肝细胞生长因子对急性淋巴细胞白血病小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病和移植物抗白血病的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠异基因骨髓移植(alloBMT)后移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗白血病(GVL)的影响及其可能的相关机制。方法随机将20只裸鼠(用于观察白血病复发)分为对照组(A组)和实验组(B组),将20只BALB/c小鼠(用于观察GVHD)分为对照组(C组)和实验组(D组),实验组在移植0天至移植后7天注射HGF,对照组注射PBS。流式细胞术检测HGF对alloBMT后ALL小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的影响。记录ALL小鼠BMT后的存活时间。观察移植后ALL小鼠肝脏、小肠的GVHD病理变化。ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。结果A、B、C、D4组小鼠alloBMT后中位生存时间分别为(7.00±1.58),(9.00±1.58),(11.00±3.95),(24.00±13.44)d,D组生存时间明显延长(P值均<0.05)。D组CD4+T淋巴细胞[(10.39±1.15)%]较C组[(13.50±1.81)%]明显降低(P<0.01),CD8+T淋巴细胞[(12.25±2.85)%]较C组[(6.12±1.99)%]明显增加(P<0.01)。D组TNFα水平[(112.10±18.99)pg/ml]明显低于C组[(143.90±25.35)pg/ml](P<0.01)。GVHD明显减轻。结论HGF具有减轻ALL小鼠alloBMT后GVHD程度并且保留GVL的作用。     

痕量小鼠骨髓造血干细胞移植体系的建立

目的:建立痕量小鼠骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植体系。方法:利用ESLAM(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48-)组合流式分选成体GFP/CD45.2小鼠骨髓细胞与保护细胞(CD45.2小鼠),共同移植给致死剂量照射的受体小鼠(CD45.2小鼠),分析移植后不同时间点,受体小鼠外周血嵌合以及其重建效率和谱系分化情况,随后处死受体小鼠,获取骨髓、胸腺、脾脏和外周血等组织的细胞,检测各组织嵌合情况。结果:移植后受体小鼠外周血结果显示第4周之后重建效率为100%,GFP~+细胞在各系细胞(髓系、红系、B细胞、T细胞、巨核)中不同时间点的比例不同,且各系重建水平的变化趋势不同;6个月之后各组织(外周血、骨髓、脾脏、胸腺)嵌合情况显示外周血红系和巨核细胞中有较高比例GFP~+细胞,且在髓系和淋系细胞中无GFP~+细胞,而骨髓的髓系细胞含也有较高比例GFP~+细胞,脾脏中的B细胞也有较高比例的GFP~+细胞,胸腺中的T细胞也含有较高比例GFP~+细胞。结论:ESLAM组合能够较高效率的富集具有长期重建能力的HSCs;这群细胞移植后6个月外周血结果提示可能具有红系和巨核分化倾向。     

免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型造模过程中病理性T细胞的特征分析北大核心CSCD

目的通过DsRed小鼠淋巴细胞输注加全身辐照(TBI)建立免疫介导的再生障碍性贫血(AA)C.B10-H2b/LilMcd (C.B10)小鼠模型, 分析C.B10 AA小鼠模型中病理性T细胞在不同器官的动态归巢过程及特征。方法通过异体淋巴细胞输注加TBI建立AA小鼠模型, 以TBI组为对照, 分析外周血细胞和骨髓单个核细胞数, 验证造模效果。在造模的第3、6、9、12天, 处死小鼠并收集骨髓、脾脏、淋巴结和胸腺单个核细胞, 流式细胞术分析DsRed+ T细胞的动态变化及效应记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、初始T细胞(na?ve T)和效应T细胞(TEFF)的比例。PCR Array分析AA小鼠不同组织内DsRed+病理性T细胞活化相关基因的表达谱。结果与TBI组相比, AA组小鼠在造模第9、12天出现严重骨髓衰竭, 第12天时骨髓有核细胞数、外周血细胞数均显著减少(P值均<0.05)。AA组小鼠骨髓、脾脏、淋巴结内DsRed+ T细胞比例随时间增加而增加。骨髓中的DsRed+ T细胞比例在第3、6天低于脾脏与淋巴结, 但在第12天时高于脾脏与淋巴结(P值均<0.05)。整个骨髓衰竭形成过程中, 胸腺中DsRed+T细胞比例均最低。在第12天时, AA小鼠骨髓、淋巴结和脾脏单个核细胞中, DsRed+CD3+CD4+ T细胞比例分别为(91.38±2.10)%、(39.78±6.98)%、(67.87±12.77)%, 三者之间两两比较均有统计学意义(P值均<0.05);DsRed+CD3+CD8+ T细胞比例分别为(98.21±1.49)%、(94.06±4.20)%、(96.29±1.23)%, 差异均无统计学意义(P值均>0.05)。第9、12天, AA组小鼠骨髓中几乎所有的DsRed+CD4+ T或DsRed+CD8+ T细胞均为TEM, 而淋巴结中包括TEM、TCM以及na?ve T。PCR Array结果显示:骨髓中DsRed+CD4+或DsRed+CD8+ T细胞中CD38、IFN-γ、LAG3、CSF1、SPP1及TNFSF13B表达增高, 但DsRed+CD4+ T细胞中FOXP3、CTLA4表达降低。结论 DsRed小鼠淋巴细胞输注可导致C.B10小鼠发生骨髓衰竭, 并可以在该AA模型小鼠中追踪DsRed+病理性T细胞。在C.B10 AA模型小鼠体内, DsRed+CD8+和DsRed+CD4+ T细胞先归巢到脾脏与淋巴结, 在其中扩增分化, 最终转运至骨髓并转化为TEM。胸腺对异体T细胞的归巢过程更具抵抗性, 提示胸腺在免疫介导AA模型的骨髓衰竭过程中可能是一个免疫豁免部位。在C.B10 AA模型小鼠的骨髓衰竭形成过程中, 归巢到骨髓的DsRed+病理性T细胞较迁移到脾脏与淋巴结的细胞具有更强的免疫活性, 而免疫抑制活性则减弱。     

丹参素对小鼠外周血造血干细胞动员作用的研究

目的:探讨丹参素对小鼠外周血造血干细胞的动员作用及其对小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的影响。方法:30只BALB/c小鼠随机分为三组:丹参素组、G-CSF组、生理盐水组,腹腔注射d1～d7,每日1次,第2～8天,采用外周血WBC和MNC计数、流式细胞术、造血祖细胞体外培养、免疫细胞化学等检测各组给药后对外周血WBC、MNC、CD34+细胞、CD49d阳性细胞、CFU-GM、CFU-MK、CFU-E的产率及小鼠骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率的影响。结果:丹参素组给药第7天外周血WBC、MNC数量达到高峰,分别为给药前的3倍和3.5倍;丹参素组外周血CD34+、CD49d阳性细胞及骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率分别为(1.03±0.24)%、(12.59±2.64)%和(50.86±8.77)%,均明显高于生理盐水组(P<0.05);其CFU-GM、CFU-MK和CFU-E产率分别为(14.90±2.88)%、(12.50±4.06)%和(16.10±6.36)%,均明显高于生理盐水组(P<0.01)。结论:丹参素对小鼠外周血造血干细胞有一定的动员作用,且这一作用可能与其上调小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的表达有关。     

慢性苯染毒小鼠DNA损伤及体内抗氧化酶的变化

背景苯是重要的工业溶剂,长期接触可导致苯可导致 DNA损伤 ,染色体畸变 ,DNA加合物的形成,基因突变等. 目的了解苯对体内 DNA的损伤作用、机制以及抗氧化酶体系的变化情况. 设计随机对照的实验研究. 单位哈尔滨医科大学附属第一医院检验科,哈尔滨医科大学公共卫生学院. 材料实验在哈尔滨医科大学公共卫生学院动物室完成.选用健康雄性昆明种小鼠 24只 ,体质量 18- 22 g,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供. 干预分为正常对照组、低剂量苯损伤组和高剂量苯损伤组.除对照组外,其余各组小鼠进行静式吸入苯蒸气染毒, 4 h/d, 2个月后处死,分离骨髓细胞及外周血淋巴细胞,取肝、脾、脑组织并制备匀浆.主要观察指标用单细胞凝胶电泳技术对骨髓细胞及外周血淋巴细胞 DNA损伤进行检测;同时检测肝、脾、脑组织中超氧化物歧化酶( superoxide dismulase, SOD )、谷胱肝肽过氧化物酶( glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性及丙二醛( malondialdehyde, MDA )含量. 结果染毒组小鼠骨髓细胞及外周血淋巴细胞彗星百分率分别为骨髓细胞( 83.56± 10.28)% ,( 92.54± 15.93)%,外周血淋巴细胞 (41.27± 6.03)% ,( 65.79± 11.62)%,显著高于对照组( 4.13± 0.52)%, (2.21± 0.31)%( P< 0.01),并呈剂量-反应关系.高、低浓度组小鼠肝匀浆 SOD活力分别为( 11 573.31± 1938.72) ,( 12 574.68 ± 1938.72) nkat/g, GSH- Px活力分别为( 309.40± 82.85),( 375.41± 55.18) nkat/g,均显著低于对照组 [分别为 (16 668.67 ± 3 137.96),(588.62± 110.52) nkat/g](P< 0.05),但不同剂量组间差异无显著性意义;高、低浓度组小鼠脾匀浆 GSH-Px活性分别为( 421.75± 124.02)、( 523.10± 45.18) nkat/g,均显著低于对照组( 618.42± 57.01) nkat/g (P< 0.05),且不同剂量组间差异有显著性意义( P< 0.05);高、低浓度组小鼠脑匀浆 GSH-Px活性分别为( 87.35± 19.84) ,( 95.02± 14.00 nkat/g,均显著低于对照组( 118.36± 7.67) nkat/g(P< 0.05), 但不同剂量组间无显著性差异;高浓度组小鼠脑匀浆 MDA含量为( 3.99± 1.15) μ mol/g ,显著高于对照组( 2.58± 0.53) μ mol/g( P< 0.05). 结论慢性苯染毒可致小鼠骨髓细胞及外周血淋巴细胞 DNA损伤,体内抗氧化酶活性降低.     

正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD^＋34细胞粘附分子的研究

目的探讨正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD34+细胞粘附分子的表达及外周血干细胞动员的可能机制.方法采用CD34+MultiSortKit免疫磁珠分离系统,分离纯化出正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD34+细胞,流式细胞术检测其纯度,选择与CD34+细胞相关的粘附分子CD44、CD11a、CD18、CD49d、CD54、CD58及CD62L,进行免疫荧光标记及短期液体培养后再行免疫荧光标记,流式细胞术检测.结果动员后外周血CD34+细胞粘附分子表达CD44为(92.7±2.2)%[骨髓(93.1±2.3)%]、CD11a为(56.3±6.0)%[骨髓(61.8±7.8)%]、CD18为(65.2±6.0)%[骨髓(70.6±7.5)%]、CD49d为(39.4±7.2)%[骨髓(66.9±5.1)%]、CD54为(20.9±4.1)%[骨髓(24.1±3.8)%]、CD58为(77.9±5.8)%[骨髓(81.9±5.6)%]及CD62L为(45.9±5.6)%[骨髓(63.9±4.3)%],其表达均较骨髓为低,尤以CD49d和CD62L为著.脐血CD34+细胞CD11a为(55.5±6.5)%、CD18为(66.7±7.5)%、CD44为(90.3±4.0)%、CD49d为(63.7±6.7)%、CD62L为(50.8±5.9)%,其表达亦较骨髓为低,尤以CD62L为著,但脐血CD54的表达[(29.1±4.9)%]较骨髓及动员后外周血为高,尤较动员后外周血为著.结论不同来源CD34+细胞粘附分子表达存在差异,外周血细胞动员的机制可能与粘附分子的表达下调有关.     

FN-TPO基因修饰的骨髓间充质干细胞支持脐血造血干细胞植入的实验研究

目的观察纤维连接蛋白-血小板生成素(FN-TPO)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)支持脐血造血干细胞植入的能力。方法将20只严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠经亚致死剂量射线辐射后随机分为实验组(n=5):FN-TPO基因修饰的骨髓MSCs联合脐血单个核细胞(CB-MNC)组共移植;对照组:包括单纯CB-MNC移植组(n=5)、CB-MNC联合未修饰骨髓MSCs共移植组(n=5)和仅输入不含血清的IMDM培养基的空白对照组。细胞移植后,持续观察各组小鼠4周,记录一般情况及生存率;通过检测不同时间点(辐射前,辐射后细胞移植前,细胞移植后2 d及1、2、3、4周)的小鼠外周血常规来反映小鼠造血系统恢复情况;4周后以流式细胞术和PCR等检测移植后小鼠体内的人源细胞的整合情况。结果辐射前、辐射后细胞移植前、移植后2 d及移植2周后各组动物外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数均无明显差别;细胞移植1周,实验组小鼠外周血WBC、RBC、Hb和Plt分别为(0.83±0.15)×109/L、(9.84±0.36)×1012/L、147.50±4.80 g/L和(198.75±71.14)×109/L,均较对照组为高,差别均有统计学意义(P<0.05),且实验组小鼠外周血常规变化比较平稳。移植4周各组动物生存率,基因修饰和未修饰MSCs联合CB-MNC共移植组较单纯CB-MNC移植组明显为高(80%VS40%);存活下来的细胞移植小鼠骨髓和外周血中均检测到人源性CD45+细胞,实验组小鼠骨髓和外周血中人CD45+细胞比例(%)分别为:8.15±1.72和2.28±0.57,与单纯CB-MNC移植组的3.93±1.28和0.82±0.06相比差别均具有统计学意义(P<0.05);PCR检测移植后4周存活小鼠体内人beta-actin基因表达情况显示:小鼠外周血、骨髓及心、肝、脾、脑、肺等重要脏器基因组DNA中有人beta-actin基因存在。结论FN-TPO基因修饰的骨髓MSCs能够更有效的支持脐血造血干细胞植入。     

131I-GM-CSF在人白血病SCID小鼠模型体内的生物学分布

目的 观察131I-GM-CSF在人急性髓系白血病SCID小鼠模型体内的生物学分布.方法 用SCID小鼠建立人白血病异种移植模型,用氯胺-T法制备131I-GM-CSF,观察131I-GM-CSF在白血病小鼠体内的生物学分布.结果①静脉接种的HL-60细胞在SCID小鼠体内植活,4周后发生白血病;②131I-GM-CSF主要滞留于模型小鼠的脾脏、骨髓及瘤体组织中,且前两者对131I-GM-CSF摄取于注入后30 min达峰值,组织摄取率分别为(442.9±86.4)%ID/g和(4283.8±252.8)%ID/g,滞留24h后高于其他脏器.而131I呈非特异性分布.结论 131I-GM-CSF集中分布于人白血病SCID小鼠模型脾脏、骨髓及白血病细胞浸润组织,具有组织器官相对特异性.     

致敏受体排斥异基因供体骨髓细胞的实验研究

目的 建立致敏动物模型,研究致敏对异基因骨髓细胞植入的影响及机制.方法 将C57 BL/6小鼠脾细胞经尾静脉注射到BALB/c小鼠体内建立致敏动物模型,应用二抗结合实验及补体依赖细胞毒性反应检测血清抗体.以非致敏或致敏BALB/c小鼠为受鼠,经照射预处理后予以1 ×10 7C57BL/6供鼠骨髓细胞.移植后于不同时间点(2、12和48 h)分离受鼠外周血、脾脏及骨髓等细胞,检测供鼠细胞在致敏受鼠体内各组织的分布.移植后记录各组受鼠的生存情况,监测造血重建与骨髓恢复情况.体外分离非致敏或致敏受鼠的血清及脾细胞,与异基因骨髓细胞相孵育,通过免疫实验计算细胞毒性指数.结果 二抗结合实验和补体依赖细胞毒性反应均证实致敏受鼠血清中含有高滴度的供鼠反应性抗体.骨髓移植归巢实验结果表明,与非致敏组相比,异基因骨髓细胞在致敏受鼠的外周血、脾脏及股骨的分布均明显减少.生存分析结果发现非致敏组小鼠于照射后能长期存活,而致敏组小鼠于照射后12～15 d全部死亡.移植后第14天,非致敏组受鼠外周血白细胞和股骨骨髓细胞计数分别为(3240±300)×106/L和(396±27)×106/股骨,而致敏组受鼠外周血白细胞和股骨骨髓细胞计数分别为(320±80)×106/L和(6±2)×106/股骨,两组差异有统计学意义(P＜0.01).移植后第7天,供鼠细胞在非致敏组和致敏组骨髓所占的百分比分别为(48.07±4.70)％和(0.77±0.11)％,两者差异有统计学意义(P＜0.01).体外通过补体依赖细胞毒性反应实验、细胞毒性淋巴细胞的杀伤作用和抗体依赖细胞介导细胞毒性作用实验表明,致敏组受鼠的细胞毒性指数均明显高于非致敏组.结论成功建立脾细胞输注致敏的小鼠动物模型,致敏受体完全排斥异基因供体骨髓细胞,作用机制与免疫损伤途径有关.     

多发性骨髓瘤原代细胞异种移植小鼠模型的建立

目的 利用人多发性骨髓瘤(MM)原代细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中建立人MM异种移植模型.方法 将2例MM终末期患者骨髓或外周血单个核细胞(MNC)悬液通过尾静脉分别输注给3只NOD/SCID小鼠.每周称量体重,移植2周后以流式细胞术(FCM)检测小鼠外周血中CD45+细胞百分比.当小鼠出现苍白、竖毛、精神萎靡或体重下降20％时,取小鼠脾脏及肝脏行组织病理学检查,FCM检测外周血、骨髓、脾脏和淋巴结细胞悬液中CD45+ CD38+细胞的百分比.结果 来源于病例1和病例2的MNC移植小鼠的平均体重分别自输注MM原代细胞第7周和第5周后开始下降;以对照组小鼠的单个核细胞做阴性设门,分别于移植(26±4)d和(16±4)d后,在病例1细胞来源组和病例2细胞来源组的小鼠外周血中检测到人CD45+ CD38+细胞,且其比例随时间延长而逐渐增高,实验终点时分别达(16.2±3.0)％和(31.3±3.5)％;组织病理大体形态观察发现小鼠脾脏、肝脏及淋巴结均不同程度增大,镜下可见典型的恶性浆细胞浸润;FCM检查骨髓、淋巴结和脾脏细胞表面标志,均发现一群人源CD45+ CD38+细胞.结论 成功建立了人MM原代细胞异种移植的免疫缺陷小鼠模型.     

非清除性异基因骨髓移植后输注供者淋巴细胞治疗白血病的实验研究

目的探讨非清除性异基因骨髓移植(allo-BMT)后供者淋巴细胞输注(DLI)是否能减少移植相关并发症、相关死亡和减轻移植物抗宿主病(GVHD),是否能增强移植物抗白血病(GVL)效应.方法荷L615白血病的615(H-2k)小鼠,于接种白血病细胞后第3天接受60Coγ射线全身照射(TBI,5Gy),照射当天移植供鼠BALB/c(H-2d)小鼠的骨髓细胞(3×107)和脾细胞(1×107),移植后第2天腹腔注射环磷酰胺(200mg/kg),分别于移植后第14天和第21天输注供鼠脾细胞(2×107)或移植后第14天输注经氢化可的松(HC)和环孢菌素A(CsA)处理后的供鼠脾细胞(5×107),观察其抗白血病作用.结果移植后第21天输注供鼠淋巴细胞组和移植后14天输注经HC、CsA处理后的淋巴细胞组小鼠生存期明显延长,分别为(45.1±12.8)d和＞50d,而非清除性allo-BMT组为(26.2±3.6)d,第14天输注供鼠淋巴细胞组为(29.3±3.7)d,差异有显著性(P＜0.01),且无明显GVHD发生.结论非清除性allo-BMT后早期输注经HC和CsA处理的供者淋巴细胞或延迟加用DLI可在减轻移植相关并发症的基础上,增强GVL效应,提高长期无病生存率.     

Ly49A转基因小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植后GVHD和GVL的作用

目的　观察Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植 (allo BMT)后移植物抗宿主病 (GVHD)和移植物抗白血病效应 (GVL)的影响。方法　经由逆转录病毒介导将Ly4 9A基因转染至C5 7BL 6小鼠的脾细胞 ;流式细胞仪检测Ly4 9A受体在转染后脾细胞上的表达率 ;以亲代C5 7BL 6H 2 b 小鼠为供者 ,以接种EL96 11红白血病细胞的 (BALB c×C5 7BL 6 )F1H 2 d b(CB6F1)小鼠为受者 ,预处理条件为全身照射 (TBI,6 0 Co照射 10 .5Gy) ,进行脾细胞混合骨髓细胞移植 ,建立半相合异基因急性GVHD模型并在该模型基础上观察Ly4 9A基因转染的脾细胞对GVHD和GVL的作用。结果　Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠的脾细胞 2 4h后蛋白表达率为 (42 .2 0± 4 .87) % ,空载体转染组为(18.6 7± 2 4 8) % ,未转染对照组为 (18.73± 3.82 ) % ,在半相合异基因移植中 (C5 7BL 6 H 2b →CB6F1H 2d b) ,未进行移植的单纯照射组生存期为 (7.80± 3.36 )d ;环磷酰胺治疗组生存期为 (2 1.70±2 87)d ;脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.4 0± 6 .4 3)d ;空载体转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.10± 7.39)d ;Ly4 9A转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (45 .0 0± 12 .38)d ,较上述各组生存期明显延长 (P     

NK细胞对小鼠异基因骨髓移植造血及免疫重建的影响

目的　研究自然杀伤 (NK)细胞在小鼠异基因骨髓移植 (allo BMT)中对造血及免疫重建的影响。方法　以近交系小鼠C5 7BL/ 6 (H 2 b)为供鼠、BALB/c(H 2 d)为受鼠 ,在allo BMT同时输入供鼠外周T细胞和 (或 )NK细胞 ,计数受鼠移植后不同时间的白细胞数 ;用流式细胞仪检测骨髓CD34 细胞和外周淋巴细胞中CD3 和CD19 细胞及表达供鼠基因的H 2Kb 细胞百分率 ,比较不同移植组存活率、植入水平、造血及免疫重建等。结果　输入供鼠外周NK细胞移植组与不输入NK细胞组比较 ,存活率显著增高 (6 0d存活率为 70 %vs 0 % ) ;白细胞计数、CD19 细胞及骨髓CD34 细胞计数恢复快 ;H 2Kb 细胞表达水平高 (86 .6 8± 4 .4 5vs 4 .6 8± 0 .32 )。移植后第 2 8天 ( 2 8天 )输入NK细胞组CD3 细胞水平 [(33.6 9± 3.36 ) % ]低于未输入NK细胞组 [(5 0 .4 0± 5 .0 6 ) % ](P <0 .0 1) ,在 6 0天两组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　在小鼠allo BMT中 ,同种异基因反应性NK细胞可以提高造血干细胞的植入水平、促进造血及免疫重建、增高移植受鼠的生存率。     

NK细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

本研究探讨自然杀伤（NK）细胞在小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）中对移植排斥、造血及免疫重建的影响。以C57BL／6（H-2^b）小鼠为供鼠、BALB／c（H-2^d）小鼠为受鼠，分别在致死剂量和非致死剂量（≤7．0Gy）全身照射（TBI）的预处理条件下进行allo—BMT，移植同时输注供鼠外周T细胞和（或）NK细胞，移植后不同时间检测受鼠外周血白细胞、骨髓CD34^＋细胞数和外周血淋巴细胞中CD3^＋细胞、CD19^＋细胞及供鼠来源的H-2K^b＋细胞表达的百分率，并对不同移植组的存活率、植入与排斥、造血及免疫重建进行比较。结果表明：在致死剂量TBI预处理的移植中，输注NK细胞与不输注NK细胞的移植组比较，存活率显著增高（60天存活率为70％vs 0．0％）；白细胞数、CD19^＋细胞表达及骨髓CD34^＋细胞数恢复快；H-2K^b＋细胞的表达水平高[（86．68±4．45）％vs（4．68±0．32）％]。移植后28天输注NK细胞组CD3^＋细胞表达水平明显低于不输注NK细胞组[（33．69±3．36）％们（50．40±5．06）％，P〈0．01]，移植后60天两组比较差异无显著性（P〉0．05）。在非致死剂量TBI预处理的移植中，移植后30天．异基因骨髓移植组H-2K^b＋细胞表达率明显下降，移植后60天已下降至移植前水平；而输注高浓度和低浓度NK细胞的两组在移植后60天仍能检测到80％以上的H-2^b＋细胞表达。结论：在小鼠allo—BMT中，同种异基因反应性NK细胞可以抑制移植排斥，提高造血干细胞的植入水平，促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率。     

异基因骨髓移植小鼠联合输注IL-3/IL-6双基因转导的骨髓基质细胞促进造血恢复

探讨用逆转录病毒载体转入IL 3和IL 6双基因的骨髓基质细胞系QXMSC1IL 3/IL 6对异基因骨髓移植小鼠造血功能的促进作用。用逆转录病毒载体 (含小鼠IL 3cDNA ,人IL 6cDNA)分别转导到骨髓基质细胞系QXMSC1(H 2 d) ,构建骨髓基质细胞系QXMSC1IL 3/IL 6。供体小鼠BALB/c(H 2 d)骨髓去除骨髓中T细胞 ,受体小鼠C57BL/6(H 2 b)经γ射线致死量照射后 ,输入去除T细胞的供体骨髓 (1× 1 0 7/鼠 )的同时输入骨髓基质细胞QXMSC1IL 3/IL 6(5× 1 0 5/鼠 )。在骨髓移植后 2 0和 40天 ,分别检测骨髓移植小鼠外周血RBC ,WBC和骨髓有核细胞数及骨髓中CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM数。结果 :异基因骨髓移植共输入QXMSC1IL 3/IL 6基质细胞系可使异基因骨髓移植小鼠外周血RBC ,WBC数明显恢复 ,骨髓中有核细胞数 ,CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM明显增加。基质细胞系QXMSC1可作为有效的基因载体促进骨髓移植后造血功能重建。结论 :基质细胞转入细胞因子IL 3或IL 6基因可以进一步促进骨髓移植后造血功能重建 ,联合转导IL 3和IL 6有协同作用     

树突细胞应用于荷白血病小鼠免疫治疗的实验研究

目的探讨白血病抗原活化的树突细胞(DC)应用于荷白血病小鼠异基因骨髓移植 (allo-BMT)后免疫治疗的可行性及有效性。方法应用mGM-CSF及mIl-4从小鼠骨髓细胞扩增出成熟DC,使其负载经冻融法制备的L7212白血病细胞相关抗原。将进行allo-BMT后的荷白血病小鼠分 A(对照组)、B(T细胞组)、C(DC T细胞组)三组进行免疫治疗,观察小鼠生存率、生存期、移植物抗宿主病(GVHD)发生等情况及血清细胞因子水平和脾细胞细胞毒活力变化。对各组长期生存小鼠行二次攻击,以观察其体内抗白血病免疫能力。结果小鼠骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4联合作用7 d可生成大量成熟DC。B、C二组复发率分别为30％及0％,移植后长期生存率分别为30％及 70％,两组差异均有统计学意义(P<0．05),而GVHD发生率差异无统计学意义。两组平均生存时间分别为(32．95±13．29)d、(41．15±13．88)d,差异有统计学意义(P<0．01)。MYT法检测发现C组小鼠脾细胞对L7212细胞产生特异性杀伤作用;EIJSA法检测显示血清中Th1类因子IL-2水平为 (419．75±26．66)pg／ml,明显高于其他两组(P<0．01)。二次攻击后B、C二组生存率分别为33．3％及85．7％,差异有统计学意义(P<0．05)。结论肿瘤抗原负载的DC联合供者淋巴细胞输注是增强 allo-BMT后移植物抗白血病效应、减少白血病复发的有效手段。     

通过Fas-FasL途径体外清除小鼠同种异体反应性T细胞

目的　通过Fas Fas配体 (FasL)途径清除小鼠同种异体反应性T细胞 (ARTC) ,为减轻异基因骨髓移植 (allo BMT)后的移植物抗宿主病探索新的手段。方法　用磁性细胞分离系统分离BALB c小鼠 (H 2 d)Sca 1+早期造血细胞 (HC) ,然后借助逆转录病毒基因转移技术对其转染外源小鼠FasL(mFasL)cDNA基因 ;扩增 1周后与异基因BAC小鼠 (H 2 d ×b)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC) 6d ,观察处理后的BAC小鼠脾细胞对Na251 CrO4标记的BALB c小鼠脾细胞的杀伤作用。结果　成功分离出BALB c小鼠Sca 1+HC ,纯度为 (89.0± 6 .1) %。BAC小鼠脾细胞与转染外源mFasL的BALB cHC以 1∶5比例共培养 6d后 ,对BALB c源脾细胞杀伤率在不同效、靶比例时均呈显著降低 (P<0 .0 1)。结论　体外反应中 ,转染外源mFasLcDNA并高表达的早期HC可清除针对自身MHC抗原的ARTC。     

3种同种异基因混合骨髓移植小鼠〔A＋B＋C→A）的模型

本研究目的为建立 3种异基因小鼠 (BALB/c ,H 2 d;C5 7BL/ 6 ,H 2 b 和CBA/N ,H 2 k)混合骨髓移植模型(A +B +C→A) ,观察此模型能否延长骨髓移植后受体鼠的存活时间。采用受致死量照射的小鼠接受同基因与 2种异基因 3种混合 (比例为 1∶4∶4 )的骨髓移植。同时还观察了 3种混合淋巴细胞培养及 2种不同抗原混合刺激的迟发型超敏反应。结果显示 ,混合骨髓移植的小鼠存活时间明显长于单纯异基因移植的小鼠 ,混合移植组平均存活时间为 5 6 .6± 2 7天 ,最长者为 10 3天 ,而单纯异基因移植的对照组存活时间为 15± 5天 ,两组比较有显著性差异(P <0 .0 0 1) ;3种混合的淋巴细胞培养 ,不管是 2种反应细胞与 1种刺激细胞混合培养 ,还是 1种反应细胞与 2种刺激细胞混合培养 ,均表现明显低于一对一的混合淋巴细胞反应 ,2种混合细胞刺激的迟发型超敏反应亦明显低于1种抗原刺激的反应。结论 :同基因与 2种异基因 3种混合的骨髓移植可使受髓小鼠存活时间明显延长。     

化学修饰物甲氧基聚乙二醇对异基因骨髓移植影响的研究

为了探讨经甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的骨髓移植物对异基因移植并发症———移植物抗宿主病(GVHD)的影响,将BALB/cH2d小鼠经60Coγ线8.0Gy照射后随机分3组。A组经尾静脉注射RPMI1640,B组注射615H2k小鼠的骨髓及脾细胞混合悬液,C组注射等量的mPEG修饰后的骨髓及脾细胞混悬液。通过小鼠外观的观察、存活率和存活时间的测定及组织病理检查研究GVHD程度,通过染色体检查研究植入情况。研究结果表明:B组出现脱毛等表现较C组早,程度重,重症病例多(P≤0.05)。B组死亡小鼠30天存活率20%,平均存活时间为12.1±2.4天,C组为50%,平均存活时间为16.1±2.9天(P≤0.05);B组出现Ⅲ度GVHD比例为59%,C组为20%(P=0.050),B组和C组的异基因骨髓成功植入。结论:mPEG修饰的骨髓移植物可减轻GVHD程度,有望延长生存时间,提高生存率。     

慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统抑制移植物抗宿主病的实验研究

目的研究慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统对小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用。方法将转染HSV-TK基因的慢病毒感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾脏淋巴细胞，将感染后的淋巴细胞与供鼠骨髓细胞混合，移植给经。Co1射线照射后的受鼠（BALB／c小鼠）。分别于移植后当天、移植后7天（＋7天）和＋12天腹腔注射GCV25mg／kg×7d，观察受鼠生存期、GVHD发生率及严重程度、T细胞亚群（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果HSV-TK／GCV使用0天、＋7天、＋12天组受鼠生存时间分别为（30．10±5．21）d、（36．40±5．28）d、（28．20±4．82）d，三组生存时间均较移植对照组[（15．10±0．43）d]明显延长（P〈0．05）；HSV-TK／GCV＋7天组小鼠50d存活率达60％，高于HSV-TK／GCV0天（40％）和＋12天组（30％）（P〉0．05）。对照组小鼠全部发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅲ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。在＋5，＋10，＋15d，3个时间点实验组小鼠CD4^＋细胞明显高于对照组（P〈0．05），CD8^＋细胞均低于对照组（P〈0．05）。＋30天受鼠异基因嵌合率为100％。结论慢病毒载体介导的HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo—BMT后GVHD；＋7天外周血白细胞数开始回升时用GCV控制GVHD效果最佳。