血管内皮生长因子(VEGF)对培养内皮细胞VEGF受体表达的影响

目的 :为探讨VEGF对培养内皮细胞 (EC)VEGF受体表达的影响。方法 :将培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)随机分为 4组 :( 1)正常对照组 ;( 2 )低氧培养组 ;( 3)VEGF 10ng/ml组 ;( 4)低氧 +VEGF10ng/ml组。HUVEC低氧培养参照Kuwara等介绍的方法并加以改进。HUVECVEGF受体的检测采用免疫组织化学方法。结果 :采用简易低氧培养法 ,48h内培养液氧分压维持在 5 8mmHg ;与对照组相比 ,低氧培养组、VEGF组和低氧 +VEGF组HUVECVEGF受体Flk 1/KDR阳性细胞数增多 ,强度增加 ;但未检测到VEGF受体Flt 1表达。结论 :低氧可使HUVEC表面的VEGF受体Flk 1/KDR表达增加 ,VEGF同源上调其受体Flk 1/KDR ,低氧和VEGF在调节VEGF受体Flk 1/KDR方面有协调作用。     

转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究

目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段。材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC。从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低。实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1μg/3μl;2μg/6μl;2μg/8μl;3μg/12μl。ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达。再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面。复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的。结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数最多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532·5±43·1pg/ml。使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69·9%±3·5%、43·7%±2·5%,有明显改善。结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附。     

人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16 5基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础     

脂质体介导的VEGF_(165)基因转染对内皮细胞生长的作用

构建血管内皮细胞生长因子基因VEGF165真核表达载体pcDNA3 VEGF165,以阳离子脂质体介导的基因转染技术 ,将基因转入原代培养的人脐静脉内皮细胞中。结果表明 ,基因转染 1h后细胞内就有VEGFDNA存在 ,VEGFmRNA水平显著上升 ;基因转染 2d后培养液上清VEGF蛋白表达显著上升 (135 5 12± 6 2 34)pg/ml和 (19 2 7± 2 96 )pg/ml,P <0 0 1。转染VEGF165基因 2d的内皮细胞再经程序降温冷冻保存复苏后 ,其存活率显著高于对照组 (pcDNA3 组 ) (90 13%± 2 84 %和81 5 2 %± 2 15 % ,P <0 0 5 ) ,凋亡率显著低于对照组 (7 15 %± 0 4 2 %和 17 6 1%± 1 5 6 % ,P <0 0 5 )。MTT法显示转染VEGF165基因能促进内皮细胞VEGF蛋白的表达 ,促进细胞增殖 ,抑制细胞凋亡。在治疗心脏及下肢动脉缺血性疾病中 ,VEGF165基因治疗可能具有重要的意义。     

重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞条件的优化

背景：血管内皮生长因子能够提高骨细胞的增殖能力,促进骨折局部血管发生,在骨缺损修复过程中发挥着至关重要的作用。 目的：优化重组真核质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞的条件,为构建新型组织工程骨种子细胞提供实验基础。 方法：体外分离、培养并鉴定兔成骨细胞。分别应用0.8,1.0,1.2 μg的质粒和1.5,2.0,2.5,3.0 μL脂质体两两组合,通过脂质体法将重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染入兔成骨细胞,转染48 h后倒置荧光显微镜下观察并测定转染率。 结果与结论：随着脂质体剂量的增加,成骨细胞死亡增多。转染48 h后,倒置荧光显微镜下可见细胞质内发绿色荧光的小颗粒成弥散分布,或在核周浓集成块状。其中,脂质体2.5 μL和质粒1.2 μg条件下的转染率最高,可达56%。说明质粒与脂质体之间的交互作用能够显著影响转染率,脂质体2.5 μL和质粒1.2 μg是转染兔成骨细胞的最佳条件。     

VEGF165转染大鼠血管内皮细胞对新生血管形成影响的实验研究

目的探讨血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因与增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）共表达载体转染大鼠血管内皮细胞，植入大鼠体内，观察诱导新生血管情况，为移植组织诱导新生血管形成奠定基础。方法对质粒pIRES2-EGFP／VEGF，岱进行扩增、纯化，以脂质体法转染大鼠血管内皮细胞并植入肾被膜下。采用荧光显微镜检测增强绿色荧光蛋白在内皮细胞中的表达，用流式细胞仪检测转染效率。用RT-PCR检测VEGF mRNA的表达。免疫组化检测VEGF在内皮细胞中的表达。切取移植肾脏组织标本,HE染色观察组织形态学变化。结果荧光显微镜观察到实验组内皮细胞有特异性的EGFP表达。流式细胞仪分析转染效率为13．06％。实验组血管内皮细胞胞核和胞浆中均有VEGF表达。RT-PCR显示实验组大鼠血管内皮细胞中有人源化VEGF165基因在mRNA水平表达。移植后14d，实验组大鼠肾被膜下可见成团的新生毛细血管网形成，而对照组及空白转染组尽管血管内皮细胞仍存活，但未形成明显血窦。结论转染VEGF是促进内皮细胞早期（14d内）形成新生血管的有效途径。     

血清VEGF、sFlt-1、NO在妊娠期高血压疾病患者中的表达水平及意义

目的探讨VEGF,sFlt-1,NO三种因子在妊娠期高血压疾病患者血清中的表达。方法选取在潍坊市妇幼保健住院分娩的80例孕妇为研究对象。实验组40例（包括妊娠期高血压组10例、轻度子痫前期组15例,重度子痫前期组15例）,正常妊娠妇女40例为对照组。比较两组患者血清中VEGF、sFlt-1及NO的表达水平。结果 1.妊娠期高血压疾病患者血清中VEGF的表达水平明显低于对照组（P〈0.05）;sFlt-1的表达水平明显高于对照组（P〈0.05）;NO的表达水平明显低于对照组（P〈0.05）,差异均有统计学意义。2.子痫前期组三种因子的变化最明显。3.实验组sFlt-1/VEGF比值与疾病严重程度呈明显正相关（P〈0.05）。实验组NO表达水平与疾病严重程度呈明显负相关（P〈0.05）。结论妊娠期高血压疾病患者血清sFlt-1表达水平升高,游离VEGF及NO表达水平降低,其升高与降低水平与病情轻重关系密切,参与妊娠期高血压疾病的发生发展。     

血管内皮生长因子与促血管生成素1对大鼠血管内皮细胞的作用

背景：血管内皮生长因子、促血管生成素1是血管形成过程中始动并且使之持续的重要因子,研究其对血管内皮细胞的作用具有重要的意义。 目的：观察血管内皮生长因子与促血管生成素1对培养血管内皮细胞迁移与增殖能力的影响,并探讨其在血管生成方面的作用机制。 方法：在大鼠脐静脉内皮细胞内单独或联合加入血管内皮生长因子、促血管生成素1后,划痕实验和MTT检测对细胞迁移与增殖的影响,观察内皮细胞形态、活性、迁移能力。 结果与结论：划痕实验显示单独血管内皮生长因子作用时,与空白对照组细胞迁移无明显差异,单独促血管生成素1作用时,不仅不能增加细胞的迁移作用,反较空白对照组有所减弱,当血管内皮生长因子与促血管生成素1联合作用时,细胞迁移较空白对照组明显增强;MTT实验结果表明：单纯加入血管内皮生长因子或促血管生成素1,均不能起到有效促进内皮细胞增殖的作用;联合应用血管内皮生长因子及促血管生成素1可有效促进增殖。结果可见当血管内皮生长因子与促血管生成素1联合应用时,才能有效促内皮细胞迁移与增殖,发挥促血管生成作用。     

重组人pEGFP—heNOS质粒转染人内皮祖细胞及其条件优化

目的用脂质体介导重组人pEGFP—heNOS质粒转染人内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）,并对其转染条件优化以获得较高转染效率。方法脂质体介导重组人pEGFP—heNOS质粒转染人骨髓来源的内皮祖细胞,改变质粒及脂质体剂量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率;转染48h后逆转录聚合酶链反应（RT～PCR）和Westernblot方法检测heNOS基因在内皮祖细胞中的表达。结果重组人pEGFP—heNOS质粒体外成功转染入人内皮祖细胞中,质粒：脂质体为1：1时转染效率最高。结论成功地将重组人pEGFP—heNOS质粒体外转染入内皮祖细胞中,通过优化转染条件提高了转染效率,为下一步基因治疗提供了试验基础。     

siRNA沉默FOXO3a对三氧化二砷抑制内皮细胞增殖的影响

背景：课题组前期已证实As2O3可以促进乳腺癌细胞中FOXO3a因子的表达,并抑制肿瘤细胞中血管内皮生长因子的表达,但As2O3对血管内皮细胞增殖的影响,以及对血管内皮细胞中FOXO3a、血管内皮生长因子的影响尚未证实。 目的：观察siRNA沉默FOXO3a对As2O3抑制人脐静脉内皮细胞增殖及血管生成的影响。 方法：实验分为4组：①As2O3组：待人脐静脉内皮细胞贴壁,在含4 μmol/L As2O3的RPMI-1640培养基中培养。②control siRNA组：转染无关序列control siRNA后,细胞在含4 μmol/L As2O3的RPMI-1640培养基中培养。③FOXO3a siRNA组：转染FOXO3a siRNA后,细胞在含4 μmol/L As2O3的 RPMI-1640培养基中培养。④对照组：与实验药物等体积PBS作为对照,细胞在完全培养基条件下培养。应用CCK-8方法检测细胞增殖情况,采用免疫细胞化学方法观察人脐静脉内皮细胞中FOXO3a、血管内皮生长因子蛋白的表达情况。 结果与结论：与对照组相比,FOXO3a siRNA明显减弱了As2O3抑制人脐静脉内皮细胞增殖的作用,As2O3促进人脐静脉内皮细胞中FOXO3a蛋白的表达并抑制血管内皮生长因子蛋白的表达,FOXO3a siRNA处理后明显抑制FOXO3a蛋白表达且增加血管内皮生长因子蛋白表达。结果提示FOXO3a可能成为As2O3抑制肿瘤细胞增殖及血管生成治疗的重要靶点。     

可溶性血管内皮生长因子受体1真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

本研究旨在构建可溶性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体1(soluble fmslike tyosine kinase-1,sFlt-1)的真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,并观察sFlt-1对血管内皮细胞增殖的影响。提取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)总RNA,扩增Flt-1基因胞外1-3结构域,构建真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,测序鉴定基因序列。将重组质粒转染Lewis肺癌细胞,采用RT-PCR和SDS-PAGE检测sFlt-1在基因及蛋白水平的表达情况。MTT法检测sFlt-1对VEGF诱导的HUVECs生长的影响。结果显示:①插入片段序列正确;②sFlt-1在基因水平成功表达且转染后的Lewis肺癌细胞能分泌表达sFlt-1;③含sFlt-1的细胞上清液可明显抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。本研究成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,sFlt-1,在基因和蛋白水平均获得有效表达,且表达的蛋白可明显抑制由VEGF诱导...     

pIRES2-BDNF-VEGF165真核表达载体的构建与鉴定

背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因,然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建为pIRES2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染 HEK293细胞,利用RT-PCR与 Western-blot 方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES- VEGF165基因片段,经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示,此载体转染后,HEK293 细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

毛冬青甲素对血小板和血管内皮细胞功能的影响

毛冬青甲素对ADP及AA活化血小板功能的二条途径有抑制作用。本文证明毛冬青甲素对活化血小板的第三条途径TMVA也有抑制作用。提示毛冬青甲素为一广谱抗血小板药,并可抑制丙二醛的生成,但不具有刺激人工培养人脐静脉内皮细胞生成前列环素的能力。     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR 与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

休克淋巴液对大鼠内皮细胞VEGF表达的影响

目的观察休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)、肠系膜微淋巴管内皮细胞(MMLEC)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型,引流休克时肠系膜淋巴液或收集门静脉血,同时收集正常淋巴液及门静脉血作为对照。以4%终浓度的处理因素与第3代PMVEC及MMLEC共同孵育6h,RT-PCR测定VEGF mRNA表达。结果不同处理因素与PMVEC及MMLEC孵育6h后,休克淋巴液组两种内皮细胞的VEGF mRNA表达均显著低于休克血浆组、正常淋巴液组、正常血浆组、胎牛血清(FBS)组、DMEM组;休克血浆组显著低于正常淋巴液组、正常血浆组、FBS组和DMEM组;其它组间无统计学差异。结论休克淋巴液可抑制内皮细胞的VEGF mRNA表达,且作用强于休克血浆。     

脱氢表雄酮对人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L表达的影响

目的:探讨脱氢表雄酮(DHEA)对干扰素-γ(I NF-γ)刺激下的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CD40/CD40L表达的影响。方法:原代培养人脐静脉内皮细胞,给予I NF-γ刺激和不同浓度DHEA干预。采用流式细胞术检测CD40/CD40L在细胞表面的表达,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD40/CD40L mRNA的表达。结果:I NF-γ刺激HUVECs表达CD40/CD40L,DHEA下调I NF-γ诱导的HUVECs表面CD40/CD40L的表达,同时对I NF-γ刺激下的CD40/CD40L mRNA的表达有抑制作用,并且呈剂量依赖性。结论:DHEA能减轻I NF-γ刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

骨髓基质细胞和内皮细胞联合种植构建组织工程化骨的初步研究

为阐明骨髓基质细胞和内皮细胞联合种植在生物复合材料上构建组织工程化骨 ,在促进成骨过程、加速局部血管生成中的作用 ,将大鼠骨髓基质细胞和人脐静脉内皮细胞联合种植在左旋聚乳酸 /β-磷酸三钙 (PL L A/β- TCP)多孔复合支架材料上作为实验组 ,仅种植骨髓基质细胞在该材料上作为对照组。将此种有活细胞的复合材料种植于裸鼠大腿后侧肌袋内 ,分别于种植后 1、4、8、12、16周处死动物 ,取出复合材料 ,行组织学检测 ,并用图像处理技术计算实验组和对照组的成骨面积百分比和材料面积百分比 ,观察其变化规律。结果显示 :实验组成骨面积百分比增加比对照组明显加快 ,而材料面积百分比减少比对照组迅速 ;其内毛细血管网形成情况也要明显优于对照组。表明骨髓基质细胞和内皮细胞联合种植于支架材料构建组织工程化骨不仅有利于成骨作用 ,促进新生骨区内部血管网形成 ,还有利于复合材料的降解吸收 ,这在构造组织工程化骨过程中具有重要意义。