小鼠PD-L1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的构建含有小鼠PD-L1基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达小鼠PD-L1分子的CHO细胞系。方法从小鼠脾细胞总RNA逆转录的cDNA中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（XhoI和EcoRI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选后,建立稳定高表达PD-L1分子的CHO细胞系。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP／PD-L1,建立了稳定表达PD-L1目的基因的CHO细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定表达该分子的CHO细胞系为后续研究奠定了物质基础。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从健康人外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切（XhoI和EcoRI）装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。     

稳定表达犬转铁蛋白受体CHO细胞系的建立和鉴定

目的 构建犬转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,建立稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。方法 从犬腺细胞系（WRD）提取总RNA,逆转录合成 cDNA,采用PCR方法扩增TfR 基因,将其克隆至真核表达载体pCDNA3,酶切和测序鉴定;利用脂质体法转染CHO细胞,通过RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR的表达。结果 构建的pCDNA3-TfR 重组质粒经过酶切和测序鉴定,TfR 基因序列成功插入到pCDNA3载体,且无突变。转染CHO细胞后,RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR表达阳性,成功建立了稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。HTH]结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3-TfR ,并获得了稳定表达TfR的CHO-TfR 细胞系。     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

人CD154基因真核表达载体的构建及在Eca109细胞中的表达

目的：构建人CD154基因真核表达质粒pcDNA3．1-CD154,初步观察转染该质粒后Eca109细胞的细胞生物学特性。方法：人外周血单个核细胞体外经PHA激活后提取总RNA,用RT—PCR技术扩增人CD154cDNA全长并构建真核表达质粒pcDNA3.1—CD154,用Lipofectamine^TM 2000介导pcDNA3．1-cDl54质粒转染食管癌Eca109细胞株,RT—PCR检测转染细胞中CD154 mRNA的表达,观察细胞生长特征。结果：用T7／SP6通用引物测序证实重组质粒中插入片段为正向插入的人CD154基因。pcDNA3．1-CD154转染Eca109细胞后细胞异型性明显改善,生长速率减慢。结论：pcDNA3．1-CD154构建成功;转染该质粒的Eca109细胞生物学特性发生改变。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。