其正常对照组缩小，模型2组大鼠卵巢体积较其正常对照组增加。模型1、2组大鼠血清总T、FINS、FPG水平均明显升高；模型1组大鼠血清E2水平较其正常对照组升高，血清FSH、LH水平较其正常对照组降低；模型2组大鼠血清FSH、E2水平较其正常对照组下降，血清LH水平较其正常对照组升高。结论丙酸睾丸酮和HCG诱导的两种类型PCOS大鼠动物模型多囊卵巢、高雄激素血症、高胰岛素血症等现象均与人PCOS类似，两组虽然在某些方面与人PCOS存在一定差异，但却各自有其与人PCOS相似的特征，两者均可作为类PCOS动物模型用于不排卵的研究目的。     

丹酚酸B促进卵巢早衰小鼠卵泡发育的研究

目的：探究丹酚酸B对卵巢早衰模型小鼠卵泡发育的影响。方法：选取27只6周龄雌性昆明小鼠，按照随机数字表法分为对照组、模型组和实验组，每组9只，对每只小鼠均给药，定期测量体重，给药结束后收集小鼠血清和卵巢组织。ELISA检测血清E2、AMH和FSH水平；HE染色观察卵巢窦状卵泡；免疫组化检测颗粒细胞PCNA的表达；TUNEL检测卵巢颗粒细胞凋亡情况；实时荧光定量PCR和Western blot测定卵巢组织中Bcl-2和Bax mRNA表达和其蛋白表达情况。结果：模型组小鼠体重明显低于对照组和实验组(P<0.05);与模型组比较，实验组血清E2和AMH水平升高且FSH水平降低，窦状卵泡数量增多，颗粒细胞中PCNA与Bcl-2表达增加，同时Bax表达减少，凋亡细胞数量减少(P<0.05)。结论：丹酚酸B能抑制卵巢早衰小鼠颗粒细胞凋亡，促进卵泡发育。     

瘦素及其受体在多囊卵巢综合征卵巢的表达及意义

目的探讨瘦素（Leptin）及其受体（Ob gene receptor，Ob-R）系统与多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）发病机制间的关系。方法用免疫组织化学和原位杂交技术检测Leptin、具有信号传导功能的leptin长受体（Ob-Rb）在PCOS患者（15例）和月经周期规律的对照组（20例）卵巢的表达。结果①Leptin及Ob-Rb的蛋白及mRNA在PCOS患者和对照组的卵巢均有表达。②Leptin主要分布在各级卵母细胞、窦状卵泡至排卵前卵泡的颗粒细胞（granulosa cell，GC）、不同生长阶段及闭锁卵泡的卵泡膜细胞（theca cell，TC），在PCOS患者卵母细胞的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）。③Ob-Rb主要分布在各级卵母细胞、各级生长卵泡及闭锁卵泡的TC、次级及近成熟卵泡的GC、成熟黄体的颗粒黄体细胞。在PCOS患者的卵母细胞、窦状卵泡的TC及闭锁卵泡TC的表达显著高于对照组（P〈0．01／P〈0．05）。④Leptin及Ob-Rb在不同发育阶段卵巢的表达规律1卵母细胞强阳性表达，在初级卵泡的GC及TC表达较弱，随着卵泡发育表达逐渐增强，在排卵前卵泡或闭锁卵泡TC强阳性表达，Ob—Rb在发育期黄体的颗粒黄体细胞亦呈强阳性表达。⑤Leptin及Ob—Rb在PCOS患者小卵泡TC的表达高于GC，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论①卵巢具有分泌Leptin的功能。②Leptin及受体系统在卵母细胞、卵泡和黄体发育、受精及受精卵着床过程中可能起重要作用。③Leptin及其受体系统在PCOS的卵巢异常表达。     

分化抑制因子Id3对雌性小鼠生育能力的影响

目的：通过构建Id3?Gdf9条件性敲除（CKO）小鼠并研究雌性小鼠的表型,从而确定分化抑制因子3（inhibitor of differentiotion 3,Id3）对雌性小鼠生育能力的影响。方法：通过交配繁殖获得Id3?Gdf9 CKO小鼠,以HE染色、卵泡计数对CKO小鼠卵巢中的卵泡发育情况进行检测,以卵母细胞体外成熟实验和体外超排实验对卵母细胞的体外成熟进行检测,通过交配实验对生育力进行检测。结果：qPCR、Western blot结果显示卵母细胞中Id3被成功敲除;对3、8周小鼠卵巢进行HE染色并对各级卵泡进行计数,结果表明CKO小鼠中各级卵泡发育正常;卵母细胞体外成熟以及体外超排实验显示CKO小鼠中卵母细胞体外成熟正常;交配实验表明CKO小鼠生育能力正常。结论：在正常饲养条件下,条件性敲除Id3不影响正常卵泡的发育以及雌性小鼠的生育能力。     

性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠体外培养卵泡的雌激素受体α、β亚型表达的研究

目的:探讨小鼠体内成熟与卵泡体外培养两种情况下卵泡的雌激素受体α亚型和β亚型的分布及表达.方法:采用兔抗小鼠ERα、ERβ多克隆抗体分别对性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠窦前卵泡体外培养后免疫组化染色,检测雌激素受体两种亚型的分布,并对各级卵泡的染色强度进行定量分析.结果:性成熟小鼠卵巢的免疫组化染色显示膜细胞和间质细胞ERα的染色阳性,ERβ染色为阴性;原始卵泡的颗粒细胞ERβ、ERα染色均为阴性,从初级卵泡开始至成熟卵泡的颗粒细胞ERβ的染色呈阳性,ERα染色为阴性.其中ERβ的表达水平在小窦状卵泡的颗粒细胞最高,大窦状卵泡的颗粒细胞染色次之,成熟卵泡的颗粒细胞染色下降.性成熟小鼠卵巢各级卵泡的颗粒细胞ERβ的免疫染色强度显示:除初级卵泡与小窦前卵泡之间颗粒细胞上的ERβ染色无差异外,其余各组卵泡之间颗粒细胞上ERβ的染色强度都具有显著差异(P＜0.01).各级卵泡的卵母细胞两种ER亚型的染色都呈阳性.性未成熟小鼠各级卵泡的颗粒细胞、卵母细胞染色结果和染色强度定量分析结果分别同性成熟小鼠免疫组化染色和染色强度定量分析结果.结论:雌激素受体β亚型在卵泡发育中起主要作用.体内成熟和体外培养两种情况下卵泡两种雌激素受体的表达相似.     

雄激素对颗粒细胞乳酸生成的抑制作用

目的：观察雄激素对卵巢颗粒细胞乳酸生成的抑制作用,探讨多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）高雄激素状态下的颗粒细胞乳酸生成及其对卵泡发育的影响。方法：体外培养人卵巢癌颗粒细胞系KGN细胞,用不同浓度睾酮（0.1~1 000 nmol/L）处理不同时间（0~48 h）。测定培养上清液中乳酸含量,采用实时聚合酶链反应（real?time PCR）以及蛋白质印迹法（Western blot）分别检测细胞内乳酸脱氢酶A（LDHA）和乳酸脱氢酶B（LDHB）的mRNA及蛋白质表达水平。结果：人卵巢颗粒细胞系KGN细胞经1 000、100、1 nmol/L睾酮处理24 h或者1、10 nmol/L睾酮处理24及36 h后,其乳酸生成量显著减少（P < 0.05）。并且,在100、1 nmol/L睾酮处理24 h后,KGN细胞内LDHA、LDHB的mRNA及蛋白质表达水平显著降低（P < 0.05）。结论：较高浓度雄激素通过抑制卵巢颗粒细胞内LDHA、LDHB的表达从而降低乳酸生成,可能与PCOS卵泡发育障碍相关。     

多囊卵巢综合征患者与正常排卵妇女GV期卵母细胞转录组的比较

目的：探讨控制性卵巢刺激（COS）对多囊卵巢综合征（PCOS）患者和正常排卵妇女GV期卵母细胞中差异表达基因和主要信号转导通路的影响,从而筛选出影响PCOS患者卵母细胞发育的关键基因。方法：选择接受GnRH-a长方案将调的控制性超排卵的PCOS患者3例（PCOS组）和同期因男性不孕因素接受长方案将调的正常排卵妇女3人（对照组）,通过酶消化法分离颗粒细胞,收集经过卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）之后废弃的未成熟卵母细胞。构建cDNA文库,在Illumina MiSeq测序平台进行测序,并通过RT-PCR技术对测序数据进行体外验证（每组3个重复）。结果：获得了510 024 82个序列读取片段（reads）,包含8 G碱基序列信息。通过生物信息学软件共找到63个差异表达基因,极显著上调的基因19个,极显著下调基因有44个（Fold Change>4,FDR<0.01）。PCOS组患者血管内皮生长因子（VEGF）和脂肪酸脱氢酶1（FADS1） mRNA表达水平明显高于对照组（P<0.05）,Runt相关转录因子2（RUNX2）、趋化因子1（CXCL1）和热体克蛋白27（Hsp27） mRNA表达水平明显低于对照组（P<0.05）,与功能验证结果一致。差异基因基于GO功能注释可分为磷酰化、细胞自噬和转录调控等多个分支,利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、转化生长因子β（TGF-β）、Hippo、p53和过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）信号通路中。结论：PCOS患者GV期卵母细胞中差异表达的基因可能影响卵泡发育和卵母细胞成熟,从而导致胚胎质量低下。     

人羊膜上皮细胞向卵泡样结构转分化的实验研究

目的研究人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells ,hAECs）在人卵泡液的长时间刺激下能否转分化为卵泡样结构。方法在前期实验结果基础上,体外分离培养hAECs,5%人卵泡液为诱导条件,延长诱导时间至44 d,倒置显微镜观察细胞形态学改变,化学发光免疫技术检测培养基上清液中雌激素（estradiol,E ₂ ）水平的变化,实时荧光定量-聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测雌性生殖细胞特异性基因（GDF9、DAZL、SCP3）表达情况。 结果诱导组（添加有5%卵泡液的培养基）在培养第10天出现卵母细胞样细胞（OLCs）,随着时间延长,OLCs体积增大,周围见透明带样环变,随后减小,部分消失;对照组无上述现象。诱导组DAZL及GDF9的mRNA表达水平较对照组升高（P<0.05）,并且具有两个高峰;诱导组SCP3mRNA表达水平与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。诱导组有E ₂ 生成,其水平随时间先下降后升高再下降;对照组无E ₂ 生成。结论在体外,hAECs具有向卵泡样结构转分化的潜能。     

Plexin A1蛋白及mRNA在小鼠卵泡发育过程中的表达

目的:探讨Plexin A1在小鼠卵巢不同发育阶段的表达。方法:选择不同发育时期的C57BL/6j小鼠,采用免疫组织化学方法测定小鼠卵巢中Plexin A1蛋白水平的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测Plexin A1mRNA水平的表达。结果:Plexin A1蛋白在小鼠卵巢各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达。随着卵泡的不断发育,其在卵母细胞和颗粒细胞中的表达水平均逐渐增强。始基卵泡卵母细胞中的Plexin A1蛋白表达水平明显低于初级、次级和窦状卵泡的卵母细胞。始基卵泡颗粒细胞中未见明显Plexin A1蛋白表达,至初级卵泡阶段可见颗粒细胞开始有Plexin A1蛋白表达,其水平低于次级及窦状卵泡。闭锁卵泡中的Plexin A1呈强阳性表达,明显高于生长卵泡中的表达水平。Plexin A1mRNA在卵巢组织中的表达水平随周(日)龄呈先升高后降低的趋势,5d,7d,3周小鼠卵巢中Plexin A1 mRNA表达水平分别为3d小鼠的1.56、1.26、0.79倍(P<0.05),而2周小鼠卵巢中的Plexin A1mRNA表达水平与3d小鼠相当(P>0.05)。结论:Plexin A1在不同级别的小鼠卵泡中均有表达,且表达水平随卵泡的不断生长发育而增强,但闭锁卵泡中表达最强,提示Plexin A1在卵泡的生长发育及闭锁过程中可能发挥重要的调控作用。     

小鼠体外发育卵母细胞生长分化因子-9基因表达

目的体外培养小鼠窦前卵泡得到MⅡ期卵母细胞,比较发育过程中体外与体内卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量,初步探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。方法出生D10雌性昆明小鼠50只,机械方法分离窦前卵泡,体外培养12d。分别于体外培养D2、D4、D6、D8、D10、D12分离卵母细胞作为体外发育组;同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组;使用半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组单个卵母细胞GDF-9基因表达量。应用计算机全自动图像分析仪测量PCR产物电泳条带的几何平均光密度,基因表达量用相对光密度表示:检测基因光密度/管家基因(β-actin)光密度。结果培养第12天观察306个卵泡,274个卵泡成活(89.5%),143个窦腔形成(51.8%);第13天观察,155个卵母细胞成熟(56.6%)。体外发育D2、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞GDF-9基因表达相对光密度分别是0.83±0.08、0.52±0.09、0.45±0.13、0.49±0.09、0.49±0.09、0.68±0.08;体内发育D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞GDF-9基因表达相对光密度分别是0.64±0.35、0.48±0.10、0.52±0.10、0.66±0.08、0.72±0.09、0.91±0.11;体外发育D8￣12卵母细胞GDF-9表达量明显低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05)。结论小鼠窦前卵泡体外培养后可以生长发育,部分得到成熟的卵母细胞。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变发生变化;体外发育D8￣12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞可能是其发育潜能较低的原因之一。     

Expression of GDF-5 during Limb Skeletal Development of Mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective： To investigate the expression of growth differentiation factor 5（GDF-5） during limb skeletal development of mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Methods ： The expression of GDF- 5 mRNA and protein in mouse fetal limb buds were detected in embryonic day 11.5-15.5 （E11.5-15.5） by RT-PCR and Western blotting respectively. Type Ⅱ collagen protein was examined with immunocytochemistry and the sulfate glycosaminoglycan was measured by Alcian blue. Results： During early stage of developmental skeletogenesis, the expression of GDF-5mRNA was constant and began with embryos E11.5, highlighted at embryos E12.5 and E13.5, subsequently dropped at embryos E14.5 and E15.5. There was very significant difference （P 〈 0.01） in average light density ratio of GDF-5/β-actin between E12.5-13.5 and the other three days. The expression of GDF-5 protein had a similar change with mRNA during limb skeletogenesis. Immunocytochemistry showed that GDF-5 could promote expression of Type Ⅱ collagen protein and histological staining of proteoglycan with Alcian blue revealed the deposition of typical cartilage extracellular matrix components. Conclusion： GDF-5 can enhance chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro, which plays an important role in limb skeletal development and joint formation.     

Effect of growth and differentiation factor 6 on the tenogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Recent studies showed that bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) had risk of ectopic bone formation.In this study,we aimed to investigate the effect of growth and differentiation factor 6 (GDF-6) on the tenogenic differentiation of BMSCs in vitro,and then combined with small intestine submucous (SIS) to promote tendon regeneration in vivo.Methods The BMSCs were isolated from the green fluorescent protein (GFP) rats,and were characterized by multi-differentiation assays following our previous study protocol.BMSCs cultured with different concentrations of GDF-6,without growth factors served as control.After 2 weeks,mRNA expression and protein expression of tendon specific markers were examined by qRT-PCR and Western blotting to define an optimal concentration of GDF-6.Mann-Whitney U-test was used to compare the difference in relative mRNA expression among all groups; P ≤0.05 was regarded as statistically significant.The GDF-6 treated BMSCs combined with SIS were implanted in nude mice and SD rat acute patellar tendon injury model,the BMSCs combined with SIS served as control.After 12 and 4 weeks in nude mice and tendon injury model,the samples were collected for histology.Results After the BMSCs were treated with different concentration of GDF-6 for 2 weeks,the fold changes of the specific markers (Tenomodulin and Scleraxis) mRNA expression were significantly higher in GDF-6 (20 ng/ml) group (P ≤0.05),which was also confirmed by Western blotting result.The BMSCs became parallel in orientation after GDF-6 (20 ng/ml) treatment,but the BMSCs in control group were randomly oriented.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs were combined with SIS,and were implanted in nude mice for 12 weeks,the histology showed neo-tendon formation.In the SD rat patellar tendon window injury model,the histology also indicated the GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS could promote tendon regeneration.Conclusions GDF-6 has tenogenic effect on the tenogenic differentiation of BMSCs,and GDF-6 (20 ng/ml) has better tenogenic effect compared to other concentrations.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS can form neo-tendons and promote tendon regeneration.     

Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的表达

目的 建立Pax-8基因敲除模型及Pax -8基因的体外干扰实验,探索心肌细胞中Pax-8基因抑制后解偶联蛋白2(uncouplingprotein 2,UCP2)基因表达的变化.方法 Pax-8基因敲除纯合子小鼠(Pax-8 KO-/-)为实验组,Pax-8基因敲除小鼠杂合子(Pax -8 KO+/-)和野生型(Pax-8KO+/+)为对照组;同时在体外实验的大鼠心肌细胞株中,加入Pax -8基因的小干扰RNA(Pax-8siRNA)为实验组,非特异性siRNA(NC siRNA)组和空白组为对照组.采用RT-PCR和Westernblotting技术测定UCP2的mRNA和蛋白质表达.结果 在Pax-8基因敲除动物模型中,与Pax-8基因敲除小鼠杂合子组和野生型组相比,实验组Pax-8基因敲除小鼠纯合子心脏组织UCP2的mRNA和蛋白表达均上调( P<0.05),而对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);在体外干扰实验中的结果显示,与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组UCP2的mRNA表达和蛋白表达均上调(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 Pax-8基因被抑制后,心肌细胞凋亡增加,UCP2基因表达上调,提示UCP2参与了心肌细胞凋亡的调控.     

重度子痫前期胎盘组织中sVCAM-1、GDF-15的表达及其临床意义

目的 探讨重度子痫前期（SPE）胎盘组织中可溶性血管内皮黏附分子-1（sVCAM-1）、生长分化因子-15（GDF-15）的表达及临床意义。方法 选取2018年5月—2021年5月江苏大学附属医院行剖宫产术终止妊娠的204例妊娠高血压患者，其中单纯妊娠高血压患者87例（妊娠高血压组），子痫前期（PE）患者52例（PE组），SPE患者65例（SPE组），另选取同期该院产检住院行剖宫产分娩的健康妊娠孕妇52例为对照组。通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测所有研究对象胎盘组织中sVCAM-1、GDF-15的表达。分析不同人群胎盘组织中sVCAM-1 mRNA、GDF-15 mRNA相对表达量，Pearson法分析sVCAM-1 mRNA与GDF-15 mRNA的相关性；多因素Logistic回归模型分析影响SPE发生的因素。结果 对照组胎盘组织中sVCAM-1 mRNA、GDF-15 mRNA相对表达量低于妊娠高血压组、PE组及SPE组（P <0.05），妊娠高血压组sVCAM-1 mRNA、GDF-15 mRNA相对表达量低于PE组和SPE组（P <0.05），PE组sVCAM-1 mRNA、GDF-15 mRNA相对表达量均低于SPE组（P <0.05）。Pearson相关性分析结果显示，SPE组sVCAM-1 mRNA与GDF-15 mRNA呈正相关（P <0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示，sVCAM-1 mRNA［O^R=3.550（95% CI：1.461，8.628）］、GDF-15 mRNA［O^R=4.059（95% CI：1.670，9.865）］是SPE发生的影响因素（P <0.05）。结论 胎盘组织中sVCAM-1、GDF-15的异常表达可能与PE发病有关，sVCAM-1、GDF-15高表达可能使PE患者进展为SPE。     

Map3k1基因下调对B6小鼠眼睑角质形成细胞增殖和迁移能力的影响

目的 为了研究靶向抑制M ap3k1基因对B6小鼠眼睑角质形成细胞增殖和迁移能力的影响.方法 通过已构建的靶向沉默Map3k1基因amiRNA干扰载体,Lipofectamin 2000转染B6小鼠眼睑角质形成细胞(Ctrl Map3k1组转染空载体, Map3k1 amiRNA-3组转染Map3k1 amiRNA-3干扰载体);Real-Time PCR和Western blot实验分别检测Map3k1 mRNA和蛋白的相对表达量,以测定干扰效率;四甲基偶氮唑盐(M T T)法检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的增殖水平;划痕实验检测角质形成细胞的迁移能力.结果 B6小鼠眼睑角质形成细胞转染Map3k1 amiRNA-3干扰载体后,mRNA和蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P<0.05);Map3k1 amiRNA-3组在细胞增殖水平上低于Ctrl Map3k1组(P<0.05);Map3k1 amiRNA-3组在迁移能力上亦显著低于Ctrl Map3k1组(P<0.05).结论 靶向抑制B6小鼠眼睑角质形成细胞中Map3k1基因的表达后显著抑制细胞的增殖和迁移,进而影响细胞的生物学行为.     

Cx43沉默抑制机械应力诱导的小鼠软骨细胞凋亡

目的：探讨缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)沉默对机械应力诱导的软骨细胞凋亡的影响。方法：将小鼠软骨细胞ATDC5分为空白组、机械应力组、Cx43 siRNA转染组、scramble siRNA转染组、机械应力+scramble组、机械应力+siCx43组。用Flexcell FX-5000系统对体外培养的ATDC5细胞加载机械应力;用定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)和Western印迹分别检测细胞Cx43 mRNA和蛋白表达水平;用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活性;用流式细胞术检测细胞凋亡情况;用比色法检测caspase-3活性;用Western印迹检测Bcl-2,Bax,p-JNK和JNK的蛋白表达。结果：经机械应力诱导后,ATDC5细胞Cx43 mRNA和蛋白的表达显著升高(均P<0.05)。转染Cx43 siRNA显著降低细胞Cx43 mRNA和蛋白水平(均P<0.05)。在机械应力刺激下,ATDC5细胞活性显著降低,凋亡增多,caspase-3活性和Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax降低(均P<0.05)。而Cx43沉默显著增加机械应力下ATDC5细胞活性,减少凋亡,降低caspase-3活性和Bax蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax(均P<0.05)。此外,Cx43 siRNA显著抑制机械应力诱导的p-JNK蛋白的表达(P<0.05)。结论：Cx43沉默可能通过调节JNK信号通路,抑制机械应力作用下小鼠软骨细胞凋亡。     

SPP-1、GDF-15和CXCL-1在人小肝癌中表达的初步研究

目的:针对前期应用基因芯片(Affymetrix Rat Genome 230.2.0)筛选出的大鼠早期肝癌中高表达的人同源分泌蛋白基因SPP-1、GDF-15和CXCL-1,定量验证其在人小肝癌中mRNA和血清蛋白的表达水平,并探讨其临床应用价值。方法:应用实时定量PCR和双抗体夹心法ELISA,检测15例小肝癌及正常肝脏组织(癌旁正常肝脏组织)的mRNA水平及对应小肝癌血清和正常人血清中的蛋白表达水平。结果:①SPP-1、GDF-15和CXCL-1基因在小肝癌组织中较对照组表达显著上调,其差异有统计学意义(P<0.05);②SPP-1血清蛋白检测值与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GDF-15血清蛋白含量在小肝癌组中表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);小肝癌组中CXCL-1血清蛋白含量较正常对照组表达下调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:①NF-κB信号通路基因(CXCL-1)、P53信号通路基因(GDF-15)和SPP-1基因在人小肝癌组织中高表达,可能与肝癌发生的早期过程相关;②分泌性蛋白GDF-15和CXCL-1显示出小肝癌筛选诊断的潜在价值。     

补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子表达的影响

目的探讨补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢中影响排卵率的重要因子卵母细胞分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)蛋白及其mRNA表达的影响,分析补肾法、疏肝法诱发排卵可能的分子机制。方法将性未成熟雌性小鼠随机分为对照组、补肾组和疏肝组,均于第3天腹腔注射血促性素(PMSG)5 IU/只、第5天腹腔注射绒促性素(h CG)5 IU/只,补肾组、疏肝组分别灌服补肾调经方(其中第1~3天灌服Ⅱ号方18.70 g/kg,第4~5天灌服Ⅲ号方28.57 g/kg)和逍遥丸(其中第1~3天灌服高剂量2.34 g/kg,第4~5天灌服低剂量1.17 g/kg)促进卵泡发育并诱发排卵,实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组化分析注射h CG后0、8、12h卵巢GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA的表达。结果与对照组比较,补肾调经方、逍遥丸均可使促排卵小鼠在注射h CG后8、12 h GDF-9、BMP-15 mRNA及其蛋白的表达均升高(均P0.05)。结论补肾调经方、逍遥丸通过对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA表达的影响,促进卵泡颗粒细胞增殖、卵丘扩散、卵母细胞成熟,进而发挥促进诱发排卵的作用。