表达幽门螺杆菌粘附素BabA重组蛋白菌株的构建及其粘附活性评价

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)粘附素BabA重组蛋白的候选菌株并测定其粘附活性。方法用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增粘附素babA2基因,将其定向插入表达载体pET-22b( )中,并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达,利用光镜计数法测定其粘附活性。结果DNA序列分析表明,所克隆的粘附素babA2基因序列与GeneBank公布的一致。在37 ℃诱导表达3 h后,粘附素BabA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%,体外实验证实BabA参与了粘附过程。结论本研究获得了表达有生物活性的Hp粘附素BabA的克隆,为深入研究其相关功能奠定了良好基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因保守区的克隆及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)4种粘附素(BabA2、AlpA、AlpB和HopZ)保守区蛋白质的候选菌株,并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增粘附素保守区(命名为CB)基因,将其定向插人pET—22b( )载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达;表达产物经亲和层析纯化和免疫印迹鉴定,ELISA法测定Hp感染者血清中抗CB抗体。结果 构建了4种粘附素保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588bp,编码195个氨基酸。SDS—PAGE和凝胶扫描分析,CB基因表达的蛋白质相对分子质量约为22500,其重组蛋白质表达量占菌体总蛋白质的29％。经免疫印迹证实该重组蛋白质可以被Hp阳性患者血清所识别,ELISA法共检测了55份血清,以快速尿素酶实验(RUT)作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0．76。结论 CB有可能成为一种有效的疫苗,用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆表达及定位

目的: 克隆并表达H.pylori黏附素babA2基因. 方法: 提取H.pylori染色体基因,用PCR方法扩增babA2基因,将其克隆至表达载体pET-22b( ),并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达及定位分析. 结果: 分离得到了2.2 kb的babA2基因片段,在37℃诱导表达3 h后,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%,其中分泌表达占周质总蛋白的22.7%,可溶性表达占上清的15.0%,包涵体占沉淀的86.7%. 结论: H.pylori babA2基因的克隆与表达为H.pylori黏附机制研究及疫苗的研制打下了基础.     

幽门螺杆菌重组粘附素的安全性、免疫原性和生物学活性的体外评价

目的 通过体外实验确定重组粘附素(rBabA)的安全性、免疫原性及粘附作用，探讨rBabA在幽门螺杆菌(Hp)疫苗应用中的可行性。方法 二苯胺法测定rBabA致T细胞凋亡率．ELISA法测定Hp感染者血清中抗rBabA抗体．MTT法测定T细胞对rBabA的增殖反应．光镜计数法研究rBabA对Hp与胃癌细胞粘附的影响。结果 体外安全性实验表明rBabA无明显致BabA抗体阴性者T细胞凋亡的作用．而且可刺激rBabA抗体阳性者T细胞的增殖；ELISA法共检测了38份Hp感染患者血清，rBabA抗体阳性率为18．4％。rBabA能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附。结论 研究表明rBabA是安全的、具有免疫原性的。Hp菌体成分.既可以刺激体液免疫，又能够提高细胞免疫,有望成为针对BabA2基因阳性。Hp菌株疫苗研制中一种有效的新抗原。     

幽门螺杆菌重组粘附素的安全性、免疫原性和生物学活性的体外评价

目的通过体外实验确定重组粘附素(rBabA)的安全性、免疫原性及粘附作用,探讨rBabA在幽门螺杆菌(Hp)疫苗应用中的可行性。方法二苯胺法测定rBabA致T细胞凋亡率,ELISA法测定Hp感染者血清中抗rBabA抗体,MTT法测定T细胞对rBabA的增殖反应,光镜计数法研究rBabA对Hp与胃癌细胞粘附的影响。结果体外安全性实验表明rBabA无明显致BabA抗体阴性者T细胞凋亡的作用,而且可刺激rBabA抗体阳性者T细胞的增殖;ELISA法共检测了38份Hp感染患者血清,rBabA抗体阳性率为18.4%。rBabA能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附。结论研究表明rBabA是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,有望成为针对BabA2基因阳性Hp菌株疫苗研制中一种有效的新抗原。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素（HpaA）。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）总DNA中钓取hpaA结构基因,克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达,表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp,编码261个氨基酸,SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000,可溶性表达占全菌的20%以上,经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性,可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。     

幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体pET-22B( ),转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。结果 分离得到了1.5kb的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h后，表达产物占细菌总蛋白的31．9％。表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64．8％。结论 幽门螺杆菌alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法利用ANTHEPROT V4.3c 软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列。结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的　利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论　成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的：克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）4种黏附素（BabA、AlpA、AlpB和HopZ）的保守区，并对其进行序列及生物信息学分析，为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法：利用ANTHEPROTV4.3c软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列，发现共同保守区（命名为CB），推导出其DNA序列，设计CB特异引物，将PCR产物定向插入pET-22b（ ）载体，构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定，生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果：构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒，测序显示CB基因长588bp，该基因编码195个氨基酸，与4种黏附素保守区的同源性均达50％以上，ANTHEPROTV4.3软件预测其蛋白质相对分子质量约为22500，并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836767个序列，与其同源性达40％的均为Hp序列。结论：Hp4种黏附素存在同源怀接近的保守区，表明其黏附作用可能有相似的分子基础，生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌babA2和胃黏膜上皮Le~b抗原在不同血型中表达情况及与消化性溃疡的关系

目的:研究不同血型(ABO)患者幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)表达血型抗原结合黏附素(blood group antigen binding adhesion,babA2)和胃黏膜上皮表达Lewisb (Leb)情况,及两者与消化性溃疡的关系.方法:测定56例(25例胃炎,31例消化性溃疡)Hp阳性消化性溃疡及消化不良的患者血型,并进行内镜检查,取2块胃黏膜,一块进行Hp培养,采用PCR检测Hp babA2表达情况;另一块组织进行组织病理学检查,并应用免疫组化测定胃黏膜上皮表达Leb情况.分别比较不同血型babA2、Leb表达情况与消化性溃疡的关系.结果:56例患者中,消化性溃疡组O型血所占比例高于胃炎组及正常人群(P均<0.0125),O型血患者胃黏膜Leb评分显著高于非O型血(P<0.005),消化性溃疡组Leb评分高于胃炎组(P<0.05).Hp培养成功30例,有28例babA2阳性(7例消化性溃疡,21例胃炎),babA2阳性患者中,消化性溃疡组O型血比例高于非O型血(P<0.0125),消化性溃疡组与胃炎组O型血所占比例差异无统计学意义.结论:O型血可能是通过高表达Leb及Hp的babA2增加了消化性溃疡的发生.     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的 基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法 采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因，并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。结果 重组UreB在大肠杆菌中表达，相对分子质量约62000，表达率26％。N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP，肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB／c小鼠，能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示，重组UreB具有良好的免疫原性和反应性，表现出与天然Hp UrcB相似的生物学功能。结论 为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

重组体pcDNA3．1（＋）－tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

【目的】克隆酪氨酸酶基因(tyr)，构建pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并导人NIH3T3细胞表达。【方法】用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3．1( )的T7启动子下游，并用脂质体法导入NIH3T3细胞，RT-PCR，酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。【结果】成功克隆1．74kb的全长tyr cDNA片段，经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致，tyr准确克隆人pcDNA3．1( )的多克隆位点，RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。【结论】本实验成功构建了pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并成功导入NTH3T细胞中表达.     

PRL-2真核表达载体的构建及其致侵袭和粘附的研究

目的 构建PRL-2真核表达载体并观察其致侵袭和粘附的能力.方法 用RT-PCR法从肝癌细胞系HepG2总RNA中扩增编码PRL-2基因全长阅读开放框DNA,构建真核表达载体.以脂质体转染法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中,筛选阳性克隆.分别应用RT-PCR、Western blotting免疫印迹和免疫组化法分析PRL-2在阳性细胞中mRNA、蛋白表达及其定位.MTT法观察转染20 min和120 min后与底物粘附的细胞数,评价PRL-2对CL1肝细胞粘附能力的促进作用,观察6 h后细胞穿透多聚碳膜上层粘蛋白的细胞数,分析PRL-2对肝细胞浸润迁移的影响.结果 经RT-PCR扩增出大小为504 bp的基因片断,序列测定正确并经亚克隆酶切鉴定.经过8周G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1,经RT-PCR、Western blotting印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系表达PRL-2 mRNA及蛋白.PRL-2使CL-1细胞在20 min和120 min时对纤连蛋白的粘附率明显升高(P＜0.05),PRL-2使CL-1细胞穿透迁移小室多聚碳膜的细胞数由(10.0±3.7)个显著升高至(44.8±2.6)个(P＜0.05).结论 成功构建重组PRL-2真核表达载体并可在永生化肝细胞中稳定表达,PRL-2具有致肝癌细胞侵袭和转移的能力.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)DNA疫苗。方法 扩增全长napA(编码HP-NAP)，将其与克隆载体pBT连接，经测序及同源性分析后，将相应片段亚克隆入真核表达载体pIRES，经双酶切及PCR鉴定。结果 PCR扩增-435bp产物，核苷酸序列测定及BLAST分析表明，所克隆序列与基因库中Hp悉尼株(SS1)napA核苷酸及蛋白质的同源性均为98％。ANTHEPROT软件预测其蛋白质具有良好的疏水性和抗原性。经PCR及双酶切鉴定，证实成功构建携带，napA的重组真核表达质粒plRES-napA。结论 成功构建并鉴定了HP-NAP重组DNA疫苗，为进一步研究其免疫原性及研制口服DNA疫苗奠定了基础。     

梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影的构建与鉴定

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)粘附素Tp0751的重组大肠埃希菌菌影(E.coli bacterial ghosts,EBG),为深入评价其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。方法将含有噬菌体PhiX174裂解基因E的质粒pHH43转化E.coli DH5α,42 ℃温控诱导使其形成EBG并计算裂解效率,用琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定EBG。构建含有裂解基因盒E-box、膜锚定序列E′-linker及Tp0751目的基因的原核双表达重组质粒pET28a-E′-Tp0751-E-box,28 ℃诱导重组E.coli BL21表达Tp0751并用Western Blot鉴定;42 ℃诱导形成重组EBG(rEBG),计算裂解效率并用DNA电泳和TEM鉴定。结果构建的EBG裂解率为98.13%,DNA电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成缺乏胞浆成分的细胞空壳并保持活菌基本形态。rEBG在28 ℃时高效表达重组Tp0751蛋白,且仅与梅毒患者血清特异性结合; 42 ℃下其rEBG裂解率为96.37%,电泳和TEM鉴定结果与EBG的相似。结论成功构建表达Tp粘附素Tp0751的rEGB,其所表达目的蛋白具有良好免疫反应性。     

肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达及免疫保护性研究

目的 利用基因工程技术获取原核表达的肺炎链球菌表面黏附素A(Psa A)蛋白并初步研究其对小鼠的免疫保护性.方法 根据基因库中psa基因序列设计合成特异性引物,从临床分离到的肺炎链球菌中提取DNA,PCR技术扩增目的 基因psaA,克隆后构建原核表达栽体PET-32a(+)/psaA,将重组质粒转化到大肠杆茵BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,获得重组蛋白,并通过Western-blot鉴定其免疫活性.将重组蛋白免疫小鼠,观察对肺炎链球茵感染动物的保护作用.结果 经酶切及测序鉴定,克隆出870bp的目的 基因,DNA序列与Gen-Bank中的相应数据符合率为100%;成功构建出原核表达载体pET-32a/psaA;经IPTG诱导,表达出了约57 kD左右的融合蛋白,与预期大小相符,并且具有抗体结合活性;重组PsaA蛋白对肺炎链球菌感染小鼠具有一定保护作用.结论 在原核细胞中成功表达出PsaA蛋白,能在一定程度上抵抗肺炎链球菌感染,为基于黏附素的新型疫苗的研究提供线索.     

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆及测序

[徐俊荣,张沥,闫小君,崔大祥,江红,韩锋产.世界华人消化杂志,2001;9(3):308-311] 目的用PCR方法扩增幽门螺杆菌(Hp)尿素酶C基因,以构建Hp UreC基因的重组克隆,为进一步表达Hp UreC基因的重组蛋白质并研究其功能奠定基础.方法以Hp临床菌株总DNA为模板,根据已发表的Hp UreC基因序列设计引物(位于588 bp～605 bp和1 737 bp～1754 bp),采用PCR方法扩增出一个1173 bp的Hp尿素酶C基因片段,用BamHI及EcoRI双酶切后将其克隆入测序质粒pGEM-3Zf(-)中,以全自动测序仪双向测定目的片段序列,借助于DNA TOOL 5.1拼接成完整序列.与已知的Hp UreC基因序列做比较.结果所得核酸序列与报道的Hp国际标准菌株M60398的UreC基因同源性为95%.根据测序结果推断其编码的氨基酸序列,并行BLAST分析,发现它与标准菌株M60398的氨基酸序列同源性为97%.结论成功构建了Hp UreC基因的重组克隆,为进一步研究表达Hp UreC基因的重组蛋白质并研究其功能奠定了基础. (潘伯荣)     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。