雷帕霉素脂质体滴眼液对角膜碱烧伤新生血管治疗的研究

目的 制备雷帕霉素(RAPA)脂质体滴眼液并研究RAPA对碱烧伤后大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的抑制作用.方法 利用薄膜分散法制备RAPA脂质体滴眼液.采用成组设计法,将102只健康Wistar大鼠分组,碱烧伤后每日裂隙灯显微镜观察眼局部情况,并详细记录碱烧伤后大鼠角膜反应情况与新生血管生长情况,分别于碱烧伤后1d、4d、7d、14d随机抽取各组大鼠取材,行HE染色分析.实验结果采用方差分析及组间q检验进行分析.结果 (1)制得的RAPA脂质体,为完整的类球形,平均粒径为145.2 nm,包封率为90.02％,RAPA脂质体滴眼液中RAPA含量高,粒径合适,可作为滴眼液用于动物实验.(2) RAPA脂质体滴眼液组CNV生长迟缓、稀疏,退化较早;CNV面积较小,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脂质体是RAPA良好的药物载体.RAPA能显著抑制CNV的生长,有望成为防治CNV的一种有效方法.     

碳酸酐酶抑制剂的局部应用对大鼠角膜新生血管形成过程中水通道蛋白1表达的影响

背景研究表明,水通道蛋白1（AQP1）与大鼠碱烧伤后角膜新生血管（CNV）的形成密切相关,碳酸酐酶抑制剂具有抑制AQP1的作用,从而可间接抑制CNV,但其全身应用不良反应较重,因此局部碳酸酐酶抑制剂布林佐胺滴眼液对CNV的作用受到关注。目的研究局部应用布林佐胺滴眼液对大鼠碱烧伤后CNV形成过程中AQP1表达的影响。方法健康SD大鼠35只按随机数字表法随机分为正常对照组5只10只眼、模型组15只30只眼和布林佐胺组15只30只眼。模型组和布林佐胺组大鼠用浸有1mol／LNaOH溶液的滤纸贴附于角膜40s建立角膜碱烧伤大鼠模型,布林佐胺组大鼠在造模后用布林佐胺滴眼液点眼,正常对照组和模型组大鼠用生理盐水点眼。造模后3d裂隙灯下对角膜烧伤程度进行分级;造模后3、5、7、10d对大鼠角膜混浊度进行评分,同时测量CNV的生长面积。造模后第10天获取大鼠角膜组织并行苏木精-伊红染色观察大鼠角膜的组织病理学改变,透射电子显微镜下观察各组角膜超微结构的改变。应用免疫组织化学法检测AQP1及血管内皮生长因子（VEGF）在各组大鼠角膜中的表达。结果裂隙灯下模型组与布林佐胺组大鼠角膜碱烧伤的评分差异无统计学意义（t=0．97,P〉0．05）。正常对照组大鼠角膜无水肿、无混浊,无CNV生成;造模后5d布林佐胺组大鼠角膜水肿、混浊评分低于模型组（t=2．18,P〈0．05）,CNV面积小于模型组（t=6．58,P〈0．01）。角膜组织病理学检查显示,布林佐胺组大鼠较模型组大鼠CNV及炎性细胞少。透射电子显微镜检查显示,模型组大鼠CNV旺盛,布林佐胺组大鼠角膜较模型组大鼠角膜血管腔少见。免疫组织化学检测表明,正常对照组大鼠角膜组织中可见AQP1和VEGF呈弱表达;模型组及布林佐胺组大鼠角膜碱烧伤后角膜组织中VEGF灰度值分别为84．92±9．49和78．18±11．41,差异有统计学意义（t=2．48,P=0．02）,2个组AQP1灰度值分别为88．01±11．03和58．10±12．14,差异有统计学意义（t=9．99,P=0．00）。结论布林佐胺滴眼液能抑制大鼠角膜碱烧伤后CNV形成过程中AQP1的高表达,从而间接影响VEGF的表达,抑制或延缓CNV的形成。     

粉防己碱对大鼠角膜新生血管HIF-1α和VEGF表达的影响

目的研究粉防己碱（tetrandrine，Tet）对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法建立大鼠角膜碱烧伤诱发CNV模型，采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法，分别检测使用Tet前后HIF-1α和VEGF在SD大鼠CNV中的表达情况。结果在正常角膜，HIF-1α和VEGF没有表达或在上皮基底膜有微弱表达；在新生血管对照组，角膜全层HIF-1α和VEGF表达明显增强，其表达部位主要分布在新生血管形成区域和上皮全层；用药组角膜新生血管密度明显减低，HIF-1α和VEGF相应在角膜基质层新生血管形成区域表达减少。经SPSS软件分析，3组间具有统计学差异。结论Tet可以有效地抑制大鼠角膜碱烧伤诱发CNV的生长，降低角膜新生血管HIF-1α和VEGF的表达。[眼科新进展2007；27（2）：102—105]     

电离辐射对角膜新生血管形成的抑制作用

背景 角膜新生血管(CNV)可发生在多种跟表疾病中,常可加重病情,但有效的临床治疗方法仍在探索中. 目的 探讨电离辐射对角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用.方法 76只清洁级Wistar纯系大鼠中70只用角膜碱烧伤的方法建立大鼠右眼CNV模型,然后按照随机数字表法将造模动物分为β射线10 Gy一次性照射组2只、β射线7 Gy分次照射组17只、β射线10 Gy分次照射组17只、质量分数1％环孢素A(CsA)点眼组17只和角膜碱烧伤模型组17只,6只正常兔6只眼(均取右眼)作为正常对照组.用90 Sr-90Y眼科敷贴器于右眼角膜碱烧伤后第1天开始沿角膜缘进行β射线照射,1％ CsA点眼组用药时间与照射时间相同.实验后每日行裂隙灯检查并计算CNV长度和面积.于角膜碱烧伤后3、5、7d制备角膜组织石蜡切片和匀浆,采用免疫组织化学法检测各组大鼠角膜组织中bcl-2、bax、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,分别采用Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠角膜组织中VEGF蛋白及mRNA表达的变化.结果 角膜碱烧伤后7d,裂隙灯下可见β射线10 Gy一次性照射组、β射线10 Gy分次照射组均出现角膜溃疡,角膜碱烧伤模型组可见大量CNV生成,而β射线7 Gy分次照射组和1％CsA点眼组CNV明显较少.角膜碱烧伤后7d,β射线7 Gy分次照射组、1％ CsA点眼组CNV长度和面积均明显小于角膜碱烧伤模型组,差异均有统计学意义(长度:q=14.40、24.20,P＜0.01;面积:q=17.80、14.00,P＜0.01).免疫组织化学检测表明,与角膜碱烧伤模型组比较,β射线7Gy分次照射组、1％CsA点眼组大鼠角膜中bcl-2和VEGF蛋白表达均减弱,而bax蛋白表达均增强.RT-PCR检测表明,β射线7 Gy分次照射组、β射线10 Gy分次照射组、1％CsA点眼组VEGF mRNA表达强度明显低于角膜碱烧伤模型组,Western blot检测发现VEGF蛋白的表达与VEGFmRNA的表达遵循同样的规律.结论 90Sr-90Y跟科敷贴器小剂量分次放射治疗可明显抑制角膜碱烧伤后CNV的生长,并且以β射线7 Gy分次照射作用效果最佳.     

瘦素和血管内皮生长因子在碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型中的表达

目的 观察碱烧伤后不同时期角膜的组织病理学变化,以及瘦素和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VFGF)的表达,探讨它们与角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的关系.方法 使用碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管模型,采用浸润1 mol·L-1 NaOH溶液、直径为3 mm的单片滤纸,准确置于大鼠右眼角膜中央30 s,制作CNV模型.25只SD大鼠右眼为实验眼,随机分成5组,每组5眼,左眼为正常对照眼.每天用裂隙灯显微镜观察角膜新生血管,分别计算新生血管长度和面积.并行HE染色和免疫组织化学检测.结果 碱烧伤后4 d、7 d、14 d、21 d,实验组CNV面积分别为:(2.55±0.15)m2、(4.15±0.36)mm2、(10.21±0.45)mm2、(8.56±0.06)mm2.免疫组织化学检测显示角膜碱烧伤后1 d,实验组瘦素、VEGF的表达开始增高,碱烧伤后14 d达高峰,14 d后瘦素、VEGF的表达下降,21 d后显著下降;其表达部位主要分布在形成的新生血管区域和上皮层;正常对照组瘦素可微弱表达于角膜上皮层和基质层,VEGF没有表达或仅在上皮基底膜有微弱表达.实验组角膜瘦素、VEGF阳性表达率较对照组明显增加(χ2=29.07,P=0.001;χ2=35.51,P=0.001),瘦素与VEGF的表达具有正相关性(r=0.95,P=0.001).结论 瘦素和VEGF表达水平与角膜新生血管的生成具有相关性,瘦素可能成为治疗CNV的靶点.     

蛹虫草提取物抑制大鼠角膜新生血管的实验研究

目的研究蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)对碱烧伤所致大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的抑制作用。方法采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型,75只大鼠随机分为5组:A组为模型对照组,B组为阳性对照组,C组、D组、E组分别为高、中、低剂量CME治疗组,造模后每组均隔日给药,A组给予生理盐水结膜下注射,B组给予0.5g·L-1地塞米松结膜下注射,C组、D组、E组分别给予10.0mg、5.0mg、2.5mg CME结膜下注射。于造模后第4天、第8天、第14天测量CNV的生长面积,并检测角膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)蛋白及其mRNA的表达情况。结果造模后第4天,C组、D组、E组的CNV面积分别为(4.23±1.62)mm2、(6.15±3.52)mm2、(7.78±1.33)mm2,第8天分别为(6.89±1.93)mm2、(10.19±3.37)mm2、(11.51±3.70)mm2,第14天分别为(12.55±3.96)mm2、(17.14±2.71)mm2、(19.77±5.75)mm2,均较A组(12.03±2.09)mm2、(22.09±4.24)mm2、(25.19±2.22)mm2明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组与B组表达水平相当,差异无统计学意义(P>0.05)。C组、D组、E组角膜组织中VEGF蛋白及其mRNA的表达较A组明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组与B组表达水平相当,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CME能有效抑制碱烧伤所致大鼠CNV的形成,抑制角膜组织中VEGF的表达可能是其抑制CNV生长的机制之一。     

HIF在兔角膜碱烧伤后CNV生成中的作用研究

目的研究缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)以及诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在角膜碱烧伤后角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中的作用及机制。方法 建立兔CNV动物模型,将其随机分为对照组和3个实验组,对照组结膜下注射生理盐水,实验组注射不同剂量的三氧化二砷。观察兔CNV的生长情况,并记录CNV的生长面积。用免疫组织化学方法检测兔角膜HIF、iNOS以及VEGF的表达。结果 对照组6 d、12 d、15 d、21 d、28 d CNV的面积分别为:(53.86±20.60)mm2、(87.21±25.80)mm2、(128.31±40.10)mm2、(114.42±29.40)mm2、(78.15±35.13)mm2。各实验组CNV面积均小于对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学方法检测角膜HIF-1α、iNOS及VEGF蛋白的表达:VEGF表达集中在角膜上皮下基质,存在于血管内皮细胞、炎性细胞胞浆内,呈深黄色。在7 d有较高表达,14 d达到高峰,28 d时明显降低,且对照组明显高于实验组,各实验组的表达随三氧化二砷剂量的增加而减少。蛋白的表达与CNV面积呈正相关。结论 角膜碱烧伤后CNV的形成可能与HIF-1α有关。三氧化二砷通过抑制HIF-1α和iNOS、VEGF表达而抑制兔CNV的形成。     

改良内皮抑素基因对大鼠角膜新生血管中血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用

背景 内皮抑素(ES)是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子,能抑制新生血管的发生,而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的聚合能增强ES基因的功能. 目的 探讨改良ES基因对大鼠角膜新生血管(CNV)中血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF受体2(Flk-1)表达的影响及作用机制. 方法 102只清洁级SD大鼠按随机数字表法分为模型组、pCI空载体组、pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组,每组24只;正常组6只.用浸有1 mol/L NaOH溶液的直径3 mm圆形滤纸片快速贴于大鼠角膜中央40 s建立角膜碱烧伤CNV模型,以pCI质粒作为改良前后ES基因的表达载体,每周2次结膜下注射3μg含质粒的转染液进行基因治疗.每日裂隙灯显微镜下观察角膜水肿及CNV生长情况,计算CNV面积.于碱烧伤后1、4、7、14 d用过量麻醉法处死模型鼠并获取角膜组织,用免疫组织化学法检测CNV内皮细胞中CD34的表达以计算CNV密度,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法分别检测角膜VEGF mRNA及Flk-1在角膜中的表达. 结果 角膜碱烧伤后7～14d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组CNV面积均明显小于pCI空载体组和模型组,CNV密度均明显小于pCI空载体组和模型组,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);pCI-RGDRGD-ES转染组CNV面积均明显小于pCI-ES转染组,CNV密度均明显少于pCI-ES转染组,差异均有统计学意义( P＜0.05,P＜0.01).碱烧伤后4d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜Flk-1蛋白表达水平明显低于正常对照组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05);碱烧伤后4d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜VEGF mRNA的表达水平明显低于正常对照组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05);pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜VEGF mRNA表达水平明显低于pCI-ES转染组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 结膜下注射ES基因或RGDRGD-ES基因均能抑制碱烧伤诱导的CNV,但RGDRGD-ES基因对CNV的抑制作用更强,其作用机制为抑制VEGF及其受体Flk-1的表达.     

诺帝滴眼液对大鼠角膜碱烧伤的治疗作用

目的 前期研究证实诺帝滴眼液能有效抑制大鼠角膜新生血管(corneal neovascu-larization,CNV),在此基础上进一步探讨诺帝滴眼液对大鼠角膜碱烧伤的综合疗效,并探索其有效浓度的最佳值,为将来诺帝滴眼液应用于临床奠定理论基础.方法 建立大鼠碱烧伤模型,分为空白对照组、1 g·L-1地塞米松组、0.25 g·L-1和1 g·L-1诺帝滴眼液治疗组.定量分析CNV生长、角膜混浊程度以及角膜上皮愈合情况的变化,HE染色及电镜观察炎症,性角膜的组织学形态.结果 0.25 g·L-1和1 g·L-1诺帝滴眼液治疗组CNV生长、角膜混浊程度及角膜上皮缺损均小于空白对照组(P<0.01);治疗组间比较,1 g·L-1诺帝滴眼液抑制CNV效果最佳(P<0.05);1 g·L-1诺帝治疗组与地塞米松组抑制CNV程度无明显差异(32.97%±5.76%、29.53%±7.63%,P>0.05),但1 g·L-1诺帝治疗组角膜上皮愈合优于地塞米松组(0.37±0.37)mm(P<0.05).结论 诺帝滴眼液能够有效抑制炎症性角膜新生血管的生长,减轻角膜混浊,并能促进角膜上皮愈合.其中以1 g·L-1浓度效果最佳.     

缺氧诱导因子-1α及促红细胞生成素在大鼠角膜新生血管中的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在碱烧伤大鼠角膜组织中的表达,评估其在角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)发生发展中的作用。方法:健康3月龄SD大鼠,随机分为实验组和对照组,碱烧伤法建立CNV模型,分别于造模成功后1,3,5,7,14d测量CNV的长度并计算面积,同时取角膜组织以免疫组织化学检测HIF-1α及EPO的表达部位,并以RT-PCR法检测其mRNA的表达情况,实验数据采用SPSS 20.0处理。结果:碱烧伤后1,3,5,7,14d,CNV的面积随时间逐渐增加,7d生长最为旺盛,14d后生长减慢。免疫组织化学提示:正常角膜各层未见HIF-1α的表达,可见微量EPO,碱烧伤后1d时HIF-1α及EPO免疫活性增强,主要表达于角膜上皮及内皮层。RT-PCR结果显示HIF-1α及EPO mRNA的表达在正常大鼠角膜组织中表达极少,在角膜碱烧伤后3d表达增强,7d达到高峰,14d后明显下降;不同时间点组间比较存在统计学差异(P<0.05)。结论:HIF-1α和EPO与CNV的形成密切相关。     

氢气水对大鼠碱烧伤角膜新生血管抑制作用的研究

目的　研究氢气水（H₂水）滴眼对大鼠碱烧伤诱导角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）的抑制作用并探讨H₂水抑制CNV的机制。方法　SPF级SD大鼠48只48眼,成功建立碱烧伤诱导CNV模型,随机分为空白组、对照组和治疗组。治疗组给予1.6×10^-6 H₂水滴眼,对照组给予妥布霉素地塞米松眼液滴眼,空白组不做任何处理。分别在模型建立后第1天、第3天、第7天、第14天测量CNV长度,计算CNV面积。碱烧伤后第14天深麻醉下取大鼠角膜及房水,免疫组织化学染色法检测角膜组织中PEDF蛋白表达,RT-PCR法检测角膜组织中PEDF mRNA表达,ELISA检测房水内TNF-α蛋白表达。结果　角膜碱烧伤后第3天、第7天、第14天,治疗组新生血管面积分别为（3.26±1.82）mm²、（8.59±3.98）mm²和（3.24±2.34）mm²;对照组分别为（4.27±2.68）mm²、（6.44±4.67）mm²和（15.98±4.75）mm²;空白组分别为（9.49±2.79）mm²、（17.71±4.06）mm²和（25.35±1.40）mm²。碱烧伤后第3天、7天和14天,治疗组和对照组均小于空白组,差异均有显著统计学意义（均为P＜0.01）;碱烧伤后第3天和第7天,治疗组与对照组差异均无统计学意义（均为P>0.05）;碱烧伤后第14天治疗组明显小于对照组,差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。碱烧伤后第14天,免疫组织化学染色结果显示,治疗组角膜上皮层PEDF蛋白表达较对照组和空白组明显增强,基质层新生血管极少;RT-PCR检测结果显示,治疗组PEDF mRNA表达明显高于对照组和空白组,差异均有显著统计学意义（均为P＜0.01）;ELISA检测结果显示,治疗组房水中TNF-α蛋白含量明显低于对照组与空白组,差异均有显著统计学意义（均为P＜0.01）。结论　1.6×10^-6 H₂水滴眼能有效抑制大鼠碱烧伤诱导的CNV。     

缺氧诱导因子1α在碱烧伤后兔角膜新生血管形成中的作用

目的 观察碱烧伤后兔角膜新生血管形成的不同时期缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在角膜内的表达,探讨HIF-1α对角膜新生血管形成的影响.方法 实验研究.取30只健康家兔,采用随机数字表法分成5组,每组各6只兔,右眼采用1 mol/L氢氧化钠溶液建立角膜碱烧伤模型,左眼作为自身对照.分别于碱烧伤前和碱烧伤后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯显微镜下观察家兔角膜新生血管增生情况,HE染色观察角膜组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检验角膜组织中HIF-1α的表达,计算炎性细胞（多形核白细胞和淋巴细胞）和HIF-1α阳性细胞核数,对其结果行单因素方差分析及相关分析.结果 角膜碱烧伤后,HIF-1α主要表达在角膜基质中的炎性细胞、血管内皮细胞的细胞核中.随着时间的增加,炎性细胞表达增强,HIF-1α表达量也相应增加,并于碱烧伤后5 d达到高峰,以后逐渐减少.碱烧伤后1、3、5、7、14 d,角膜组织中炎性细胞和HIF-1α表达水平的差异均有统计学意义（F=422.086,437.555;P均＜0.05）,且HIF-1α的表达与新生血管的形成在时空上一致.经相关分析,角膜中炎性细胞和HIF-1α阳性细胞表达呈正相关（r=0.860,P＜0.05）.结论 碱烧伤后炎症反应能诱导HIF-1α的表达,而HIF-1α能促进角膜新生血管的形成.     

小鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α和水通道蛋白-1在角膜中的表达

目的　检测小鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α）及水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达情况,探讨角膜碱烧伤后HIF-1α及AQP1在其损伤机制中的作用。方法　选用健康成年雌性昆明系小鼠48只,左眼为对照组,右眼用1 mol·L^-1 NaOH建立角膜碱烧伤模型,并随机分为碱烧伤后1 d组、4 d组、7 d组、14 d组,每组12只,免疫荧光染色法和实时荧光定量PCR法检测碱烧伤后角膜HIF-1α、AQP1的表达情况。结果　免疫荧光染色结果显示,对照组中HIF-1α在角膜上皮基底膜弱表达,碱烧伤后1 d HIF-1α在角膜上皮层表达开始增强,4 d在角膜上皮层和基质层均表达,至7 d时HIF-1α表达达到峰值;对照组中AQP1在角膜内皮层弱表达,碱烧伤后1 d,AQP1在角膜内皮层表达开始增强,4 d和7 d时AQP1在角膜内皮层和基质层均表达,且表达更强。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组（188.70±33.99）相比,碱烧伤后1 d组（269.70±15.68）、4 d组（350.50±67.26）、7 d组（272.10±6.88）的HIF-1α mRNA相对表达量增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与对照组（36.43±3.95）相比,碱烧伤后1 d组（61.90±5.45）、7 d组（48.34±1.33）的AQP1 mRNA相对表达量增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　碱烧伤引起了角膜病理性变化,HIF-1α和AQP1参与碱烧伤后角膜损伤的病理机制。     

加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞增生的抑制作用

背景 黄斑区脉络膜新生血管(CNV)是致盲率较高的眼病之一,以往的主要治疗方法是光动力学疗法和玻璃体腔抗血管内皮生长因子(VEGF)药物注射,但均存在一定的不良反应.研究认为,加减驻景方的应用对相关病变有治疗效果. 目的 探讨加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞(RCVECs)增生的影响. 方法 10只SD大鼠给予0.525 g/ml加减驻景方药液20 ml/kg灌胃3d,于末次给药后2h无菌条件下采集腹主动脉血,制备加减驻景方含药血清.将培养的RCVECs分为4个组,空白对照组细胞用常规培养液进行培养,氯化钴组在培养液中添加100 μmol/L氯化钴100μl以制备细胞缺氧模型,空白血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％空白血清,含药血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％含药血清.细胞培养后24 h采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的增生情况;采用逆转录PCR和Western blot技术检测各组细胞中缺氧诱导因子-lα(HIF-lα)基因和蛋白的相对表达量.结果 培养的RCVECs生长良好,呈梭形.100 μmol/L氯化钴作用后成功建立了缺氧细胞模型.MTT法检测显示,空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组吸光度(A)值分别为0.659±0.051、0.757±0.553、0.683±0.037和0.731±0.038,其中氯化钴组A值明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(HIF-1αmRNA:F=3.100,P＜0.05;VEGF mRNA:F=3.420,P＜0.05;HIF-1α蛋白:F=470.600,P=0.000;VEGF蛋白:F=146.700,P=0.000),其中氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 加减驻景方含药血清可能通过抑制RCVECs分泌HIF-1α和VEGF的机制而抑制缺氧状态下RCVECs的增生.     

信号转导与转录激活因子3在脉络膜新生血管发生中的可能作用

目的　观察磷酸化信号转导与转录激活因子3（STAT3）在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管（CNV）中的表达,探讨STAT3在CNV中可能的作用。方法　建立激光诱导的大鼠CNV模型,免疫荧光法观察CNV生成早期磷酸化STAT3的表达。建立细胞缺氧模型,细胞培养液中加入Janus激酶2（JAK2）特异性阻断剂AG490后培养1、3、6、12、24 h。流式细胞仪检测视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生指数,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和VEGF的mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养液上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的含量。结果　激光光凝后3 d,磷酸化STAT3高表达于大鼠CNV区域。阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞随时间增生指数明显降低（t=1.472,3.566,2.391,6.420;P=0.054,0.038,0.042,0.016）。随缺氧时间增加,HIF-1α和VEGF mRNA表达逐渐增强。采用AG490阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达、HIF-1α蛋白的活化均受明显抑制(t=0.07,0.02,0.01, P＜0.05);细胞培养上清液中VEGF含量显著降低（t=1.330,1.106,2.828,7.742,5.610,6.894,P=0.082,0.063,0.014,0.002,0.016,0.011）。结论　STAT3可能参与了CNV的发生,这一过程部分是通过JAK2/STAT3信号转导通路调控RPE细胞HIF-1α和VEGF表达而实现的。      

康柏西普对实验性脉络膜新生血管的作用机制研究

目的　探究康柏西普对实验性脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的作用机制。方法　选取40只7周龄的雄性BN大鼠，采用多波长氪激光对豚鼠左眼行视网膜光凝，制作CNV大鼠模型，并随机分为4组，空白对照组、模型组、低剂量康柏西普组和高剂量康柏西普组；于造模后7 d、14 d注射康柏西普，并在造模后21 d进行右眼眼底彩照、眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）检查，检测CNV 发生率及渗漏面积，使用FITC灌注脉络膜铺片测量CNV面积，使用HE染色观察大鼠视网膜结构，使用Western blot检测大鼠视网膜中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸激酶 （serine/threonine kinase，AKT）表达情况。结果　除吲哚菁绿血管造影荧光点数、CNV发生率外，相比空白对照组，模型组大鼠CNV渗透面积，荧光素渗漏面积，脉络膜结构损伤程度，视网膜中 HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表达均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；相比模型组，康柏西普组大鼠上述各指标显著降低，高剂量康柏西普组上述各指标显著低于低剂量康柏西普组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　康柏西普可以抑制脉络膜视网膜中 HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表达，从而抑制由氪激光光凝眼底而产生的实验性CNV生长。     

血管抑素对角膜新生血管和VEGF表达的作用

目的:探讨血管抑素(angiostatin,AS)对鼠碱烧伤角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的作用,探讨 AS对CNV的作用及机制。方法:SD大鼠105只随机分为正常对照组(5只)、生理盐水组、地塞米松组、AS1组、AS2组(各25只),除正常组外,实验各组制作左眼碱烧伤CNV模型,分别予生理盐水、1g/L地塞米松液、10μg/mLAS液、20μg/mLAS液点眼,4次/d,于碱烧伤后1,3,7,14,21d运用裂隙灯、免疫组织化学方法观察新生血管长度及面积、VEGF的表达。结果:AS治疗组碱烧伤后第3d起各时间点CNV面积均明显小于盐水组(P<0.05)。碱烧伤后各时间点AS治疗组VEGF表达量均明显少于盐水组(P<0.05)。结论:AS能显著抑制碱烧伤CNV,可能与其抑制VEGF的表达有关。     

外源性肿瘤坏死因子α对碱烧伤诱导角膜新生血管的影响及机制

目的探讨外源性肿瘤坏死因子α（TNF—α）局部干预对碱烧伤诱导角膜新生血管（CNV）形成的影响及内在机制。方法BALB／c小鼠45只,利用碱烧伤法制作左眼CNV模型。根据实验设计．分3组实验进行研究。①CNV模型小鼠15只,随机分为3组,每组5只。自伤后分别给予100、500μg／ml TNF—α（实验组）或0-2％透明质酸钠（HA,对照组）点眼1周。于碱烧伤后第14天处死小鼠取眼球,免疫组织化学法检测各组角膜组织中CD31的表达,计数微血管密度（MVD）,分析TNF-α对碱烧伤CNV形成的作用。②CNV模型小鼠20只．随机分为2组,每组10只。实验组给予100μg／mlTNF一仅点眼,对照组给予0．2％HA点眼。分别于伤后第2天和第4天随机取5只小鼠处死取角膜．RT—PCR法检测角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达情况,分析TNF—α对碱烧伤角膜中VEGF表达的影响。③利用二氯亚甲二磷酸脂质体（Cl2MDP—lip）射制作小鼠巨噬细胞特异剔除模型,10只BALB／c小鼠随机分为Cl2MDP—lip实验组及PBS—lip对照组,每组5只。所有小鼠自碱烧伤后均给予100μg／mlTNF-α滴眼1周于.伤后第14天拍照记录CNV形成情况,图像分析软件测算CNV长度及面积,分析巨噬细胞在TNF—α调控碱烧伤后CNV形成中的作用。结果①碱烧伤后第14天,100μg／mlTNF-α组CNV形成较对照组明显增多．而500μg／ml TNF-α组CNV形成与对照组差异不明显。整张切片和热点区域MVD值,100μg／ml TNF-α组为63．25±9．75和114．94±12．93,500μg／ml TNF-α组为39．53±10．41和108．04±23．55．0．2％HA对照组为30．99±7．08和73．81±13．80和100μg／mlTNF—α组与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,而500μg／mlTNF-α组与对照组相比差异无统计学意义（19〉0．05）。②碱烧伤后第2天和第4天VEGFmRNA与β—actin的比值,100μg／mlTNF-α组为0．40±0．12和1,51±0．21,0．2％HA对照组为0,31±0．10和0．58±0．30。两组差异均有统计学意义（P〈0．05）。⑧碱烧伤后第14天,Cl2MDP—lip组CNV形成较对照组明显减少,Cl2MDP—lip组的CNV长度和面积分别为（0．84±0．10）mm和（6．64±1．19）mm^2,PBS—lip对照组为f1．37±0．24）mm和（12．25±1．33）mm^2,两组差异有统计学意义（P〈0．01）.结论外源性TNF-α可通过上调碱烧伤角膜组织中VEGF表达来促进CNV的形成,其促进碱烧伤CNV形成机制主要是通过巨噬细胞起作用．     

反应停对大鼠碱烧伤诱导角膜新生血管的影响

目的:研究反应停(thalidomide)对碱烧伤诱导角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的影响。方法:建立大鼠角膜碱烧伤诱导CNV模型,SD大鼠36只随机分成角膜新生血管对照组(A组)、反应停灌胃组(B组)和反应停球结膜下注射组(C组)。采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法,检测碱烧伤后各时间点不同处理方法大鼠CNV的生长情况及VEGF的表达情况。结果:B组和C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达均显著少于A组(P均(0.05);C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达少于B组(P均<0.05)。结论:反应停可有效抑制大鼠角膜碱烧伤诱发CNV的生长,降低角膜新生血管VEGF的表达。球结膜下注射较全身应用更有效。